微生物检验流程与质量控制

* 基础知识的扎实程度、临场实践能力的高 低、自主学习能力的强弱直接影响工作质 量的好坏
* 个人能力在报告质量中有直接而明显的体 现
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人员能力的 培训、考核与权限的授予
* 在微生物室对后进人员的培训考核是一项 长期任务，对于人才梯队的形成和特殊能 力的传承有着重要意义
* 根据每个人员能力的层次分别授予对应等 级的权限对于控制微生物室整体质量，防 范错误的发生，提高报告质量有确定的意 义
104 cfu/ml
mg/ml 4
2
1
0.5 0.25 0.12
0
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微量肉汤稀释法
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微量肉汤稀释法 结果读取技巧
磺胺类药物容易出现弱生长，只要满足70%以上抑菌率即 可视为未生长
真菌药敏三唑类药物容易出现拖尾现象（即低浓度孔易出 现弱生长），判读时以对照孔为参照，＞80%的抑菌率即 可视为未生长
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特殊处理方法
当受测抑菌环与 旁边的融合时， 选择完整部分测 量
当受测抑菌环部 分变形时，选择 正常部分测量
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扩散法药敏影响因素
培养基
• 细菌纯度
pH值7.2-7.4
• 气体环境
营养程度（肠球菌能生长） 厚度 抗生素拮抗剂含量（用29212监
控）
– 普通细菌放CO2时由于碳 酸的影响，药物活性受 到影响，形成假敏感或 假耐药
培养时间：18小时
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透射光
− 葡萄球菌
利奈唑胺 苯唑西林 万古霉素
− 肠球菌
万古霉素
测量方法
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反射光
测量其他细菌与药 物时
22பைடு நூலகம்
a
变形杆菌 忽略环内的迁徙
生长
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测量肉眼可见的 明显抑菌区
忽略环边缘的微 弱生长
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环内生长现象
铜绿假单胞菌 耐药亚群
大肠药敏，被肠球菌污染
养基等）的室内质控 10
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质量控制中的重点
* 人员能力的培训、考核与权限的授予 * 流程中不同环节试验之间的相互印证 * 首代分离培养基质控措施 * 药敏试验室内质量控制
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人员能力的 培训、考核与权限的授予
* 在所有影响因素中，人的因素居于首位
* 临床微生物检验是一个智力因素占首要地 位的行业，是真正意义上的诊断学。在欧 美从属于临床病理的范畴
菌 M27-A2 酵母样真菌MIC法(2002) M44-A 真菌纸片扩散法(2004) M45-A 低频分离菌与苛养菌(2006)
* M100 updated yearly
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CLSI M100-S22 解释标准 覆盖的细菌类别
肠杆菌科 铜绿假单胞菌 不动杆菌属 洋葱伯克霍尔德菌 嗜麦芽窄食单胞菌 其他非肠道杆菌 葡萄球菌属 肠球菌属
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首代分离培养基质控措施
* 目前国内有超过10家商品成品培养基制造 商，由于生产工艺简单，技术壁垒较低， 有无研发实力的公司都来趟这趟浑水，导 致成品培养基市场非常混乱，质量良莠不 齐
* 首代分离培养基是制约微生物检验阳性率 的门户，分离到细菌是一切成功检验的前 提条件。其质量的好坏直接影响微生物检 验的整体质量。在“检验中”阶段，所有影响 因素中，该因素所占的比重最大
少见菌和苛养菌的特殊药敏
参考方法：M45-A
乏养菌与颗粒链菌——稀释法 嗜水气单胞菌复合群——稀释法与扩散法 弧菌属细菌（霍乱除外）——稀释法与扩
散法
芽孢杆菌属（炭疽除外）——稀释法 空肠/大肠弯曲菌——稀释法与扩散法 棒状杆菌——稀释法（可用的药物标准比
BSAC标准提供的多）
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猪红斑丹毒似菌——稀释法 HACEK组苛养性G-杆菌——稀释法 卡他莫拉菌——稀释法 产单核细胞李斯特菌——稀释法 巴斯德菌——稀释法 其他，如乳杆菌、片球菌、无色藻菌——稀释法
英国BSAC标准；
欧洲应用比较广泛的标准
欧洲EUCAST标准 …….. 42
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CLSI药敏解释标准
CLSI 药敏 (Clinical Laboratory standard institution) 指南
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CLSI 药敏文件
M100-S22 常见菌 (2012)** M11-A7 厌氧菌 (2007) M39-A3 积累抗菌谱(2009) M24-A 分枝杆菌, 奴卡菌, 以及其他需氧放线
钙镁离子含量、锌离子含量（用 27853氨基糖苷类和亚胺配能结 果监控）
– 苛养菌放普通环境生长 不良，导致假敏感
菌悬液
• 培养时间
浓度高抑菌环缩小 浓度低则扩大
– 粘液性铜绿需48小时
• 测量方法
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稀释法
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试验方法与条件
CLSI推荐培养基：
普通营养要求细菌使用补充阳离子MH肉汤
肉汤稀释后再加到微2孔9 中）
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接种后应充分混匀，但不能有气泡产生
静置培养
培养温度；35℃
气体环境：所有细菌（包括苛养菌）均置 大气环境；厌氧菌置厌氧环境；微需氧菌 置微需氧环境；淋菌琼脂稀释法置CO2
培养时间：18小时 结果读取：
见后面的幻灯：
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常量稀释法
药敏试验的参考方法： 将标准接种物加入含対倍 稀释抗生素的MH肉汤管中. 过夜培养. MIC 即是能抑 制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一管所标示 的浓度值.
