吉林大学《有机化学实验》氨基酸纸层析糖旋光度的测定PPT课件
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纸层析法分离鉴定氨基酸PPT资料(正式版)
(1) 氨基酸溶液：0. 点样：用毛细管依次将Lys(赖) 、 Gly(甘) 、 Pro(脯)、Val (缬)、 Leu (亮)和混合样品分别点在这6个位置上，点样点干后再点一次。 由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。 4、展层：将点好样的滤纸(点样面朝外)卷成筒状，用透明胶纸粘接或用线缝好，纸的两边不能接触。
Lys Gly Pro Val Leu 混合样品 准备滤纸: 戴上手套，取层析滤纸（长22 cm、宽14 cm）一张，在纸的一端距边缘3cm处用铅笔画一条直线，在此直线上每间隔2cm作 一记号，为点样位置（即原点），如图。 Lys Gly Pro Val Leu 混合样品 物质被分离后在纸层析图谱上的位置，可用比移值（Rf）来表示。 点样：用毛细管依次将Lys(赖) 、 Gly(甘) 、 Pro(脯)、Val (缬)、 Leu (亮)和混合样品分别点在这6个位置上，点样点干后再点一次。 纸层析法分离鉴定氨基酸 然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配。 在一定条件下（如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变），某种物质的Rf 值是常数，因此可作为定性依据。 5、显色： 用喷雾器均匀喷上％水合茚三酮正丁醇溶液，然后用电吹风吹干即可显出各层析斑点。 5% (m/V)的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液 (各组分的浓度均为％)。 (1) 氨基酸溶液：0. (3) 显色剂：％ (m/V)水合茚三酮正丁醇溶液 。 注意事项：手不能直接接触滤纸； 然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配。 (2) 展层剂：正丁醇∶冰醋酸∶水＝4∶1∶3 (V/V)。 由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。 准备滤纸: 戴上手套，取层析滤纸（长22 cm、宽14 cm）一张，在纸的一端距边缘3cm处用铅笔画一条直线，在此直线上每间隔2cm作 一记号，为点样位置（即原点），如图。 将滤纸直立于层析缸中（注意：点样的一端在下，展层剂的液面需低于点样线1cm ，滤纸勿与缸壁接触），盖好层析缸盖，进行展层。
Lys Gly Pro Val Leu 混合样品 准备滤纸: 戴上手套，取层析滤纸（长22 cm、宽14 cm）一张，在纸的一端距边缘3cm处用铅笔画一条直线，在此直线上每间隔2cm作 一记号，为点样位置（即原点），如图。 Lys Gly Pro Val Leu 混合样品 物质被分离后在纸层析图谱上的位置，可用比移值（Rf）来表示。 点样：用毛细管依次将Lys(赖) 、 Gly(甘) 、 Pro(脯)、Val (缬)、 Leu (亮)和混合样品分别点在这6个位置上，点样点干后再点一次。 纸层析法分离鉴定氨基酸 然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配。 在一定条件下（如温度、展层剂的组成、层析纸质量等不变），某种物质的Rf 值是常数，因此可作为定性依据。 5、显色： 用喷雾器均匀喷上％水合茚三酮正丁醇溶液，然后用电吹风吹干即可显出各层析斑点。 5% (m/V)的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液 (各组分的浓度均为％)。 (1) 氨基酸溶液：0. (3) 显色剂：％ (m/V)水合茚三酮正丁醇溶液 。 注意事项：手不能直接接触滤纸； 然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配。 (2) 展层剂：正丁醇∶冰醋酸∶水＝4∶1∶3 (V/V)。 由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析斑点显色，从而作定性分析。 准备滤纸: 戴上手套，取层析滤纸（长22 cm、宽14 cm）一张，在纸的一端距边缘3cm处用铅笔画一条直线，在此直线上每间隔2cm作 一记号，为点样位置（即原点），如图。 将滤纸直立于层析缸中（注意：点样的一端在下，展层剂的液面需低于点样线1cm ，滤纸勿与缸壁接触），盖好层析缸盖，进行展层。
《旋光度测定法》课件
