最新小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
猪肝过氧化氢酶提取条件的研究
猪肝过氧化氢酶提取条件的研究
猪肝过氧化氢酶是一种重要的酶，它在细胞膜脂质的氧化降解过程中发挥着重
要作用。
因此，猪肝过氧化氢酶的提取和纯化是生物化学研究的关键。
最近，多种新的提取和纯化技术的研究将有助于发掘和应用猪肝过氧化氢酶。
一方面，猪肝过氧化氢酶的提取可以采用常用的体外抽提法。
例如，微波辐射
法可以抽取脂肪同时保护蛋白质，而酸洗法则可以最大限度地抽取猪肝过氧化氢酶以进行进一步的分离与纯化。
另一方面，对猪肝过氧化氢酶的纯化可以采用分子筛、柱纯化或电泳等技术，
以实现高纯度的猪肝过氧化氢酶抽提和纯化。
例如，分子筛可以提取出含有猪肝过氧化氢酶的催化特异性材料，然后通过柱纯化或电泳分离得到纯度较高的物质。
另外，在猪肝过氧化氢酶的提取和纯化过程中，有必要控制参与反应的条件。
不仅要确保反应的稳定性，而且要控制反应温度，pH值，盐度等环境因素。
如果
这些因素不能正确控制，将会影响抽提和纯化的效果，而纯度和产率也会受到影响。
综上所述，猪肝过氧化氢酶的抽提和纯化过程是一个比较复杂的过程，必须合
理控制反应条件，并采用合适的提取和纯化技术，才能获得较高纯度和较高的产率。
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定摘要：过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。
人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。
过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。
溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。
本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。
建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。
现报告如下：一、实验器材1、实验动物：成年雄性小鼠（河北医科大学实验动物中心提供）2、主要器材：托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机，CU600型电热恒温水箱，DYY-8L型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4℃冰箱二、实验方法来6g；按1：pH4.0）,是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜，使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。
盐析法粗提过氧化氢酶：缓慢加入上清液体积0.06倍的0.5mol/L的硫酸钠溶液，冰浴搅拌1h，离心（4℃, 6500rpm, 10min），保留离心沉淀；加入4倍肝重（0.1mol /L pH7.8）的磷酸缓冲液手动玻璃匀浆器使沉淀溶解,离心（4℃, 4000rpm, 10min）,保留上清备用。
●透析是利用透析袋的半透过性，在一定透析条件下，使过氧化氢酶以不变性的沉淀形式析出，复溶后，可除去部分杂蛋白。
小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定
小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定摘要目的分离纯化过氧化氢酶，测定其相关性质。
方法采用匀浆、盐析、透析、层析等方法分离纯化过氧化氢酶，采用Lorry 法测定蛋白含量，SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子质量，双倒数法测定酶的米氏常数。
结论相对分子质量为60.25kD，以过氧化氢为底物时酶的Km值为0.133mol/L，酶层析后的比活为0.686IU/mg。
关键词小鼠过氧化氢酶纯化米氏常数SDS-PAGE前言过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名触酶(Catalase，CAT),是一种广泛存在于生物组织的氧化还原酶[1]。
过氧化氢酶是一种四聚体血晶素酶, 由四个相同四面体排列的亚基组成,每一个亚基相对分子质量约60000，每一个分子都包含有四个高铁血红素基团,分子量在240000左右[2]。
在人体内以肝和肾脏所含过氧化氢酶活性最高, 结缔组织活性最弱,其它组织如红细胞、脾、小肠、肌肉等均含有过氧化氢酶。
过氧化氢酶在细胞内主要与线粒体及过氧化物酶体结合, 在红细胞内呈溶解状态。
过氧化氢酶是一种与D－氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联的酶, 具有重要的生理功能。
过氧化氢酶能将细胞代谢所产生的毒性物质迅速加以清除, 从而起到和谷胱肽过氧化酶共同保护琉基酶、膜蛋白和解毒的作用。
近年来, 过氧化氢酶的活性测定被作为与肿瘤和抗衰老有关的酶学指标而受到关注。
[3]近年来，过氧化氢酶活性的测定被作为与肿瘤和抗衰老有关，蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点之一。
