桑树TIR1基因的克隆及在组织器官和扦插生根过程的表达分析
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Corresponding author． Email： chengjialing@ 163． com
第5 期
唐
壮等： 桑树 TIＲ1 基因的克隆及在组织器官和扦插生根过程的表达分析
791
植百度文库根。不定根的发生反映了植物的再生能力， 也
是植物扦插繁育过程的重要环节
［1 ］
物非根 组 织 （ 如 茎、 叶等） 形 成 的 根 称 为 不 定 ， 插穗生根难与
duction of auxin signals． In this study，we cloned a TIＲ1 gene from basal cortex of cuttings of mulberry （ Morus multicaulis ） variety Yu 711 and denominated it as MaTIＲ1 （ GenBank accession No． KJ787017 ） ． Sequence analysis showed that OＲF of MaTIＲ1 is 1 758 bp long and encodes 585 amino acids． The deduced protein has a molecular weight of 65. 438 7 kD，a theoretical isoelectric point of 6. 31 ，contains FBox and LＲＲs functional domains，and no signal peptide PCＲ） showed that MaTIＲ1 gene exor transmembrane region was detected． Quantitative realtime PCＲ analysis （ qＲTpressed in various organs including fruit，female flower，leaf，bud ，stem and root． The highest expression level was in leaf，followed by root，while the lowest expression level was in female flower． It was considered that variation of MaTIＲ1 gene expression in various organs was associated with different biological functions of the organs． In the rooting process of both mulberry hardwood cuttings and greenwood
。 目前 、 棉
水稻 有关 TIＲ1 的研究多集中在拟南芥、 ［12 ］ 花 等草本植物。
［10 － 11 ］
桑树是蚕桑产业发展的物质基础， 也是一种重 要的生态经济型林木。 扦插是桑树育苗的重要方 法， 但桑树又属于扦插生根较难的植物
［13 ］
DNAMAN6. 0 软 件 进 行 分 析； 利 用 NCBI 网 站 上 BLASTp 程序进行蛋白质序列比对分析； 使用 ProtParam （ http： / / www． expasy． org / protparam / ） 在 线 分 析目的基因编码蛋白质的理化性质 ； 用 TMHMM（ http： / / www． cbs． dtu． dk / services / TMHMM / ） 预测分析 蛋白质的跨膜结构域； 利用 SignalP 4. 1 Server （ http： / / www． cbs． dtu． dk / services / SignalP / ） 预 测 蛋 白 heidel质的 信 号 肽； 用 SMAＲT （ http： / / smart． emblberg． de / ） 预测分析蛋白质的功能结构域； 在线 （ https： / / www． predictprotein． org / ） 预测蛋白质的二级 Model （ http： / / swissmod结构和 功 能 位 点； 用 Swissel． expasy． org / ） 同源建模预测 3D 结构； 利用 ClustalX1. 8 软件进行多序列比对分析， 比对结果用 ESPript 作图； 系统进化树用 MEGA6. 0 软件构建， 采用邻接
唐 壮
661101 ） 1
杜 伟
1， 3
李小玉
2
1
程嘉翎
1， 2
3
（ 1 江苏科技大学 ， 江苏镇江 212003 ；
中国农业科学院蚕业研究所， 江苏镇江 212018 ；
云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所， 云南蒙自
摘
要
植物的转运抑制应答因子 1（ TIＲ1） 作为生长素的受体， 在生长素信号的感知与转导过程中发挥重要作用。从鲁桑（ Mo-
收稿日期： 2014 － 05 － 16 接受日期： 2014 － 06 － 03
