Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
westernblot法原理
westernblot法原理
westernblot原理：蛋白质的电泳分离。
是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。
（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。
然后4℃，13,g离心15min。
取上清液作为样品。
（二）电泳：制取电泳凝胶，展开sds-page。
（三）转移：（半干式转移）
1、电泳完结后将胶条割至最合适大小，用转膜缓冲液均衡，5min×3次。
2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和nc膜，浸入转膜缓冲液中10min。
3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、nc膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序摆不好，滤纸、凝胶、nc膜准确对齐，每一步除去气泡，另一头g重物，将碳板上多余的液体化成。
拨打电源,恒流1ma/cm2，迁移1.5hr。
迁移完结后，断裂电源将膜抽出,生口待测膜条搞免疫系统印迹。
WesternBlot操作流程
WesternBlot操作流程Western Blot操作流程本⼈将⾃⼰做WB实验时的具体操作流程，做了详细的记录并整理。
因为每个实验室的条件不⼀样，所以本流程仅供参考，具体适合⾃⼰的实验操作需要⼤家摸索。
由于知识量有限，有些描述⽤词并不专业，请⼤家谅解。
⼀、流程图制胶→→电泳跑胶(1.5-2.5h)→→转膜（3h）→→（可使⽤⽴春红检测是否蛋⽩是否成功转移）TBST清洗（10min）→→封闭（2h）→→TBST清洗（10min）→→附Ⅰ抗（内参：⼩⿏抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜）→→TBST 清洗三次（10min/次）→→附Ⅱ抗（内参：⼭⽺抗⼩⿏，轻摇1.5h）→→TBST清洗三次（10min/次）→→显影⼆、物料及配制1、电泳液：⼀包电泳粉+1000ml双蒸⽔（可回收使⽤）2、10%过硫酸铵：1g过硫酸铵+10ml双蒸⽔3、转膜液：⼀包转膜粉+800ml双蒸⽔+200ml甲醇（可回收使⽤）4、TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml双蒸⽔+1ml吐温20。
（⽆需回收）5、封闭液：购买6、Ⅰ抗（内参）：将⼩⿏抗β-Actin：Ⅰ稀释液按1:500稀释待⽤，4度保存。
Ⅰ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将smad2：Ⅰ稀释液按1:1000稀释待⽤，4度保存。
7、Ⅱ抗（内参）：将⼭⽺抗⼩⿏：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释代⽤，4度保存。
Ⅱ抗（⽬的蛋⽩58kDa）：将⼭⽺抗兔：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释待⽤，4度保存。
7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使⽤8、定影液：按说明书配制，可长期回收使⽤9、发光液：超敏发光液A液：B液=1:1三、步骤（⼀）制胶1、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液的配制2、Tris-⽢氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所⽤溶液3、1）将规格1.0mm或其它规格的玻璃板固定好。
2）依次将所需试剂加⼊烧杯中，加⼊TEMED之后，混匀，⽤1000ml的移液枪沿玻璃板缝左右两边的⾓交替加⼊分离胶溶液，也可从左到右连续加⼊（⽬的：两种⽅法都可以使液⾯快速达到⽔平状态）。
Western Blot 操作流程
Western 操作流程1.SDS-PAGE电泳，事先调整好蛋白质样品的浓度，保持一致。
2.转膜（电泳结束前20分钟开始准备，而垫片和滤纸至少1小时前浸泡于含SDS的转移缓冲液中）。
（1）. 剪适当大小的PVDF膜，正常大小：5.5cm*8cm。
?（2）. 甲醇10mL浸泡膜5min，然后按1：4体积比向浸泡膜的容器中加水40mL至甲醇终浓度为20％(慢加快摇) 计时2 MIN。
（3）. 将膜转入无SDS转移缓冲液中（至少浸泡15分钟），慢摇。
（4）. 同时将电泳好的胶转移至无SDS的转移缓冲液中，慢摇10min。
（5）. 按湿转芯，黑面-垫片-滤纸-胶-膜-滤纸-垫片-白面的顺序放好，并且每层都要用玻璃棒赶走气泡，装槽时要黑对黑，白对白，加入含SDS转移缓冲液。
（7）. 湿转100V 1h-1.5h，转移槽中放入冰盒，冰水混合物上进行或者磁力搅拌器搅拌4度层析柜进行。
3. 封闭。
转膜结束后，将膜与胶接触的面为正面朝上， TTBS 缓冲液中浸泡片刻或者直接转移至封闭液中（5%脱脂牛奶），封闭1-2h1.5H。
4.一抗孵育。
封闭结束后，将膜在TTBS缓冲液中洗2次，每次2分钟，将膜转移至一抗孵育盒（5% 牛奶+ 一抗）中，4°C过夜孵育或者室温孵育3h。
注意：4°C过夜孵育的一抗可收集起来放于4°C，一周之内应该没问题，但是在重复使用这些一抗时，还得再加入比原来比例低的一抗，例如，原来按1：5000加的一抗，那么这次可在回收的一抗中按1：10000加。
5. 膜在TTBS缓冲液洗3次，每次6min1.二抗孵育。
将膜转移至二抗孵育盒中（5%牛奶+二抗），1-2h1.5H。
7. TTBS洗膜三次，每次6min.8.ECL Plus检测液检测：（Western Blot 超敏发光液A和B按1：1比例混匀）注意：Western Blot 超敏发光液 4°C避光保存。
使用前需恢复至室温，所以要提前从冰箱中取出。
Western blot详细操作过程
Western BlotWestern Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC ）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF ）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE 凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。