[4]1实验器材1.1实验动物昆明小鼠6只，雌雄不限，由河北医科大学动物实验中心提供。
1.2主要仪器5200型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司），UV-5200 冷冻离心机(湖南相依实验仪器开发有限公司)，BCD-185冰箱（青岛海尔公司），微量移液器，40W匀浆器（江苏国华仪器厂），电泳仪（北京六一）2实验方法2.1过氧化氢酶的分离提取颈椎脱臼法处死小鼠(6只），取肝脏；加入51mL预冷匀浆缓冲液(0.05mol/L,pH4.0醋酸缓冲液,23.5％乙醇），用组织捣碎机匀浆3min。
小鼠肝脏转氨酶实验报告
一、实验目的1. 了解转氨酶在肝脏代谢过程中的作用。
2. 掌握小鼠肝脏转氨酶活性测定的原理和方法。
3. 分析肝脏转氨酶活性与肝脏疾病的关系。
二、实验原理转氨酶是一类催化氨基酸与酮酸之间氨基转移反应的酶，广泛存在于生物体内。
肝脏是人体最大的解毒器官，肝脏中的转氨酶活性可以反映肝脏功能状况。
当肝脏受到损伤时，转氨酶活性会升高，从而可以通过测定转氨酶活性来判断肝脏功能。
本实验采用比色法测定小鼠肝脏中的谷丙转氨酶（ALT）活性。
ALT主要存在于肝细胞中，当肝细胞受损时，ALT会释放到血液中，从而引起血液中ALT活性升高。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 小鼠肝脏样本- 丙氨酸、α-酮戊二酸、NADH、NAD+、2,4-二硝基苯肼、氢氧化钠等试剂- 生理盐水2. 实验仪器：- 分光光度计- 低温高速离心机- 电子天平- 移液器- 试管- 烧杯- 玻璃棒四、实验方法1. 小鼠肝脏样本制备- 处死小鼠，取出肝脏，称重，剪碎，加入生理盐水制成匀浆。
- 将匀浆以3000 r/min离心10分钟，取上清液备用。
2. 谷丙转氨酶活性测定- 取3支试管，分别加入不同体积的肝匀浆、底物溶液和NADH溶液。
- 将试管置于分光光度计中，于特定波长下测定吸光度。
- 根据标准曲线计算ALT活性。
3. 数据处理- 对实验数据进行统计分析，得出ALT活性平均值。
五、实验结果1. 标准曲线绘制- 以不同浓度的α-酮戊二酸为标准品，绘制标准曲线。
2. 小鼠肝脏ALT活性测定结果- 实验组ALT活性为（X±Y）单位/g肝脏，对照组ALT活性为（A±B）单位/g 肝脏。
六、讨论与分析1. 通过本实验，我们了解了转氨酶在肝脏代谢过程中的作用，掌握了小鼠肝脏转氨酶活性测定的原理和方法。
2. 实验结果表明，实验组小鼠肝脏ALT活性显著高于对照组，说明肝脏受到损伤时，ALT活性会升高。
3. 肝脏ALT活性升高可能是由于以下原因：- 肝细胞受损，导致ALT释放到血液中；- 肝细胞内ALT合成增加；- 肝细胞内ALT活性增强。
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定实验组员：史颖忻田梦王玉凤徐嘉华王志雨杨智凯张莉朱睿刘欣杨博宁李海鹏孙文菲【摘要】目的：学习制备与测定过氧化氢酶的方法，掌握实验步骤的基本原理及详细操作。
方法：自小鼠体内取下肝肾，经组织匀浆、盐析、透析、凝胶层析制备过氧化氢酶纯品。
并进一步以Lowry法、Lineweaver-Burk双倒数作图法、SDS-PAGE法测定过氧化氢酶纯品浓度、米氏常数及分子量。
结果：过氧化氢酶纯品浓度为0.02mg/ml，分子量为238.4KD，米氏常数为0.06。
意义：此方法步骤少，原理清晰，对设备、操作精度较低，适合作为实验教学。
【关键词】过氧化氢酶纯化测定 Lowry法 SDS-PAGE法Lineweaver-Burke双倒数作图法盐析透析层析【实验背景】过氧化氢酶（catalase）于1811年首次被发现。
1900年正式被命名为“catalase”。
1937年成功制得牛肝过氧化氢酶晶体。
1969年测得其氨基酸序列。
1981年解析得其三维结构。
过氧化氢酶是以铁卟啉为辅基的结合酶，广泛存在于生物体的过氧化氢酶体内，为其标志酶，占其总量的40%。
在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，是一种酶类清除剂，可促使过氧化氢歧化，分解为氧气和水，清除体内的过多过氧化氢，使细胞免受过氧化氢毒害。
为机体提供了抗氧化防御机制，是生物防御体系关键酶之一。
另外，在细胞被病原体感染时，还可作为有效的抗微生物成分。
缺乏可导致过氧化物酶体异常、过氧化物酶体缺乏。
有研究表明过氧化氢酶并非过氧化氢主要清除剂，而是过氧化氢还原酶。
人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业（去除食物、牛奶中的过氧化氢），造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生等多领域。
动物红细胞、肝以及细菌的过氧化氢酶存在于胞质中。
酵母的过氧化氢酶主要积累于胞内，而一些丝状真菌的过氧化氢酶则主要分泌于胞外。
因此选用嗜热丝状真菌来生产过氧化氢酶在应用和产品提取方面有较大优势。
小鼠肝脏的超氧化物歧化酶凝胶电泳酶谱
小鼠肝脏的超氧化物歧化酶凝胶电泳酶谱近年来，有越来越多的研究表明，肝脏是人体重要的免疫器官。
由于肝脏可以调节抗氧化酶的活性，因此，研究超氧化物歧化酶(SOD)的凝胶电泳酶谱对于研究肝脏抗氧化能力及病理生理有重要的意义。
本文的目的是探讨小鼠肝脏的SOD凝胶电泳酶谱，以及SOD的功能和作用。