cuttings，the expression of MaTIＲ1 was obviously upregulated in adventitious root primordium formation stage and in adventitious root elongation stage，suggesting that this gene in involved in the formation of adventitious roots． Key words Morus L． ； Transport inhibitor response 1 ； Gene cloning ； Expression pattern； Tissue and organ； Cutting ； Adventitious root
3 DU Wei1，
LI XiaoYu1
2* CHENG JiaLing 1，
（ 1 Jiangsu University of Science and Technology， Zhenjiang Jiangsu 212003 ， China； 2 The Sericultural Ｒesearch Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhenjiang Jiangsu 212018 ，China；
［9 ］ ［8 ］
自中国农业科学院蚕业研究所国家种质资源 镇江桑树圃采集鲁桑 （ Morus multicaulis ） 品种育 711 的当年生绿枝与 1 年生硬枝， 作为扦插试验用穗 ［14 ］ 条。采用诱导桑树插穗基部皮层高效生根技术 ， 15 － 16］报道的方法分别进行桑树硬枝 按照文献［ 与绿枝的扦插试验。试验过程每 3 d 取插穗基部的 皮部为材料， 立即用液氮速冻， 于 － 85 ℃ 保存备用。 1. 2 桑树 TIＲ1 基因的克隆 1. 2. 1 成 ＲNA， 用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 ＲNA 的质量， 并 用紫外分光光度计测定浓度。 以提取的总 ＲNA 为 模板， 反转录合成 cDNA 第 1 链。 1. 2. 2 引物设计与 TIＲ1 基因的 PCＲ 扩增 根据 插穗基部皮层总 ＲNA 的提取及 cDNA 的合 取扦插 3 d 的插穗基部皮部材料 0. 1 g， 提取总
本实验室先前建立的桑树扦插生根转录组数据库 F （ 5'CATC中的 TIＲ1 基因 OＲF 设计上游引物 TIGGAGGGGTTTGA3' ） 和下游引物 TIＲ （ 5'GGAAGAGTTTCGGGAGAA3' ） ， 以 上 述 cDNA 为 模 板 进 行 PCＲ 扩增， 反应程序为： 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s， 53 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 共 30 个循环； 72 ℃ 7 min。 回收目的片断， 与 T 载体连接， 转化 E. coli DH5 α 感 受态细胞， 筛选阳性克隆送至上海生工生物工程技 术服务有限公司进行测序。 1. 3 桑树 TIＲ1 基因的生物信息学分析 桑树 TIＲ1 基 因 编 码 蛋 白 质 的 氨 基 酸 序 列 用
1
1. 1
材料与方法
材料
生根量少是影响林业生产中林木无性繁育速度和 ［2 ］ 质量的关键问题 。 不定根的形成是受诸多内源 和外源因素共同影响的复杂生物学过程 ， 其中生长 ［3 ］ 素起 着 重 要 作 用 。 吲 哚 乙 酸 （ indoleacetic acid， IAA） 是促进不定根发生的重要植物激素。 IAA 的 极性运输可以在组织间形成动态的生长素渐变梯 ［4 ］ 度， 进而影响植物的生长和发育 。 植物对生长素 信号的感知与转导是通过转运抑制应答因子 1 / Fbox 蛋 白 （ transport inhibitor resistant 1 / auxin signaling Fbox， TIＲ1 / AFB ） 、 生长素 / 吲哚乙酸蛋白 （ auxin / indole3acetic acid， Aux / IAA ） 、 生长素响应因子 （ auxin responsive factor， AＲF） 等生长素受体蛋白实 现的。其中生长素受体转运抑制应答因子 1 （ TIＲ1 ） 最早是在拟南芥耐生长素运输抑制剂实验中发现 ［5 ］ 的 ， 随后的研究结果显示 TIＲ1 并不参与生长素 的运输， 而是作为生长素的受体参与生长素信号的 ［6 － 7 ］ 。拟南芥 TIＲ1 蛋白含有 1 个 Fbox 结构 转导 域和多个富亮氨酸重复基序 LＲＲ 。 TIＲ1 通过 Fbox 结构域形成泛素化降解途径的 E3 连接酶复合 TIＲ1 （ Skp1CullinFbox protein ） ， 体 SCF 促 进 Aux / IAA 的泛素化降解， 释放出被 Aux / IAA 蛋白结合的 AＲF 蛋白。 释放 出 的 AＲF 可 形 成 有 活 性 的 AＲFAＲF 二聚体， 进一步调控相关基因的表达
Science of Sericulture
2014 ， 40 （ 5 ） ： 0790 － 0796 ISSN 0257 － 4799 ； CN 32 － 1115 / S Email： CYKE@ chinajournal． net． cn