实验器材和试剂：一． 蛋白提取试剂1.10% SDS 裂解液：称取10g SDS 粉末加入双蒸水至90mL ，充分溶解，定容至100ml 室温保存。
2.RIPA 裂解液1ml 裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.9848ml 裂解液0.5ml 裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)0.4924ml 裂解液 PMSF 必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合3．蛋白酶抑制剂：100mmol/L PMSF ：17.4mg PMSF 粉末溶于1ml 异丙醇(AR)，分装250ul 每管后－20℃保存。
使用终浓度为1 mmol/L 。
【PMSF ：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。
PMSF 剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF ，应立即用大量的水冲洗。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
(完整版)[原创] Western blot转膜整个过程
![(完整版)[原创] Western blot转膜整个过程](https://img.taocdn.com/s3/m/10f1108a31b765ce040814d6.png)
转膜(Trarsmembran)1 转膜的定义将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法.常用的电泳转移方法有湿转和半干转。
两者的原理完全相同,只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同.前者操作容易，转移效率高;而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少.2 转移膜的选择杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。
应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Western blot的膜主要有两种:硝酸纤维素膜（NC) 和PVDF膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。
因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
通常用0.45 μm和0。
2 μm两种规格的NC膜。
大于20 kD的蛋白可用0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白就要用0。
2 μm的膜了,如用0.45 μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。
PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。
但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素(Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride, PVDF)膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。
尼龙膜和NC膜的特点相似，主要用于核酸杂交。
硝酸纤维素(nitrocellulose, NC）膜:NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化,对蛋白质的活性影响小;非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便.但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。
westernblot原理及过程
westernblot原理及过程
1、Western Blot的原理是：蛋白质是带电的，在聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质后，蛋白质被固定在凝胶中。
当凝胶被转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上时，蛋白质在膜上保留其电荷。
通过针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测蛋白质的位置。
这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析。
2、Western Blot的过程大致分为以下几步：
蛋白提取：从细胞或组织中提取总蛋白质混合物。
蛋白定量：确定凝胶中蛋白质的浓度。
SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物。
电转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到支持物（例如NC膜或PVDF 膜）上。
封闭：用含有去污剂和牛血清白蛋白的溶液处理膜，以封闭膜上的任何未结合位点。
抗原-抗体免疫反应：使用特异性抗体检测目标蛋白质的位置。
蛋白检测：使用化学发光剂检测膜上的目标蛋白质。
Western blot步骤实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳转膜及显色过程(全) (1)
Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤高征2014年6月第一部分细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程(碧云天试剂盒)一、原理在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。