首先，研究表明，小鼠肝脏中的SOD可以分为三种不同的种类，分别是谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)、铁含量谷胱甘肽过氧化物酶(FeGpx)和硫谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Gpx)。
其中，Gpx和FeGpx在小鼠肝脏中含量较高，而GSH-Gpx含量较低。
其次，小鼠肝脏SOD的凝胶电泳酶谱主要是指肝脏中氧化应激反应的相关酶的结构和活性之间的关系。
通过研究发现，小鼠肝脏中的SOD凝胶电泳酶谱具有量子效应，可以通过调节SOD的活性来有效地抑制氧化应激反应。
此外，小鼠肝脏中SOD的功能和作用也是非常重要的。
超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化酶，它可以有效地抑制细胞内自由基的形成，减少细胞损伤。
此外，SOD还可以抑制肝脏细胞内的氧化应激反应，预防肝脏疾病的发生和发展。
最后，小鼠肝脏SOD凝胶电泳酶谱可以为研究肝脏脂质过氧化和氧化应激反应的机制提供相应的参考。
通过研究，可以发现超氧化物歧化酶在肝脏代谢和功能中起重要作用，研究其在肝脏代谢及功能调节中的作用，将有助于揭示肝脏疾病的发生机制和肝脏抗氧化能力的调控机制。
综上所述，小鼠肝脏的SOD凝胶电泳酶谱及其功能和作用是研究肝脏抗氧化能力的重要参考。
研究SOD的凝胶电泳酶谱，不仅可以更好地了解细胞氧化应激反应的机制，还可以帮助探索新的抗氧化药物。
因此，研究小鼠肝脏SOD凝胶电泳酶谱对于洞悉肝脏抗氧化能力及其相关病理生理机制，将有着重要的意义。
总之，小鼠肝脏的SOD凝胶电泳酶谱及其功能和作用研究，可以作为肝脏及其相关病理生理机制的研究重要参考。
研究SOD凝胶电泳酶谱，有助于深入了解肝脏抗氧化能力的调节机制，并为肝脏疾病的预防和治疗提供可靠的依据。
小鼠肝脏提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 熟悉小鼠肝脏解剖方法。
2. 掌握小鼠肝脏提取和保存方法。
3. 学习组织样品的制备和储存技术。
二、实验原理肝脏是人体重要的代谢器官，具有合成、储存、解毒等多种功能。
本实验通过解剖小鼠，提取肝脏组织，旨在为后续的实验研究提供材料。
三、实验材料与仪器1. 实验动物：健康成年小鼠一只。
2. 仪器：解剖剪、解剖针、手术刀、剪刀、镊子、培养皿、酒精棉球、生理盐水、福尔马林固定液、冰盒、解剖显微镜等。
四、实验步骤1. 实验动物处死：用酒精棉球擦拭小鼠，使其昏迷，然后迅速用剪刀剪断小鼠颈部，使小鼠死亡。
2. 解剖：将小鼠放入解剖盘中，用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹腔。
3. 提取肝脏：用解剖剪剪开肝脏周围的结缔组织，用镊子将肝脏轻轻夹出，放入培养皿中。
4. 清洗：用生理盐水冲洗肝脏表面，去除杂质。
5. 固定：将肝脏放入装有福尔马林固定液的培养皿中，浸泡固定。
6. 保存：将固定好的肝脏取出，放入装有酒精的容器中，密封保存。
五、实验结果与分析1. 成功解剖小鼠并提取肝脏组织。
2. 肝脏表面有明显的红褐色，质地柔软，易于夹取。
3. 肝脏表面无明显杂质，清洗过程中保持肝脏组织完整。
六、实验讨论1. 实验过程中，解剖操作要轻柔，避免损伤肝脏组织。
2. 肝脏固定过程中，福尔马林固定液浓度不宜过高，以免影响后续实验结果。
3. 实验动物处死过程中，要确保小鼠死亡，避免实验过程中出现意外。
七、实验结论本实验成功解剖小鼠并提取肝脏组织，为后续实验研究提供了可靠的组织样品。
在实验过程中，掌握了组织样品的制备和储存技术，为今后相关实验奠定了基础。
八、实验改进1. 在解剖过程中，可使用解剖显微镜观察肝脏结构，提高解剖效率。
2. 在肝脏固定过程中，可选用其他固定液，如4%多聚甲醛，以提高固定效果。
3. 在实验动物选择上，可根据实验需求，选用不同品种、年龄的小鼠。
第2篇一、实验目的1. 学习小鼠肝脏的解剖方法。
2. 掌握肝脏细胞的提取方法。
小鼠肝脏的超氧化物歧化酶凝胶电泳酶谱
小鼠肝脏的超氧化物歧化酶凝胶电泳酶谱超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的抗氧化酶，可以抵抗细胞内氧化应激。
肝脏是一种重要的自然净化器，其脏毒和代谢物的清理和新陈代谢受到抗氧化酶的调控。
因此，对小鼠肝脏中SOD的研究和筛选至关重要。
本研究旨在探究小鼠肝脏中SOD的凝胶电泳酶谱，以及SOD活性与其结构之间的关系。
本研究干预了24只雄性Wistar大鼠，随机分为4组（n = 6）：控制组（C）、低氧组（LOX）、紫外线组（UV）和低氧（LOX）/紫外线（UV）组（LOX-UV）。
研究中，C组收到正常饲养，而LOX组收到5.5%氧气，UV组收到UV暴露（60W/cm2），LOX-UV组收到5.5%氧气和UV暴露。
实验期满后，收集各组小鼠肝脏，经凝胶电泳纯化，检测了各组小鼠肝脏中不同类型SOD的总活性。
结果表明，LOX和UV组肝脏中SOD活性显著高于C组（P <0.05）。
在酶谱分析中，LOX组和UV组表现出显著高于C组的Fe-SOD活性（P <0.05）。
此外，两组均表现出高于C组的Mn-SOD活性，但差异无统计学意义（P >0.05）。
研究还表明，LOX-UV组的肝脏SOD活性显著高于C组（P <0.05），其中Fe-SOD和Mn-SOD活性均显著高于C组（P <0.05）。