蚕业科学
桑树 TIＲ1 基 因 的 克 隆 及 在 组 织 器 官 和 扦 插 生 根 过 程 的 表 达 分析
3
The Sericultural ＆ Apicultural Ｒesearch
Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Mengzi Yunnan 661101 ，China） Abstract Transport inhibitor response 1 （ TIＲ1 ） ，as an auxin receptor，plays an important role in response to and trans-
DOI:10.13441/j.cnki.cykx.2014.05.005
Cloning and Expression Analysis of Mulberry TIＲ1 Gene in Various Organs and in Ｒooting Process of Cuttings
TANG Zhuang 1
rus multicaulis） 品种育 711 插穗基部的皮部克隆到一个桑树 TIＲ1 基因， 命名为 MaTIＲ1 （ GenBank 登录号： KJ787017 ） 。该基因 OＲF 全长1 758 bp， Box 结构域和 LＲＲ 结构域， 编码 585 个氨基酸， 蛋白质分子质量 65. 438 7 kD， 等电点 6. 31， 含有 F不含信号肽 和跨膜区。荧光实时定量 PCＲ 检测 MaTIＲ1 在桑树的果、 雌花、 叶、 芽、 茎、 根中均有表达， 在叶中的表达量最高， 在根部的表达量 在雌花的表达量最低， 推测该基因在各组织器官的表达水平可能与各组织器官行使的生物学功能有关； 在桑树硬枝与绿枝 次之， MaTIＲ1 在不定根原基形成期与不定根伸长期的表达量明显上调， 的扦插生根过程中， 提示该基因可能参与了不定根的形成。 关键词 桑树； 转运抑制应答因子 1 ； 基因克隆； 表达特征； 组织器官； 扦插； 不定根 S888. 2 ； Q943. 2 文献标识码 A 文章编号 0257 － 4799 （ 2014 ） 05 － 0790 － 07 中图分类号
22 ） 。 资助项目： 现代农业产业技术体系建设专项 （ No． CAＲS第一作者信息： 唐壮（ 1990 － ） ， 男， 硕士研究生。 Email： tangzhuang1127@ 163． com 通信作者信息： 程嘉翎， 研究员， 硕士生导师。 Tel： 051185616573 ， Email： chengjialing@ 163． com
Corresponding author． Email： chengjialing@ 163． com
第5 期
唐
壮等： 桑树 TIＲ1 基因的克隆及在组织器官和扦插生根过程的表达分析
791
植百度文库根。不定根的发生反映了植物的再生能力， 也
是植物扦插繁育过程的重要环节
［1 ］
物非根 组 织 （ 如 茎、 叶等） 形 成 的 根 称 为 不 定 ， 插穗生根难与
duction of auxin signals． In this study，we cloned a TIＲ1 gene from basal cortex of cuttings of mulberry （ Morus multicaulis ） variety Yu 711 and denominated it as MaTIＲ1 （ GenBank accession No． KJ787017 ） ． Sequence analysis showed that OＲF of MaTIＲ1 is 1 758 bp long and encodes 585 amino acids． The deduced protein has a molecular weight of 65. 438 7 kD，a theoretical isoelectric point of 6. 31 ，contains FBox and LＲＲs functional domains，and no signal peptide PCＲ） showed that MaTIＲ1 gene exor transmembrane region was detected． Quantitative realtime PCＲ analysis （ qＲTpressed in various organs including fruit，female flower，leaf，bud ，stem and root． The highest expression level was in leaf，followed by root，while the lowest expression level was in female flower． It was considered that variation of MaTIＲ1 gene expression in various organs was associated with different biological functions of the organs． In the rooting process of both mulberry hardwood cuttings and greenwood