分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。
细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。
约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。
抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。
本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。
最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。
本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。
二、注意事项1.需自备PMSF。
PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。
2.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
3.本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。
可以抽提的组织样品数通常不足100个。
4.使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。
但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
蛋白质分析技术(Western Blot、ELISA、免疫荧光与免疫组化技术)
记，成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕获多个亲和素，后者再与酶结合，加入
底物后，产生颜色反应。这一系统可以大大提高 ELISA 的灵敏度。
操作过程：
抗原包被→封闭→待检标本→生物素化抗体→洗涤→ 酶标记亲和素→洗涤→加底物显色和 检测 三 免疫荧光技术 利用某些荧光素，如 FITC、R-PE 等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针， 然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧 光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。 （一）细胞膜蛋白分子的检测 原理： 细胞膜表面的抗原或受体可特异地与相应的抗体或配体结合，将针对细胞表面抗原的抗体或 配体用不同的荧光素标记，根据不同荧光物质的最大激发和发射波长的不同，即可准确定量 每种荧光物质的强度，从而推出相应细胞表面抗原表达量 1 直接法：细胞＋荧光素标记的抗 CD 分子的抗体→4ºC 反应 30-60min→荧光显微镜观察 或流式细胞计分析。 2 间接法：细胞＋抗 CD 分子的抗体→4ºC 反应 30-60min 荧光素标记的二抗 4ºC 反应 30-60min→荧光显微镜观察或流式细胞计分析 悬浮细胞：用 PBS 洗二次后再做染色 贴壁细胞：先用胰酶消化成悬浮细胞再染色 2 Annexin V 检测技术 (检测细胞凋亡的一个常规指标) 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V 是一种分子量为 35~36KD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与 PS 高亲和力特异性结合。将 Annexin-V 进行 荧光素（FITC、PE）或 biotin 标记，以标记了的 Annexin-V 作为荧光探针，利用流式细胞 仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 样本处理和染色方法 1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用 PBS 洗 2 次，加 入 100ul Binding Buffer 和 FITC 标记的 Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光 30min，再 加入 PI（50ug/ml）5ul，避光反应 5min 后，加入 400ul Binding Buffer，立即用 FACScan 进行流式细胞术定量检测（一般不超过 1h）， 同时以不加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为 阴性对照。 2 贴壁培养的细胞染色：先用 0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。 3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。 （二）细胞内蛋白分子的检测 细胞内细胞因子的检测、凋亡相关蛋白 TFAR19 的检测等。 操作过程： （1）直接法： 细胞→3％多聚甲醛固定和 渗透化→封闭→荧光素标记的抗体→ 洗涤→荧光显微镜观察或 流式细胞计分析 （2）间接法： 细胞→3％多聚甲醛固定和渗透化→封闭→针对蛋白的特异抗体→洗涤→荧光素标记的二抗 →洗涤 → 荧光显微镜观察或流式细胞计分析 凋亡相关蛋白 TFAR19 蛋白的表达和细胞定位分析 TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因， 前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的 TFAR19 单 克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中 TFAR19 蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期
不可忽视的转膜和封闭WesternBlot专题(经验篇).
不可忽视的转膜和封闭:WesternBlot专题(经验篇)生物通技术专题：既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
Western印迹要想做的好，当然每个步骤都不能马虎，看看这张图，从电泳，转膜，封闭，一抗，二抗到最后的检测，就像“发现号”升空的120万个步骤那样一个也不能少。