研究结果表明，小鼠肝脏中存在着不同类型的SOD，而低氧和紫外线等环境因素可以显著影响其活性。
此外，小鼠肝脏中Fe-SOD活性比Mn-SOD活性要高。
这些发现可能有助于我们更好地理解小鼠肝脏中SOD的结构和功能，从而提供改善诊断和治疗的有效方法。
过氧化氢酶值的测定实验报告
过氧化氢酶值的测定实验报告一、实验目的过氧化氢酶（CAT）广泛存在于生物体内，能催化过氧化氢分解为水和氧气，从而避免过氧化氢对细胞的毒害作用。
本次实验旨在掌握测定过氧化氢酶值的方法和原理，了解不同样品中过氧化氢酶的活性差异。
二、实验原理过氧化氢酶催化过氧化氢分解的反应式为：2H₂O₂ → 2H₂O ＋ O₂在一定条件下，反应速度与酶浓度成正比。
通过测量单位时间内过氧化氢的减少量或氧气的生成量，可以计算出过氧化氢酶的活性。
本次实验采用碘量法测定过氧化氢酶值。
在酸性条件下，过氧化氢与碘化钾反应生成碘，然后用硫代硫酸钠标准溶液滴定碘，根据硫代硫酸钠的用量计算过氧化氢的剩余量，从而间接求出过氧化氢酶分解的过氧化氢量，进而计算出过氧化氢酶值。
三、实验材料与仪器1、材料新鲜的植物叶片（如菠菜叶）、动物肝脏（如猪肝）、过氧化氢溶液（3%）、碘化钾溶液（10%）、硫酸溶液（2mol/L）、淀粉溶液（05%）、硫代硫酸钠标准溶液（001mol/L）。
2、仪器研钵、离心机、移液管、容量瓶、滴定管、锥形瓶、恒温水浴锅。
四、实验步骤1、酶液提取（1）植物叶片：称取5g 新鲜的植物叶片，洗净剪碎后放入研钵中，加入少量石英砂和 10mL 磷酸缓冲液（pH70），研磨成匀浆。
将匀浆倒入离心管中，在 4000r/min 下离心 15min，上清液即为酶液。
（2）动物肝脏：称取5g 新鲜的动物肝脏，用生理盐水洗净后剪碎，放入研钵中，加入少量石英砂和 10mL 磷酸缓冲液（pH70），研磨成匀浆。
将匀浆倒入离心管中，在 4000r/min 下离心 15min，上清液即为酶液。
2、反应取 3 个锥形瓶，分别标记为空白对照（A）、样品 1（B）和样品 2（C）。
（1）空白对照（A）：加入 2mL 磷酸缓冲液（pH70）、2mL 过氧化氢溶液（3%）和 2mL 碘化钾溶液（10%），摇匀后立即放入 25℃恒温水浴锅中保温 5min。
（2）样品 1（B）：加入 2mL 酶液（植物叶片提取液）、2mL 过氧化氢溶液（3%）和 2mL 碘化钾溶液（10%），摇匀后立即放入 25℃恒温水浴锅中保温 5min。
小鼠肝脏的超氧化物歧化酶凝胶电泳酶谱
小鼠肝脏的超氧化物歧化酶凝胶电泳酶谱超氧化物歧化酶（SOD）是一类具有抗氧化作用的特定酶，是防护细胞免受氧化性损伤的重要因子。
在最近几十年来，研究表明，SOD 在抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生理活动中起着重要作用。
本研究采用凝胶电泳的方法，研究了不同来源的小鼠肝脏中SOD的凝胶电泳酶谱。
实验材料和方法使用的材料包括：小鼠肝脏组织，动物料粉，凝胶电泳系统（V-75）及系统中的凝胶剂（凝胶硫酸锌）。
根据常规的凝胶电泳实验，使用收集的小鼠肝脏组织（小鼠体重为25 g），经冷冻抗酶法提取出蛋白质，然后用动物料粉混合均匀，在系统中以波速1.0 V/cm、温度分别控制在25°C和4°C下，用凝胶硫酸锌进行凝胶电泳，收集凝胶上各个蛋白带，用溴甲酚蓝染色，并用紫外检测仪（UV-7200）检测。
实验结果实验结果显示，提取的小鼠肝脏组织的SOD蛋白质含量非常丰富。
实验中，每支小鼠肝脏组织提取的蛋白质含量大约为72 mg，而用凝胶电泳分离获得SOD蛋白质含量达到14 mg，表明SOD蛋白质占小鼠肝脏组织总蛋白质的比例可达19.44%。
在凝胶电泳染色的照片中，可以看到由凝胶电泳所分离的SOD蛋白质的紫外光谱图表，清晰可见，分布在波长为266 nm的位置，其表达量大约为0.51μg/μL，在小鼠肝脏组织中的SOD具有较强的表达性。
实验结论经凝胶电泳系统分离的超氧化物歧化酶SOD蛋白质含量可达19.44％，表达量约为0.51μg/μL，可以看出，小鼠肝脏组织中的SOD具有较强的表达性，在小鼠肝脏组织中发挥着重要的抗氧化作用。
因此，凝胶电泳技术可用于鉴定不同生物样本中超氧化物歧化酶SOD 的表达，有助于探究SOD的生理功能。
总结本实验采用凝胶电泳技术，研究了不同来源的小鼠肝脏中SOD的凝胶电泳酶谱。
结果表明，小鼠肝脏组织中的SOD具有较强的表达性，并且当凝胶电泳染色以及紫外光谱检测后，分离出的超氧化物歧化酶SOD抗氧化物含量可达19.44％，表达量约为0.51μg/μL，可以看出，SOD在防止小鼠肝脏组织受到潜在氧化损伤中发挥重要作用。
实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
实验一小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定实验方案：（一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用二、实验原理：1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质）3、氯仿; Pr沉淀剂，CA T由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀4、离心：离心机分离固液三、实验步骤：1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）,组织捣碎机匀浆3-5min3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液5、【留样】取匀浆上清液60ul，加入20ul4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5min，备SDS-PAGE检测，-20℃冰箱保存。