。 目前 、 棉
水稻 有关 TIＲ1 的研究多集中在拟南芥、 ［12 ］ 花 等草本植物。
［10 － 11 ］
桑树是蚕桑产业发展的物质基础， 也是一种重 要的生态经济型林木。 扦插是桑树育苗的重要方 法， 但桑树又属于扦插生根较难的植物
［13 ］
DNAMAN6. 0 软 件 进 行 分 析； 利 用 NCBI 网 站 上 BLASTp 程序进行蛋白质序列比对分析； 使用 ProtParam （ http： / / www． expasy． org / protparam / ） 在 线 分 析目的基因编码蛋白质的理化性质 ； 用 TMHMM（ http： / / www． cbs． dtu． dk / services / TMHMM / ） 预测分析 蛋白质的跨膜结构域； 利用 SignalP 4. 1 Server （ http： / / www． cbs． dtu． dk / services / SignalP / ） 预 测 蛋 白 heidel质的 信 号 肽； 用 SMAＲT （ http： / / smart． emblberg． de / ） 预测分析蛋白质的功能结构域； 在线 （ https： / / www． predictprotein． org / ） 预测蛋白质的二级 Model （ http： / / swissmod结构和 功 能 位 点； 用 Swissel． expasy． org / ） 同源建模预测 3D 结构； 利用 ClustalX1. 8 软件进行多序列比对分析， 比对结果用 ESPript 作图； 系统进化树用 MEGA6. 0 软件构建， 采用邻接
唐 壮
661101 ） 1
杜 伟
1， 3
李小玉
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程嘉翎
1， 2
3
（ 1 江苏科技大学 ， 江苏镇江 212003 ；
中国农业科学院蚕业研究所， 江苏镇江 212018 ；
云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所， 云南蒙自
摘
要
植物的转运抑制应答因子 1（ TIＲ1） 作为生长素的受体， 在生长素信号的感知与转导过程中发挥重要作用。从鲁桑（ Mo-
收稿日期： 2014 － 05 － 16 接受日期： 2014 － 06 － 03
cuttings，the expression of MaTIＲ1 was obviously upregulated in adventitious root primordium formation stage and in adventitious root elongation stage，suggesting that this gene in involved in the formation of adventitious roots． Key words Morus L． ； Transport inhibitor response 1 ； Gene cloning ； Expression pattern； Tissue and organ； Cutting ； Adventitious root
3 DU Wei1，
LI XiaoYu1
2* CHENG JiaLing 1，
（ 1 Jiangsu University of Science and Technology， Zhenjiang Jiangsu 212003 ， China； 2 The Sericultural Ｒesearch Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhenjiang Jiangsu 212018 ，China；
［9 ］ ［8 ］
自中国农业科学院蚕业研究所国家种质资源 镇江桑树圃采集鲁桑 （ Morus multicaulis ） 品种育 711 的当年生绿枝与 1 年生硬枝， 作为扦插试验用穗 ［14 ］ 条。采用诱导桑树插穗基部皮层高效生根技术 ， 15 － 16］报道的方法分别进行桑树硬枝 按照文献［ 与绿枝的扦插试验。试验过程每 3 d 取插穗基部的 皮部为材料， 立即用液氮速冻， 于 － 85 ℃ 保存备用。 1. 2 桑树 TIＲ1 基因的克隆 1. 2. 1 成 ＲNA， 用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 ＲNA 的质量， 并 用紫外分光光度计测定浓度。 以提取的总 ＲNA 为 模板， 反转录合成 cDNA 第 1 链。 1. 2. 2 引物设计与 TIＲ1 基因的 PCＲ 扩增 根据 插穗基部皮层总 ＲNA 的提取及 cDNA 的合 取扦插 3 d 的插穗基部皮部材料 0. 1 g， 提取总