如果忽视了其中的一步，结果做不出来，也是令人非常头痛的。
“工欲善其事，必先利其器”，要想有好的实验结果，好仪器是相当重要的，因此让我们先来看看什么样的仪器能让我们无后顾之忧，顺利痛快的一步到位。
Western 印迹的仪器主要就是电泳系统和电转移系统了，最好的品牌当然是Bio-Rad和Amersham（GE Healthcare）的Hoefer系列了，现在国内出品的物美价廉的电泳系列产品，也是不错的选择，几乎每个实验室都需要至少一套Mini Cell吧？如果还没有你该怎么挑选呢。
一、Bio-Rad经典Mini系列Bio-Rad Laboratories由David Schwartz 先生和妻子化学家Alice Schwartz于1957 年创建，总部位于加州Hercules，下设三大部门——生命科学部，临床诊断部和工业材料部，其中生命科学部成功跻身世界排名前五名。
在2004年，Bio-Rad还低价收购了因侵犯知识产权限于困境的MJ Research，使得伯乐在PCR领域的市场份额骤然扩大。
Bio-Rad生命科学部产品包括蛋白组研究产品、层析仪与填料、蛋白质和核酸电泳产品等，不过最为普通实验室熟悉的莫过于蛋白电泳Mini系列和层析仪。
只要是提到SDS-PAGE，Bio-Rad绝对是每个实验室首先考虑的品牌，经典就是经典呀。
Mini-PROTEAN3电泳系统与MiniTrans-Blot转移系统这一套Mini系列可谓是Bio-Rad最多人熟悉和称道的产品了。
自上个世纪50年代Raymond利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛性质来延缓蛋白质的迁移率从而达到分离蛋白的目的以来，经过这么多年来的发展，SDS-PAGE电泳技术已经基本成熟了。
Western blotting操作流程
Western Blotting （His-tag ）一、SDS-PAGE 电泳Sample 加入5×SDS Loading ，99℃、5分钟热处理，SDS －PAGE 电泳。
使用 Marker ：M1：Precidion Plus ProteinTM Dual Color Standards 5μl （Bio_Rad Catalog 161-0374） M2：Perfect ProteinTM Makers 10-225KDa 5μl （Novagen Catalog 69079）二、转膜（Blotting ）1、裁剪SDS －PAGE 胶，使所有样品、Marker 均包含在内，量取裁剪后胶的 长×宽，并裁剪相同尺寸的转膜滤纸12张，PVDF 膜1张；2、将PVDF 膜用甲醇浸泡10秒；3、将胶、转膜滤纸、PVDF 膜分别浸泡在如下图所示的相应转膜缓冲液中3~5分钟；4、依次按照下图所示的顺序在转膜仪的下表面叠放胶、转膜滤纸、PVDF 膜，用干净面巾纸拭干滤纸周围多余的液体，将转磨仪上表面安装好，轻轻下压上盖，使其与滤纸充分接触；5、按照胶尺寸1cm 2= 1mA 设定电流， 转膜120 min 。
三、封闭（Blockin ）1、配制Blockin 溶液，一般40ml 较合适（Blockin ：10ml 、一抗：14ml 、二抗：14ml ）；2、确认转移转膜后PVDF 膜上Marker-M1清晰，此时转膜成功；3、将转印后的PVDF 膜装入干净的水煮袋中，加入10ml 1.5%BSA/TBST ，尽量将气泡排干净，封口，用铝箔纸将水煮袋覆盖，RT 、摇动1hr 或4℃、O/N 封闭。
四、一抗1、取出封闭后的PVDF 膜，转入新的水煮袋中；A 液（负 极）（正极）C液B液胶PVDF膜2、加入14ml 1.5%BSA/TBST，按照1000：1的比例加入14μl一抗——Penta-HisAntibody, BSA free(QIAGEN Code.34660)，尽量将气泡排干净，封口，用铝箔纸将水煮袋覆盖，RT、摇动1hr进行反应。
western blot法的方法
western blot法的方法Western blot法，也称为蛋白质印迹技术，是一种分离和检测蛋白质的常用方法。
它可以用于检测蛋白质的存在、纯度和相对数量，以及探究蛋白质的结构和功能。
Western blot法的方法包括以下步骤：1. 蛋白质电泳分离：将待检测的蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）中进行电泳分离。
SDS-PAGE可以将蛋白质按照大小分离，同时使用SDS可以使蛋白质带有负电荷，使其移动速度更加均匀。
2. 转移：将蛋白质从凝胶转移到聚乙烯膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。
转移可以使用湿法或半湿法。
转移完成后，膜可以用Ponceau S染色来确认蛋白质转移的效果。
3. 阻断：用牛血清蛋白（BSA）或非脂类奶粉等阻断剂将膜表面的非特异性结合位点阻断。
4. 一抗：加入第一抗体（primary antibody）来和目标蛋白质结合。
第一抗体通常是针对目标蛋白质特异性的抗体。
5. 二抗：加入二抗（secondary antibody）来特异性地结合第一抗体。
二抗通常是被标记的抗体，例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体。
这种标记的抗体可以用化学发光（ECL）或荧光染料来检测。
6. 洗膜：用缓冲液反复洗膜，以去除未结合的抗体和其他非特异性的蛋白质。
7. 检测：用ECL或荧光染料检测目标蛋白质的存在。
ECL的原理是使标记的抗体和蛋白质结合后，加入亚甲基四胺（AMPPD）和过氧化氢（H2O2）溶液，使其发光，荧光染料则是在荧光检测器中直接检测。
需要注意的是，Western blot法并非完美的技术，其结果可能受到多种因素的影响，如抗体的质量、蛋白质样品的处理方法和电泳条件等。
因此，在进行Western blot实验时，需要细心、认真、标准化地操作，才能得到准确可靠的结果。
western blot实验内容
western blot实验内容Western Blot实验内容可以简单描述为一种生物化学分析技术，主要用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的存在和表达水平。
该实验通常包括以下步骤：1. 样品制备：首先，从细胞培养物或组织中提取蛋白质。
这可以通过细胞裂解和蛋白质提取试剂盒等方法来完成。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离。