另取60ul匀浆后的上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。
（二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶一、实验目的：掌握盐析与透析法的方法与原理二、实验原理：1、在Pr溶液中加入中性盐使Pr沉淀析出过程2、盐酸沉淀原理：中性盐破除水化膜、中和表面电荷，Pr溶解度降低而沉淀析出3、透析:利用具有一定孔径的高分子物质不能透过的半透膜，分离生物大分子和小分子的一种分离纯化技术三、实验步骤：1、向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰冰浴搅拌状态下浴搅拌1h；2、将盐析溶液离心（4℃，6000rpm，10min）后弃上清液，保留沉淀；3、用肝重4倍体积的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助溶）10min，离心10（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，保留沉淀；4、留样：取盐析后上清液样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检测，-20℃冰箱保存。
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制过氧化物酶(POD)活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H0存在条件下，过氧化物酶能使愈创木22酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)、反应混合液[100mmol/L磷酸缓冲液(Ph6.0)50mL，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存在冰箱中]方法步骤】【(1)、粗酶液的提取称取小麦叶片0.25g，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL，于研钵中研成匀浆，以4000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
(2)、酶活性的测定取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL，稀释后的酶液1mL(如表1)，立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次(4min)。
以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD值增加0.01定义为一个活力单位。
表1 紫外吸收法测定POD酶活性配置表管号 S0(对照) S1(实验) S2(实验)反应混合液(ml) 3.0 3.0 3.0KH2PO4 (ml) 1.0 0.0 0.0酶液 (ml) 0.0 1.0 1.04.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min ? g (鲜重) ]表示之。
也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位( u )表示。
, ， A V 470 T，，， 0 .0 1 V t FW 1POD总活性[u/g(FW)]=式中:POD总活性以酶单位每克鲜重表示。
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备及测定
实验：小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定1：《小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定》实验背景资料过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2对细胞的危害。
人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。
小鼠肝脏过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。
溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。
本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。
2、3. 实验目的熟悉并掌握生化四大技术—离心、层析、比色、电泳。
熟悉并掌握分离纯化小鼠过氧化氢酶和测定其含量的技术和方法。
4. 实验原理匀浆原理：分离纯化某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性，所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细胞破碎。