* 狭义质量控制：对试剂和仪器的控制
* 广义质量控制：对所有影响试验结果可靠 性的因素进行的全面质量控制
* 试验人员技术能力的控制——操作的标准化与 试验结果判读的标准化
* 试剂的保存与正确使用 * 仪器的正确使用、定期维护与校准
* 鉴定试剂阴阳性结果的典型性与试剂的稳定性 考察
* 药敏试验（纸片、MIC板卡、E-test试条、MH培
肺链使用含2%冻融马血的MH肉汤
嗜血杆菌使用HTM肉汤
厌氧菌和微需氧菌使用布氏肉汤
淋病奈瑟菌推荐强化GC作琼脂稀释法
菌液浓度（5×104CFU/ml）：
初始菌液0.5 McF（约1.5×108CFU/ml）盐水稀释
200倍，加入0.1ml菌液到含有0.1ml 双倍浓缩的
MH肉汤的微孔板中（或预先用标准浓度的MH
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药敏试验质控
过程控制
结果控制
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药敏试验过程控制
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扩散法
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试验方法与条件
CLSI推荐培养基： 普通营养要求细菌使用水解酪蛋白琼脂（MHA ）平板
肺链使用含5%绵羊血的含血MHA 嗜血杆菌使用HTM培养基 淋球菌使用含1%生长因子（不含L-半胱氨酸）
补充剂的GC培养基 平皿大小：最小90mm，通常使用150mm平板 琼脂厚度4±1mm 菌液浓度0.5 McF（约1.5×108CFU/ml）
目标菌落 选取
首代培养 （菌落计数）
染色镜检
鉴定药敏
综合报告
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粪便培养标准化操作流程
样本接收
镜下筛选 （粪便常规）
压片法 制片
首代培养
选择性 增菌培养
染色镜检
目标菌落 选取
鉴定药敏
综合报告
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其他标本标准化操作流程
《实用临床微生物检验与图谱》 卫生部规范化操作流程图
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质量控制
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概念
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www.abbiodisk.com
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药敏试验结果控制
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a
药敏试验结果解释标准
CLSI标准；
➢ 全球性
➢ 每年更新
➢ 非强制性学术机构
FDA标准（全球标准）
➢ 建立在CLSI基础上
➢ 6~8年更新一次
➢ 官方机构，标准带有强制性
法国CASFM标准；
梅里埃产品习惯采用的CLSI以外的标准
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涂布方法：无菌棉签浸透菌液后稍微挤干 ，棉签与平板呈30°左右的倾角密集左右来 回涂布，完成一遍后旋转120°后再涂，如此 三次，最后绕边缘一次
纸片之间最佳间距30mm，不得低于25mm 培养温度；35℃；重叠时不超过3个碟子
气体环境：普通细菌大气环境；嗜血杆菌 、淋球菌、肺链置CO2环境
意义：保障药敏结果的可靠性——准确性和 精密度
• 培养时间
– 真菌需48小时 – 奴卡菌需5天
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E-test法
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Etest 试条
MIC 值标注于试 条的光面
毛面贴于MHA上
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Etest 操作程序
按照扩散法标准 操作涂布接种
贴上试条并培养 15-18小时
读取抑菌浓度并
按标准解释
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结果读取
肺炎链球菌 青霉素 MIC = 3 mg/ml
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Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardiae, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard
分枝杆菌, 奴卡菌, 以及 其他需氧放线菌药敏