在SDS-PAGE中，样品中的蛋白质按照大小被分离成不同的带状条带。
3. 转印：将分离的蛋白质通过电泳转印技术转移到聚丙烯酰胺薄膜（或称为膜）上。
膜可以是尼龙膜或聚乙烯膜。
4. 阻断：将膜置于含有蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白或脱脂奶粉）的缓冲液中，以阻止非特异性结合。
5. 一抗孵育：将膜与特异性抗体（一抗）一起在某种缓冲液中孵育。
这些一抗可以结合到目标蛋白质上。
6. 洗涤：通过多次洗涤，去除与一抗非特异性结合的蛋白质。
7. 二抗孵育：膜与与一抗的物种不同的次级抗体（二抗）一起在缓冲液中孵育。
二抗与一抗结合，形成复合物。
8. 洗涤：去除与二抗非特异性结合的蛋白质。
9. 显色：将特定酶底物添加到膜上，使目标蛋白质变色。
例如，常用的酶底物是辣根过氧化物酶（HRP）和4-氨基乙基硅烷（DAB），可以生成棕色的色斑。
10. 图像获取和分析：使用相应的设备（如基于膜的成像系统）捕捉膜的图像，并使用分析软件定量分析蛋白质的表达水平。
通过Western Blot实验，研究人员能够检测和定量不同细胞组分中蛋白质的存在和表达水平，从而深入了解生物系统的功能和调控机制。
western blot 大蛋白转膜条件
Western blot是一种分析蛋白质的实验技术，它通过分析蛋白质在凝胶中的迁移和捕获来检测特定蛋白质的存在和浓度。
在进行Western blot分析时，大蛋白的转膜条件是非常重要的，它直接影响着实验结果的准确性和可重复性。
1. 背景介绍西方博Lot实验作为一种重要的蛋白质分析技术，在生物科学研究中得到了广泛的应用。
Western blot通过分析蛋白质在凝胶中的迁移和捕获来检测特定蛋白质的存在和浓度。
在Western blot实验中，样品首先需要通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，然后转移到膜上，最后用抗体进行特定蛋白质的检测。
而大蛋白的转膜条件对Western blot 实验的结果起着关键的作用。
2. 大蛋白大蛋白通常指的是相对分子质量较大的蛋白质，其分子量一般在100kDa以上。
这类蛋白质在Western blot实验中转膜时往往会面临一些特殊的挑战，比如易于聚合、迁移速度较慢等问题，因此需要在转膜条件中予以特别考虑。
3. 转膜条件的重要性合适的转膜条件是确保大蛋白转膜效果的关键。
只有在适当的条件下，大蛋白才能迅速而均匀地从凝胶中转移到膜上，避免出现聚合和不均匀转膜等问题，从而保证Western blot结果的准确性。
4. 转膜条件的优化为了得到最佳的转膜效果，实验者需要在转膜条件上进行一系列的优化实验。
具体来说，可以对转膜膜的种类、孔隙大小、电泳缓冲液的成分和pH值、电场强度、转膜时间等因素进行系统的优化。
另外，选择合适的转膜设备和相关试剂也是提高转膜效率的关键。
5. 转膜膜的选择转膜膜是影响大蛋白转膜效果的重要因素之一。
常用的转膜膜有聚偏氟乙烯(PVDF)膜和硝化纤维素(NC)膜。
PVDF膜具有较好的耐性和机械规整性，适用于转膜大蛋白；而NC膜则对一些亲脂性较强的蛋白质有更好的结合效果。
实验者可以根据具体实验需要选择合适的转膜膜。
6. 电泳缓冲液的优化电泳缓冲液的成分和pH值对蛋白质的迁移速度和迁移效果有直接影响。
western blot 详解
原理：BCA(bicinchonininc acid二辛可宁酸)与二价铜 离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成 为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋 白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合 二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复 合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：
• 单体：丙烯酰胺（Acr）；
• 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；
• 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）； • 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）； • 产物：三维网状结构凝胶
聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)
的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来
灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
二 配制浓缩胶
准备物品： 移液枪 烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） Tips： 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶 液（PH=6.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度） ，SDS（常温）
整个操作在1X转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两 边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
③将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面， 夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一 边放一块冰来降温。一般用100V转移1.5h。实际上 应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间
④不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换 用转膜装置，最好再摸个条件；
完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化
western blot 实验原理
