WB技术服务报告模板

Western Blot 实验报

告

正式实验

客户姓名：

报告日期：

一、客户样品及抗体登记

1•样品种属来源：

2.样品标记：

组织细胞

3.抗体名称：抗体来源：

抗体Cat.及lot号：

二、材料和方法

1 .试剂及耗材

蛋白抽提试剂（改进型RIPA配方）BCA蛋白定量试剂盒

2mg/ml BSA标准品

5X还原样品缓冲液

10 X Tris-Glycine-SDS 电泳缓冲液考马斯亮蓝染色液

10 X TBST pH8.0

中分子量蛋白marker （7条带）

中分子量预染蛋白marker （7条带）湿转缓冲液

NC 膜，0.45um 孔径Millipore 丽春红染色液

BSA Amresco PMSF Amresco 蛋白酶抑制剂Roche

磷酸酶抑制剂Roche

脱脂奶粉伊利

ECL Millipore Stripping buffer （抗体洗脱液）

（抗体需要选择，选择后把多余的删除）

山羊抗兔IgG（H+L ），HRP Jackson

山羊抗小鼠IgG（H+L ），HRP Jackson

兔抗山羊IgG（H+L ），HRP Jackson

Beta-actin 兔多抗

Beta-actin 鼠单抗

Beta-tubulin 兔多抗

Beta-tubulin 鼠单抗

GAPDH 兔多抗

GAPDH 鼠单抗

2．实验仪器

Fresco 低温冷冻离心机Thermo

MultiSkan3 酶标仪Thermo

Mini P-4 电泳槽Cavoy

湿转电泳槽Cavoy

电泳仪Bio-Rad

半干槽Bio-Rad

水平脱色摇床其林贝尔

酸度计pH211 Hanna

电动组织匀浆器Fluka

三、实验方法及结果

3.1 蛋白抽提

3.1.1 组织蛋白抽提

预冷RIPA 蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂（磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂）。在蛋白抽提开始前加入0.1M PMSF 母液，PMSF 终浓度1mM 。称取组织重量以重量：裂解液体积=1:9 比例加入裂解液，用眼科剪剪碎组织块，Fluka 电动组织匀浆器15000rpm 转速进行匀浆，每次10s ，间隔10s ，进行三次匀浆。匀浆时EP 管需要浸入冰水混合物中进行降温。匀浆完成后在冰上孵育20min ，4 度离心，13000rpm ，20min 。离心完成后取上清，分装保存，待测。

3.1.2细胞蛋白抽提

预冷RIPA 蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂（磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂）。在蛋白抽提开始前加入0.1M PMSF 母液，PMSF 终浓度1mM。细胞计数，以细胞数量1 x 107加入1ml裂解液，用枪头吹打充分悬起细胞，完成后在冰上孵育20min，4度离心，13000rpm，20min。离心完成后取上清，分装保存，待测。

3.2BCA 法蛋白定量

准备BCA工作液A液：B液=50:1，稀释好各个提取BSA标准品。样品用PBS 进行稀释。

样品：BCA工作液=1:8，混匀后37度孵育30min或者室温孵育60min，酶标仪570nm波长滤光片读取OD值。

蛋白浓度计算见下表：

3.3蛋白浓度调整

以RIPA调整蛋白浓度，加入 5 X还原样品缓冲液后样品终浓度为2-4mg/ml （不同样品具体确定）。煮沸变性5min。

样品蛋白浓度调整见下表：

3.4SDS-PAGE

3.4.1根据目的蛋白的分子量，配制12%分离胶，浓缩胶浓度为5%。

3.4.2待检测蛋白样品上样量：上样20ug

3.4.3电泳条件：浓缩胶恒压90V,约20mi n，溴酚蓝进行分离胶界面；分离胶恒压

160 V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。

3.4.4用考马斯亮蓝染色液进行染色。

染色结果见下图：

3.5目的蛋白WB正式实验

3.5.1根据目的蛋白的分子量，配制%分离胶，浓缩胶浓度为5%。

3.5.2待检测蛋白样品上样量：

3.5.3电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min ;分离胶恒压160V，通过预染蛋白

marker来确定电泳停止时间。

3.5.4湿转法，转膜条件：300mA恒流；0.45um孔径NC膜，转膜时间h。转

膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。同时做好泳道标

记，准备预实验时进行按照纵向泳道剪膜。

3.5.5封闭：将膜完全浸没5%脱脂奶粉-TBST中室温轻摇60min。

3.5.6一抗孵育：用5%脱脂奶粉-TBST稀释稀释一抗，室温孵育10min，放4C

过夜。

备注：按照预实验中确定的稀释度进行正式实验选择一种内参进行同步预实验。3.5.7第二天从4度拿出膜，在室温孵育30min。洗膜：TBST洗膜5次，每次

3min。

3.5.8二抗孵育：用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG（H+L）HRP 山羊抗

小鼠IgG（H+L）HRP，1:10000，室温轻摇40min。洗膜：TBST 洗膜6次，每次3min。

3.5.9ECL加到膜上后反应3-5min，胶片曝光：10s-5min （曝光时间随不同光强度

而调整），显影2min，定影。

胶片扫描后结果如下：

3.6 内参蛋白WB正式实验

3.6.1Stripping Buffer洗膜，37°C洗膜30min （如果目的蛋白与内参蛋白分子量

相差在10K以上，可以不用stripping buffer洗膜这一步）。

3.6.2洗膜：去离子水洗膜3次。

3.6.3洗膜：TBST洗膜3次，每次3min

3.6.4将膜完全浸没3%BSA-TBST中室温轻摇30min。

3.6.5孵育内参：加Beta-actin兔多抗，用5%脱脂奶粉-TBST稀释抗体，1 : 3000

稀释，室温孵育2h。

3.6.6洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。

3.6.7二抗孵育：用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG （H+L）HRP 山羊

抗小鼠IgG （H+L）HRP，1:10000，室温轻摇40min。洗膜：TBST 洗膜6

次，每次3min。

3.6.8洗膜：TBST 洗膜 5 次，每次3min。

3.6.9ECL 加到膜上后反应3-5min ，胶片曝光：10s-5min （曝光时间随不同光强