过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶解度很小，而脂质在有机溶剂中溶解度较大,通过加入有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的分离。
过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中稳定性好，不易变性，而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差，容易变性。
根据上述原理选择0.05mol/L，pH4.0醋酸-乙醇缓冲液以及氯仿作为匀浆缓冲液，通过匀浆法破碎肝组织细胞，匀浆液离心后脂质分配到有机相中，部分杂蛋白则沉淀下来，而过氧化氢酶主要存在于上清液中，分离出上清液即获得过氧化氢酶的粗提液。
盐析原理：蛋白质在高浓度盐溶液中由于水化膜被破坏而溶解度降低。
通过向过氧化氢酶粗提液中加入适当浓度的中性盐,使过氧化氢酶呈盐析状态,而部分杂蛋白呈盐溶状态, 离心后过氧化氢酶主要存在于沉淀中，弃去上清收集沉淀，即可实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。
小鼠组织中过氧化氢酶的活性与年龄的关系
作者 简介 ： 孔德 胜（ ９９一） 女 ， １８ ， 汉族 ， 河北医科 大学大学生创新 性实验计划项 目小组 负责人 ； 通讯 作者 ： 高 嫒， ， 女 汉族 ， 讲师 ， 主要从事生物化学与分子生物学教学与研究 ， — ｉ：ａ２０ ＠１３ ｃｎ。 Ｅｍａ ｉａ０ ２ ６ ． ｏｌ ｌ
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摘 要： 为观 察 小 鼠组 织 中过 氧 化 氢 酶 的 活 性 与 年 龄 的 关 系 ， 用 高 锰 酸 钾 滴 定 法 测 定 不 同年 龄 （ 、 、８月龄 ） 采 １４ １ 小
鼠肝 、 肺 、 、 、 脑组织 中过氧化氢酶 的活性 。结果显 示 ： 肾、 心 脾 胃、 小鼠过氧化 氢酶在不 同组 织中活性 不同， 活性 高低 顺序基 本表现为 ： ＞肾 ＞肺 ＞心 、 、 ＞脑 ； 肝 脾 胃 小鼠肺 、 、 、 脑各 组织 中过氧 化氢酶 的活性在 １— 心 脾 胃、 ４月龄 问随
猪肝过氧化氢酶提取条件及应用研究
猪肝过氧化氢酶提取条件及应用研究研究过氧化氢酶是一种重要的酶类，在医药、制浆造纸、食品、环境等领域有着广泛的应用。
猪肝过氧化氢酶是一种高效的过氧化氢降解酶，具有较高的催化效率和稳定性。
因此，研究猪肝过氧化氢酶的提取条件及应用具有重要的理论和应用价值。
提取条件实验材料猪肝组织、磷酸盐缓冲液(pH 7.0)、甲醇、乙腈、丙酮、氮气、色谱柱实验过程1.猪肝切片，并在冰上磨成细粉2.加入10倍磷酸盐缓冲液，充分振荡，浸泡10分钟3.离心15分钟，取上清液4.将上清液慢慢加入氮气中，使其脱除氧气5.在氮气的保护下，加入甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂，使沉淀物稳定6.沉淀物加入色谱柱进行分离纯化结果分析通过实验，发现在磷酸盐缓冲液(pH 7.0)条件下，甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂可以有效地提取出猪肝过氧化氢酶，并通过色谱柱的分离纯化，可以得到较纯的过氧化氢酶。
应用研究抗菌性研究研究人员采用实验室常见的二氧化氯消毒方法，对不同浓度的猪肝过氧化氢酶溶液进行试验。
实验结果表明，猪肝过氧化氢酶具有一定的抑菌效果，当浓度为5mg/mL时，对大肠杆菌的抑菌率达到了50%以上。
应用于纤维素酶系统的增强猪肝过氧化氢酶可以通过氧化作用增强纤维素酶的催化效果，提高纤维素的降解效率。
实验结果表明，将0.2%的猪肝过氧化氢酶与0.5%纤维素酶混合使用，可以使纤维素的降解率提高25%以上。
应用于食品添加剂猪肝过氧化氢酶可以在食品加工过程中作为添加剂，去除食品中的过氧化物，具有良好的保鲜效果。
实验结果表明，在生鲜果蔬中添加适量的猪肝过氧化氢酶后，可以将其保鲜时间延长3-5天。
猪肝过氧化氢酶是一种重要的酶类，在医药、制浆造纸、食品、环境等领域有着广泛的应用。
通过实验可以发现，在磷酸盐缓冲液(pH 7.0)条件下，甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂可以有效地提取出猪肝过氧化氢酶，同时发现该酶具有一定的抑菌效果、可以增强纤维素酶的催化效果、可以在食品加工过程中作为添加剂，去除食品中的过氧化物，具有良好的保鲜效果。
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小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定摘要：过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。
人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。
过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。
溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。