western blot 实验原理Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，通过将待检测样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特异性的抗体探针进行特定蛋白质的检测。
Western blot实验主要包括以下步骤：1. 样品制备：待检测样品通常经过细胞裂解或组织研磨，提取蛋白质。
蛋白质溶液经过蛋白浓度测定后，可进行下一步实验。
2. SDS-PAGE电泳：蛋白质溶液经过加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）的样品缓冲液，并在电泳条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）分离蛋白质。
在电泳过程中，SDS会使蛋白质变成带负电荷的线性结构，相同大小的蛋白质在凝胶中的迁移速度也相似。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜上。
转移通常通过将膜和凝胶在电流作用下接触，使蛋白质通过电场转移到膜上。
4. 阻断：将转移后的膜放入含有蛋白质的牛乳或鸡蛋清中，使未特异性结合位点被占据，阻断非特异性结合。
通过此步骤可以减少假阳性的可能性。
5. 抗体探针结合：将特异性抗体溶解在牛乳或鸡蛋清中，并将膜与抗体溶液接触。
抗体将与目标蛋白质特异性结合。
6. 信号检测：使用染色剂或酶标记的抗体来检测抗体-目标蛋白质结合的位置。
这些检测方法可以根据被标记物的类型而有所不同，如酶方法、放射性方法和荧光方法等。
7. 结果分析：使用成像系统（如X射线胶片或数码成像设备）捕捉膜上的信号，并在计算机软件中进行定量和定性分析。
Western blot技术可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等，广泛应用于生物医学研究、生物制药和临床诊断等领域。
western blot转膜原理
western blot转膜原理
Western blot转膜技术是一种基于免疫学原理的蛋白质检测技术。
其原理是先将待检样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出不同分子量的蛋白质，然后将这些蛋白质从凝胶上转
移到含有亚硝酸纸或聚氨酯膜的硬质支持膜上进行检测。
Western blot转膜的过程主要包括以下几个步骤：
1. 凝胶电泳：将蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，使样品中的蛋白质按
照分子量大小被分离出来。
2. 转膜：然后将凝胶与带有亚硝酸纸或聚氨酯膜的硬质支持膜接触，并施加足够的
压力，使蛋白质从凝胶上转移到支持膜上。
3. 阻滞：为了避免未特异性结合的抗体与膜上的非特异性蛋白质结合，需要给膜进
行一定的阻滞处理，通常使用牛血清蛋白或BSA（牛血清白蛋白）进行阻滞处理。
4. 一抗结合：将特异性抗体加入到膜上，使其与相应的蛋白质结合。
5. 二抗结合：加入标记有酶或荧光基团的第二抗体，使其与一抗结合。
6. 信号检测：通过溶液中特定底物的反应，使标记有酶或荧光基团的二抗在膜上呈
现出特定的荧光或酶促反应产生的色素。
7. 结果分析：根据荧光或色素的强度、位置或大小来分析样品中所含有的蛋白质种类、含量以及存在的修饰状态等。
总之，Western blot转膜技术是一种高灵敏度、高特异性的蛋白质检测方法。
其原理简单易懂，操作简便，广泛应用于分子生物学、免疫学、生物化学等领域中的蛋白质表达、诊断和研究。
实验记录-Western-Blot之跑胶与转膜
Western blot之跑胶与转膜（一）跑胶：1.蛋白样品准备：取一些之前做蛋白提取定量后已知浓度的蛋白样品，将所有蛋白样品调至等浓度（我们一般加入适量的RIPA），充分混合后，将样品与5X的loading buffer按4：1比例混合，并置于沸水中煮5min使蛋白变性，冷却至室温后放冰上备用（上样总体积一般不超过15ul，加样孔的最大限度可加20ul样品）；2.将胶连同玻璃板放置于电极架上，（梳子的一面朝里）固定好放入跑胶的缸子里，倒入一些running buffer；3.小心拔出梳子，避免破坏胶孔；4.上样：每块胶选1个孔加入5ul marker，加样一定要缓慢、稳，尽量选中间孔加入蛋白样本，尽量避免产生气泡，如果每个蛋白样本上样体积差异较大，可用1Xbuffer增加体积较少的孔，避免孔重差异导致相邻两蛋白条带的长短不一，上样完成后再加入一些1X的running buffer；5.电泳：连上电极，黑----黑，红----红，先开70v试跑，待样品进入分离胶后电压改为100v，（根据你蛋白样本分离情况调整时间），或当溴酚蓝接近或刚出胶底部时候可终止电泳；(二)转膜原理：转膜的原理是利用结合SDS的蛋白抗原带负电荷，在电场作用下从凝胶中转移至膜上。
方法是制作三明治夹板（海绵垫-滤纸-膜-凝胶-滤纸-海绵垫），放转膜槽中转膜，使蛋白质在电场力的作用下，从凝胶转移到膜上，膜可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
1、物品准备：转移缓冲液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g SDS 0.37g 甲醇200ml V=1L）、转膜用的夹板、两块海绵垫、4-6张滤纸、一张PVDF膜。
2、剪切适合大小的膜，放在甲醇溶液中浸泡，滤纸和海绵垫提前放入transfer buffer中浸泡；3、三明治夹板：先在托盘中倒入适量transfer buffer,然后依次放入转膜夹子---海绵垫---滤纸---PVDF膜---胶---滤纸---海绵垫，三明治夹板制作过程中一定要避免产生气泡，一定要充分排出气泡，使夹板夹紧，保证对凝胶有一定压力。
生物通WesternBlot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜
Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜PAGE倒胶的仪器我们在前面WesternBlot仪器之选已经介绍过了，除了顺手的工具能防止漏胶，PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。