参考方法：M24-A 结核分枝杆菌复合群——比例法 缓慢生长非结核分枝杆菌——稀释法 快速生长分枝杆菌——稀释法 奴卡菌等需氧放线菌——稀释法
• 流感嗜血杆菌与副 流感杆菌
• 淋病奈瑟菌 • 肺炎链球菌 • Β-溶血链球菌 • 草绿色链球菌 • 脑膜炎奈瑟菌 • 厌氧菌
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不同细菌适用的药敏方法
部分细菌同时具有扩散法标准和MIC标准，但具有扩散法标准 的药物相对较少
部分细菌（某些药物）只有MIC标准 其他非肠道细菌所有药物 葡萄球菌万古霉素、托达霉素 肠球菌托达霉素 肺链除苯唑西林以外的其他β内酰胺类 Β溶血链球菌除青霉素、氨苄青霉素、头孢吡肟、噻肟、曲 松外的其他β内酰胺类 草绿色链球菌除头孢吡肟、噻肟、曲松外的其他β内酰胺类 厌氧菌所有药物
样本接收
血培养仪 增菌
阳性培养 液涂片
推片法 制片
目标菌落 选取
首代培养
染色镜检
鉴定药敏
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综合报告
一级报告
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痰培养标准化操作流程
样本接收
肉眼筛选 分类
镜下筛选
痰液洗涤
首代培养 痰液接种 痰液消化
压片法制 片
目标菌落 选取
鉴定药敏
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综合报告
染色镜检
a
尿培养标准化操作流程
样本接收
离心
镜下筛选 沉渣涂片
微生物检验流程与质量控制
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主要内容
常见标本的检验流程
血培养（无菌体液培养） 痰培养（以及其他呼吸系统标本） 尿培养 粪便培养
质量控制
人员能力
试剂与仪器（包括仪器校准、各项鉴定试验、药敏试 验室内质控）
环节控制（全程质控） 首代分离培养基质量控制
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常见标本的检验流程
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血培养标准化操作流程
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流程中不同环节试验 之间的相互印证
* 建立全程质控的观点对于提高微生物检验 质量意义重大
* 通过不同环节试验结果之间的推衍和反证 可及时发现一些错误的存在，并及时进行 纠正可防止错误报告的发出
* 不同环节之间的推衍与反证可让我们发现 平时质控中难以发现的失控现象，便于我 们制订相应的规则堵住漏洞，对于工作的 持续改进有着重要的意义
淋菌只有扩散法和琼脂稀释法，无肉汤稀释法标准
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a
Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria；Approved guideline
生长缓慢微生物（形成肉眼可见生长＞1周） 不适合用MIC法
在肉汤中发育不良的微生物不适合用MIC
粘液性铜绿假单胞菌——只能用扩散法，48小时 观察结果
淋病奈瑟菌——CLSI无肉汤稀释法药敏指南
注意微弱生长导致的假敏感（结果需要修正 ）
例如铜绿对磺胺、四环素、头孢噻肟/曲松
鲍曼不动杆菌对氨曲南
肺克、阴沟、变形杆菌34 对呋喃妥因
a
稀释法药敏影响因素
培养基
pH值 7.2-7.4 营养程度 抗生素拮抗剂含量 钙镁离子含量（钙10-25
；镁10-12.5μg/ml）
菌悬液（5×104CFU/ml）
接种效应
浓度高MIC抬高 浓度低MIC压低
• 细菌纯度
• 气体环境
– 所有需氧细菌均放普通 大气环境。如果放CO2， 由于碳酸的影响，药物 活性受到影响，形成假 敏感或假耐药
大于三孔不同梯度浓度的抗生素测试中，出现的高浓度生 长，而低浓度不生长现象叫跳孔。造成跳孔的主要原因， 菌悬液乳化不充分，细菌分散不足，以及药敏卡某些孔被 污染
跳孔的解决方法：根据其他药理学特征类似的抗生素的敏 感性以及分析其他同类不同种抗生素的敏感性进行推断性 修正
修正低浓度——耐药
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肉汤稀释法注意事项
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真菌药敏
M27-A2用于酵母样真菌的稀释法药敏—— 只有氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶有解释 标准，其他药物的测试结果报告MIC
M44-A用于酵母样真菌的扩散法药敏——只 有氟康唑有解释标准
M38-P用于丝状真菌的稀释法药敏——只有 操作方法，报告MIC值，但无解释标准
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药敏试验质量控制要点