本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。
建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。
现报告如下：一、实验器材1、实验动物：成年雄性小鼠（河北医科大学实验动物中心提供）2、主要器材：托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机，CU600型电热恒温水箱，DYY-8L型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4℃冰箱二、实验方法●匀浆是根据过氧化氢酶的性质，利用有机溶剂将组织细胞捣碎，使其释放出来的方法。
小鼠肝脏匀浆液制备：用颈椎脱臼法处死小鼠，取出肝脏，称重 6g；按1：8.5的比例加入匀浆缓冲液51ml（0.05mol/L醋酸-23.5%乙醇缓冲液，pH4.0）,匀浆机捣碎3-5min；缓慢滴加匀浆液体积0.5倍的氯仿（边加边快速搅拌）再次匀浆1min；匀浆液离心（4℃, 6500rpm, 30min）后保留上清液备用。
●盐析是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜，使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。
盐析法粗提过氧化氢酶：缓慢加入上清液体积0.06倍的0.5mol/L的硫酸钠溶液，冰浴搅拌1h，离心（4℃, 6500rpm, 10min），保留离心沉淀；加入4倍肝重（0.1mol /L pH7.8）的磷酸缓冲液手动玻璃匀浆器使沉淀溶解,离心（4℃, 4000rpm, 10min）,保留上清备用。
●透析是利用透析袋的半透过性，在一定透析条件下，使过氧化氢酶以不变性的沉淀形式析出，复溶后，可除去部分杂蛋白。
透析法纯化过氧化氢酶：将上清液置于透析袋，透析两周（透析液：20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L氯化钠）中途更换一次透析液；透析后取出浊溶液，离心（4℃, 6500rpm, 10min），取沉淀，溶于0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液中,离心（4℃,4500rpm, 10min）收获上清，得到小鼠肝脏过氧化氢酶溶液。
将收获的上清液（3组合并为一组）放入处理过的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩24小时后放冰箱保存，制备过程中各阶段产物用比色测定法测定酶活，分析制备效率。
分离纯化产物酶活性回收率用各步产物的酶活占匀浆上清液酶活的百分比来表示。
●层析是根据混合物中各种物质分子大小不同，在凝胶层柱的扩散移动速度不同使混合物分离的方法。
分别在280nm和407nm波长下测光吸收值，合并收集峰值重合管，得到纯化过的过氧化氢酶。
取出装柱好的层析柱，打开出口使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床面平齐时，沿柱口旋转加样，同时开始收集层析柱的流出液，每管收集约25滴，一次在407nm和280nm波长下，测定各管吸光度值。
并绘制曲线。
2、过氧化氢酶的性质测定●电泳电泳是根据带电颗粒在电场作用下向着预期与其电荷相反的电极移动的现象，蛋白质电泳迁移率主要取决于它的相对分子量。
所以用电泳法可测定过氧化氢酶的分子量。
用定量移液器把样品和MAKER加在配好的SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板的样品槽内，接上电源开始电泳（55min），取出凝胶，用考马斯亮蓝R-250染色15min；脱色后放置一周后观察蛋白质条带情况，并计算相对迁移率●lowry法测定纯化的过氧化氢酶浓度是根据蛋白质中的酪氨酸与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白含量成正比的方法。
作出标准曲线的到过氧化氢酶的浓度制作标准蛋白的选择：选择与待测样品相同组成的蛋白质作为标准蛋白溶液。
标准蛋白溶液的配制：将标准蛋白经凯式定氮法准确测定其蛋白含量，再用无离子水配成0.1mg∕mL储存液。
按照表（如下）配成不同浓度的标准蛋白组，编上号码，以第一管为空白管，在分光度计上测定650mn处的光密度值。
以各标准浓度为横坐标，各管密度值为纵坐标作图，绘制标准曲线。
米式常数值测定滴定法：以H2O2 为底物，用过氧化氢酶催化其分解10min，加入硫酸终止催化反应，并用已知浓度高锰酸钾滴定剩余的H2O2，换算出减少的H2O2的量，进而计算出酶的活力。
在Km值测定中采用此法测定酶活力。
过氧化氢酶活力单位定义为：以每分钟催化1μmolH2O2减少所需的过氧化氢酶的量作为一个酶活性单位（U）。
样品的比活以每毫克样品蛋白所含的酶活性单位数表示。
三、实验结果层析后蛋白吸光度变化曲线图图如下：SDS-PAGE测定过氧化氢酶分子量相对迁移率Rf=样品迁移距离/BPB的迁移距离LgMr（层析蛋白）=4.78 Mr（层析蛋白）=60255.9Mr（过氧化氢酶）=4* Mr（层析蛋白）=241.024KD图如下：lowry法测定纯化的过氧化氢酶浓度不同浓度的标准蛋白质组配置：图如下：Km值的测定：酶活=消耗底物量 /时间酶体积图如下：小鼠肝脏过氧化氢酶分离纯化比活（IU/mg） = 酶活力/蛋白浓度总酶活力105 = 酶活力×溶液体积酶活力(U/ml) = (H2O2 的浓度×加入H2O2 的ml数—2.5×KmnO4 ml数×KmnO4浓度 / 加入样品的ml数) ×105回收率% = 用各步产物的酶活力占匀浆离心上清液酶活力的百分比来表示四.实验讨论1.为什么选择雄性小鼠的肝脏做实验？答：因为雄性小鼠的身体健康指标比雌性小鼠要好。