容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，小气病发作的后果往往是得不偿失——胶凝不好多半是这里疏忽（或者混合不匀），因为相对配胶的其他组分，AP算最活跃分子——如果还有诸如漏加某组分或者配比错误或者Buffer搞错，那绝对是你自己找骂，不值得同情。
水要用去离子的纯水，MilliQ级更好。
Cambrex(原来的FMC)有商品化的丙烯酰胺母液，很贵，也很好——配出的胶对200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE胶，条带清晰漂亮，可惜一直没有搞清楚配方的奥秘；但是数十倍于丙烯酰胺粉剂的价格令人却步，不过，对接触丙烯酰胺粉尘严重过敏的人可以选择这个。
更加豪华的选择是已经凝好的预制胶，各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，当然更直接方便，更吸引人的是结果漂亮，分辨率高，特别是重复性好，条带真正是"razor sharp"啊！平时都能用这么豪华的东西心情当然超爽啊，实验紧凑又轻松，效率也更高啊！如果实验都能这么“好马配好鞍”，想必更容易出结果，也就更容易拿经费吧！什么时候我们的实验才能实现这种良性循环啊！Invitrogen旗下的Norvex和Cambrex（原来的FMC）PAGEr都是首选预制胶。
可是在“社会主义初级阶段”这种奢侈品平时流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了新的优惠活动，买3盒NuPAGE预制胶就送电泳仪或者电转移，面对这种诱惑，你难道就没有一点非份之想的冲动？上样电泳：上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜PAGE倒胶的仪器我们在前面WesternBlot仪器之选已经介绍过了，除了顺手的工具能防止漏胶，PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。
容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，小气病发作的后果往往是得不偿失——胶凝不好多半是这里疏忽（或者混合不匀），因为相对配胶的其他组分，AP算最活跃分子——如果还有诸如漏加某组分或者配比错误或者Buffer搞错，那绝对是你自己找骂，不值得同情。
水要用去离子的纯水，MilliQ级更好。
Cambrex(原来的FMC)有商品化的丙烯酰胺母液，很贵，也很好——配出的胶对200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE胶，条带清晰漂亮，可惜一直没有搞清楚配方的奥秘；但是数十倍于丙烯酰胺粉剂的价格令人却步，不过，对接触丙烯酰胺粉尘严重过敏的人可以选择这个。
更加豪华的选择是已经凝好的预制胶，各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，当然更直接方便，更吸引人的是结果漂亮，分辨率高，特别是重复性好，条带真正是"razor sharp"啊！平时都能用这么豪华的东西心情当然超爽啊，实验紧凑又轻松，效率也更高啊！如果实验都能这么“好马配好鞍”，想必更容易出结果，也就更容易拿经费吧！什么时候我们的实验才能实现这种良性循环啊！Invitrogen旗下的Norvex和Cambrex（原来的FMC）PAGEr都是首选预制胶。
可是在“社会主义初级阶段”这种奢侈品平时流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了新的优惠活动，买3盒NuPAGE预制胶就送电泳仪或者电转移，面对这种诱惑，你难道就没有一点非份之想的冲动？上样电泳：上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。
其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer （别小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。
当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。
电泳结果检查：如果要做Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。
考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。
银染操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng 蛋白。
可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot实验，很多人会选择省略掉这一步——同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般也可以说明问题。
如果想在转膜前看看电泳结果，你需要用SYPRO Tangerine——这种金色荧光蛋白染料灵敏度很高——检测4ng-8ng蛋白，接近银染，但使用非常简单，最重要的是由于不用酸碱或者有机溶剂固定，不干扰蛋白活性，特别适合Western转膜前的染色，或者非变性胶的活性蛋白的检测（比如染色后还需要在胶上进行活性检测等等）。
可惜SYPRO Tangerine价格挺贵的，500ul（5000x）要2000元，即使很节约的用只够大概100多次呢。
所以最经济实惠的方法是：丽春红S，直接染色转移膜，检测转膜效果，充分脱色后不干扰Western结果。
丽春红的检测灵敏度和考马斯亮蓝差不多。
转膜：经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从PAGE胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行Western Blot的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜的首要是选膜。
在转移膜上显色其实就像是画家在画布上作画一样，不光要有好的画笔和颜料，适合的画布也是相当之重要。
Western Blotting亦是如此，没有选择好合适的转移膜是无法做出漂亮的结果的。
因此，选择适合的转移膜，要让转移“膜”高一尺，帮衬而不是阻碍到我们的实验。
Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride），此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。
具体哪种膜适合于哪些实验呢？选择的根据主要有：a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜，就像国画要选择宣纸，油画要挑亚麻布或薄棉扣布一样。
首先来比较下这几种膜的特点1. 硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高。
NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；比如NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。
转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间，Schleicher & Schull公司的一个实验表明，转移到NC膜上的几种蛋白4度条件下保存5年依然保持免疫识别特性，依然可以得到清晰可信的Western Blot结果。
不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途——因为经不起多次“折磨”。
选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。
另外还要注意选择纯的NC膜——混有含醋酸纤维（CM）的NC膜结合力会有所降低。
另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）。
硝纤膜最为大家熟悉和认可的品牌就是 Schleicher & Schull；Millipore；PALL，另外罗氏、Invitrogen、GE（Amersham）、Santa Cruz等公司都有提供各式的硝纤膜（估计OEM的可能性比较大，不过有时挺奇怪的，OEM的有时比生产厂家卖的还便宜）。
Schleicher & Schull的名字拗口——那大概需要舌头在口腔里经过若干次不同弧度和不同速度的上下往返精确运动再配合适当的吐气才能读得准确优雅，不过作为第一个提供硝纤膜的厂家依然广为人知，其NC膜分为纯NC膜和强化NC膜两种：Protran nitrocellulose membrane和Optitran nitrocellulose membrane。
前者Protran一直是 Schleicher & Schull 自豪的产品，这种“100% Pure Nitrocellulose Membranes”。
一般而言，NC膜越纯，其蛋白结合能力就越高，所以要增加WB的灵敏度和分辨率，提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。
如果NC膜搀杂一些醋化纤维素——这在前面已经提到，会影响蛋白质结合。
而Protran在制作过程中去除了各种杂质，保证了其纯度，从而增加了蛋白结合能力。
除了这一点以外，Protran还有低背景、多孔径选择（0.45, 0.2, 0.1um）和保存时间长（实验证明膜上蛋白辨认时间可长达5年！真是“路遥知马力”的典范）等优点。
但是Protran由于是纯NC膜，比较脆，机械耐受力欠佳，需要小心操作，如果担心自己“粗手粗脚”，那么就可以考虑一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著称的BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。
Optitran是在一层超薄聚酯支撑膜的两面均匀铺上100%纯的硝酸纤维素，结果表面看起来和纯硝纤膜完全一样，保持了NC膜各种优点，只是内部多了一层中性支持物，大大增强这种强化NC膜的柔韧度和机械耐受力，不容易卷曲，方便操作，特别是重复标记和洗脱的实验。
不过有的使用过的人反应不如纯NC膜结合能力强。
NC膜除了一般的Discs、Rolls 和Sheets以外，像Invitrogen、Bio-Rad公司还有一种方便顾客使用的“sandwich”三明治形，十分有趣。
说它有趣是因为考虑周到，利于高通量操作，但其实也就是将滤纸和NC 膜纸套成滤纸—NC膜—滤纸的层迭形式，预先切割装订好，方便使用。
不过，卷膜肯定是最实惠的选择，只不过要自己动手裁剪——切记，必须带手套操作。
不知道为什么在国外硝纤膜会被当作危险品来运输还要加收运费，所以货期蛮长的，所以还是卷膜好，一卷用n 年——如果非要给这个n加个期限，那就是......至少可以用到等我毕业之后。
2. PVDF膜刚开始做WB的人也许会有这种疑问：为什么实验室的老师（或者师兄师姐们）在教我们做WB的时候，如果是用PVDF膜做，总是小心翼翼的剪，节省着用，甚至一些边边角角也舍不得丢掉呢？其实，这不仅是因为PVDF膜比较贵，还由于PVDF膜是做WB的“杀手锏”。
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜作为基质的转印膜由Millipore公司在1985年首先推出。
与硝酸纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性能（Pluskal,et al.,1986)。
市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜结合量是100-200μg/cm2（而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍！）。
在艾滋病毒（HIV）血清学检验中直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，PVDF膜具有更好的截留总HIV抗原能力并提高抗体检测糖基化被膜抗原的性能。
但是PVDF膜最大的优点不仅于此：更好的机械强度和化学耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；而且单个凝胶的泳道复本可用于多种目的，如考马斯亮蓝染色后切出条带并进行N-末端测序、蛋白消化/肽分离/内部测序和免疫检测（Kurien,et al.,2003)。
特别是需要做N端蛋白测序，在相当“严酷”的清洗条件下，当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。
所以PVDF也是要做蛋白测序的唯一选择。