本实验室先前建立的桑树扦插生根转录组数据库 F （ 5'CATC中的 TIＲ1 基因 OＲF 设计上游引物 TIGGAGGGGTTTGA3' ） 和下游引物 TIＲ （ 5'GGAAGAGTTTCGGGAGAA3' ） ， 以 上 述 cDNA 为 模 板 进 行 PCＲ 扩增， 反应程序为： 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s， 53 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 共 30 个循环； 72 ℃ 7 min。 回收目的片断， 与 T 载体连接， 转化 E. coli DH5 α 感 受态细胞， 筛选阳性克隆送至上海生工生物工程技 术服务有限公司进行测序。 1. 3 桑树 TIＲ1 基因的生物信息学分析 桑树 TIＲ1 基 因 编 码 蛋 白 质 的 氨 基 酸 序 列 用
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1. 1
材料与方法
材料
生根量少是影响林业生产中林木无性繁育速度和 ［2 ］ 质量的关键问题 。 不定根的形成是受诸多内源 和外源因素共同影响的复杂生物学过程 ， 其中生长 ［3 ］ 素起 着 重 要 作 用 。 吲 哚 乙 酸 （ indoleacetic acid， IAA） 是促进不定根发生的重要植物激素。 IAA 的 极性运输可以在组织间形成动态的生长素渐变梯 ［4 ］ 度， 进而影响植物的生长和发育 。 植物对生长素 信号的感知与转导是通过转运抑制应答因子 1 / Fbox 蛋 白 （ transport inhibitor resistant 1 / auxin signaling Fbox， TIＲ1 / AFB ） 、 生长素 / 吲哚乙酸蛋白 （ auxin / indole3acetic acid， Aux / IAA ） 、 生长素响应因子 （ auxin responsive factor， AＲF） 等生长素受体蛋白实 现的。其中生长素受体转运抑制应答因子 1 （ TIＲ1 ） 最早是在拟南芥耐生长素运输抑制剂实验中发现 ［5 ］ 的 ， 随后的研究结果显示 TIＲ1 并不参与生长素 的运输， 而是作为生长素的受体参与生长素信号的 ［6 － 7 ］ 。拟南芥 TIＲ1 蛋白含有 1 个 Fbox 结构 转导 域和多个富亮氨酸重复基序 LＲＲ 。 TIＲ1 通过 Fbox 结构域形成泛素化降解途径的 E3 连接酶复合 TIＲ1 （ Skp1CullinFbox protein ） ， 体 SCF 促 进 Aux / IAA 的泛素化降解， 释放出被 Aux / IAA 蛋白结合的 AＲF 蛋白。 释放 出 的 AＲF 可 形 成 有 活 性 的 AＲFAＲF 二聚体， 进一步调控相关基因的表达
Science of Sericulture
2014 ， 40 （ 5 ） ： 0790 － 0796 ISSN 0257 － 4799 ； CN 32 － 1115 / S Email： CYKE@ chinajournal． net． cn
蚕业科学
桑树 TIＲ1 基 因 的 克 隆 及 在 组 织 器 官 和 扦 插 生 根 过 程 的 表 达 分析
3
The Sericultural ＆ Apicultural Ｒesearch
Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Mengzi Yunnan 661101 ，China） Abstract Transport inhibitor response 1 （ TIＲ1 ） ，as an auxin receptor，plays an important role in response to and trans-
DOI:10.13441/j.cnki.cykx.2014.05.005
Cloning and Expression Analysis of Mulberry TIＲ1 Gene in Various Organs and in Ｒooting Process of Cuttings
TANG Zhuang 1
rus multicaulis） 品种育 711 插穗基部的皮部克隆到一个桑树 TIＲ1 基因， 命名为 MaTIＲ1 （ GenBank 登录号： KJ787017 ） 。该基因 OＲF 全长1 758 bp， Box 结构域和 LＲＲ 结构域， 编码 585 个氨基酸， 蛋白质分子质量 65. 438 7 kD， 等电点 6. 31， 含有 F不含信号肽 和跨膜区。荧光实时定量 PCＲ 检测 MaTIＲ1 在桑树的果、 雌花、 叶、 芽、 茎、 根中均有表达， 在叶中的表达量最高， 在根部的表达量 在雌花的表达量最低， 推测该基因在各组织器官的表达水平可能与各组织器官行使的生物学功能有关； 在桑树硬枝与绿枝 次之， MaTIＲ1 在不定根原基形成期与不定根伸长期的表达量明显上调， 的扦插生根过程中， 提示该基因可能参与了不定根的形成。 关键词 桑树； 转运抑制应答因子 1 ； 基因克隆； 表达特征； 组织器官； 扦插； 不定根 S888. 2 ； Q943. 2 文献标识码 A 文章编号 0257 － 4799 （ 2014 ） 05 － 0790 － 07 中图分类号
22 ） 。 资助项目： 现代农业产业技术体系建设专项 （ No． CAＲS第一作者信息： 唐壮（ 1990 － ） ， 男， 硕士研究生。 Email： tangzhuang1127@ 163． com 通信作者信息： 程嘉翎， 研究员， 硕士生导师。 Tel： 051185616573 ， Email： chengjialing@ 163． com