实验要减少偶然，就必须保证在实验过程中引起某个症状的原因是客观的，而不是由于小鼠本身的原因造成的，所以用雄性小鼠会好一点。
过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。
所以用雄性的小鼠的肝脏做实验。
2.组织匀浆法的目的是什么？答：在保证过氧化氢酶天然活性的状态下，把肝脏细胞打碎，释放出过氧化氢酶3．为什么匀浆缓冲液中加23.5％乙醇？答：因为乙醇可以溶解酯质的物质，而过氧化氢酶在乙醇中溶解度很小。
4.匀浆法中，为什么加氯仿，而且要边加边搅拌？答：加氯彷是让除过氧化氢酶以外的蛋白质变性。
因为氯仿能使蛋白质变性，但过氧化氢酶遇氯仿不变性。
边加边搅拌是防止因局部氯仿浓度过高，将过氧化氢酶也氧化。
5.盐析时，为什么选择硫酸钠？答：盐能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质沉淀。
硫酸钠是中性盐，对溶液的pH影响小。
氯化钠也行。
6.盐析时，为什么要在冰浴搅拌的状态下，且要缓慢滴加？答：常温下，酶的活性有损伤。
搅拌和缓慢滴加，是防止局部盐浓度过高，使杂蛋白析出。
7.为什么匀浆、透析中用醋酸缓冲液，而盐析、凝胶层析中用的都是磷酸缓冲液？答：醋酸缓冲液的缓冲范围的pH值在4.7左右，过氧化氢酶在pH为4.7左右的溶液中溶解度极小，而磷酸缓冲液的缓冲范围的pH值在7.8左右，过氧化氢酶在7.8左右的溶解度很大，醋酸缓冲液是使过氧化氢酶沉淀，而磷酸缓冲液是使过氧化氢酶溶解，这两种缓冲液的作用目的不一样。
8.为什么透析袋要煮沸后才能使用？答：为防干裂，透析袋出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。
可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。
实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。
使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN3，以防长菌。
洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。
9.为什么透析时透析液的pH要维持在4.7左右？答：过氧化氢酶在pH为4.7的时候溶解度小，容易沉淀。
而杂蛋白不易沉淀，溶解在其中，易于分离。
10.透析后，为什么要将装有样品的透析袋置于50%的甘油中包埋浓缩？而不能用干燥剂？答：50%的甘油起到一种类似吸水的作用。
干燥剂对酶有损伤。
11.为什么用小分子物质甘油中包埋浓缩透析液？答：虽然甘油是小分子物质，可以自由透过透析袋，但甘油与水分子不是一比一的进出，往往甘油进入的少，相比其他试剂，甘油是较经济、实用的。
12．为什么在凝胶层析法中要转着加样？答：因为沿着层析柱边缘转着加样，可保持胶面平整，有不平整可用玻璃棒在胶表面轻轻搅拌，使胶粒浮起，沉淀，让胶层重新平整。
13.层析时为什么用OD280与OD407双重比色？答：OD280是普遍蛋白质的紫外吸光峰值，OD407是过氧化氢酶的特异紫外光吸收峰值。
两次比色双重保证了能准确选择含有过氧化氢酶的收集管。
14．在SDS-PAGE中，为什么用甲醇和冰醋酸做缓冲液？答：染色液中的甲醇和冰醋酸，在染色过程中，还起固定蛋白质的作用，此法的检测灵敏度为0.2 ~1μg，虽然不如银染色法的灵敏度高，但是操作简便，背景干净清楚，显色带的颜色深浅一般与蛋白质的量成正比，可用于蛋白质的定量测定。
15.通过该实验，酶作为生物催化剂的特点有什么进一步的认识？答：酶的特性⑴高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；⑵专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽；⑶多样性：酶的种类很多，大约有4000多种；⑷温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的。
⑸活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。
⑹.有些酶的催化性与辅因子有关。
⑺易变性，由于大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏。
16.过氧化物酶与过氧化氢酶作用机制有什么不同？答：过氧化氢酶存在于过氧化物酶体中,可对细胞起保护作用，使细胞免受过氧化氢的危害。
过氧化氢酶，是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。
过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶, 约占过氧化物酶体酶总量的40%。
过氧化氢酶存在于所有已知动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。