加强旋光度测定法的普及和应用 推广，提高其在相关领域的影响 力和应用价值，为人类社会的发
展做出更大的贡献。
THANKS
感谢观看
危害。
在实验过程中，应注意观察和 记录实验数据和现象，及时发
现和处理异常情况。
对于精密仪器和设备，应定期 进行校准和维护，确保其准确
性和可靠性。
异常情况处理与应对措施
如果发生火灾、泄漏等紧急情况，应立即采取相应的应急措施，如切断电源、使用 灭火器等，并及时向实验室管理人员报告。
如果实验过程中出现异常现象或数据异常，应立即停止实验，查明原因并采取相应 的处理措施。
领域的应用潜力。
加强旋光度测定法与其他生物分 子结构和功能研究方法的交叉融 合，形成更加全面和系统的研究
体系，推动相关领域的发展。
未来研究方向
深入研究旋光度测定法的原理和 机制，探索其在生物分子结构和
功能研究中的更深层次应用。
结合其他先进的生物技术和方法 ，开发出更加高效、灵敏和特异 的旋光度测定法及其衍生技术。
历史与发展
历史
旋光度测定法最早由法国化学家 路易·巴斯德在1849年发现，经过 一百多年的发展，已经成为一种 成熟的分析方法。
发展
随着科技的不断进步，旋光度测 定法的应用范围不断扩大，测量 精度和灵敏度也不断提高。
应用领域
食品工业
用于检测食品中的糖、 氨基酸、有机酸等物质
的含量。
制药工业
用于药物的定性和定量 分析，以及药物的纯度
结果讨论与改进建议
结果讨论
对实验结果进行了深入讨论，分析了 旋光度测定法的优缺点和应用范围。
改进建议
针对实验过程中存在的问题和不足， 提出了改进措施和建议，以提高实验 的准确性和可靠性。
旋光度测定ppt课件
旋光度(α) ：偏振面被旋转的角度 右旋体和左旋体：若手性化合物能使偏振面右
旋(顺时针)称为右旋体，用(+)表示；而其对映 体必使偏振面左旋(逆时针)相等角度，称为左 旋体，用(一)表示。
16
比旋光度：手性化合物旋光度与溶液浓度、 溶剂、测定温度、光源波长、测定管长度 有关。因此旋光仪测定的旋光度α并非特征 物理常数，同一化合物测得的旋光度就有 不同的值。因此为了比较不同物质的旋光 性能，通常用比旋光度 来表示物质的旋光性，比旋光度 α Dt 是物 质特有的物理常数 。
对映体 旋光 mp 53℃ 基本相同 旋体的生理功能
14
一、实验目的
1. 掌握旋光仪的使用方法。 2. 了解手性化合物的旋光性及其测
定的原理、方法和意义。
15
二、实验原理
1.定义：
旋光性 :手性化合物使平面偏振光偏振面 旋转的性质。
旋光物质：具有旋光性的物质称为旋光物质， 或称为光学活性物质。
H
CH3 CH3
OH
HO
H
乳酸的两种构形
13
二、外消旋体
等量的左旋体和右旋体的混合物，左旋体所具有的旋光度，恰
好被其右旋体抵销，因此失去了旋光性。这种特殊的混合物，称
为外消旋体。一般用（±）来表示。
外消旋体与对映体的比较（以乳酸为例）：
旋光性 物理性质 化学性质
生理作用
外消旋体 无旋光 mp 18℃ 基本相同 各自发挥其左右
有旋光性。
物质分子在结构上即无对称面，也无对称中心的，就具有手性，
因而有旋光性。 11
第三节 含一个手性碳原子化合物的对映异构
一、对映体异构体 1．对映体异构体——互为物体与镜象关系的立体异构体。
旋(顺时针)称为右旋体，用(+)表示；而其对映 体必使偏振面左旋(逆时针)相等角度，称为左 旋体，用(一)表示。
16
比旋光度：手性化合物旋光度与溶液浓度、 溶剂、测定温度、光源波长、测定管长度 有关。因此旋光仪测定的旋光度α并非特征 物理常数，同一化合物测得的旋光度就有 不同的值。因此为了比较不同物质的旋光 性能，通常用比旋光度 来表示物质的旋光性，比旋光度 α Dt 是物 质特有的物理常数 。
对映体 旋光 mp 53℃ 基本相同 旋体的生理功能
14
一、实验目的
1. 掌握旋光仪的使用方法。 2. 了解手性化合物的旋光性及其测
定的原理、方法和意义。
15
二、实验原理
1.定义：
旋光性 :手性化合物使平面偏振光偏振面 旋转的性质。
旋光物质：具有旋光性的物质称为旋光物质， 或称为光学活性物质。
H
CH3 CH3
OH
HO
H
乳酸的两种构形
13
二、外消旋体
等量的左旋体和右旋体的混合物，左旋体所具有的旋光度，恰
好被其右旋体抵销，因此失去了旋光性。这种特殊的混合物，称
为外消旋体。一般用（±）来表示。
外消旋体与对映体的比较（以乳酸为例）：
旋光性 物理性质 化学性质
生理作用
外消旋体 无旋光 mp 18℃ 基本相同 各自发挥其左右
有旋光性。
物质分子在结构上即无对称面，也无对称中心的，就具有手性，
因而有旋光性。 11
第三节 含一个手性碳原子化合物的对映异构
一、对映体异构体 1．对映体异构体——互为物体与镜象关系的立体异构体。
氨基酸纸层析、糖旋光度的测定an
②测定旋光读数：转动度盘、检偏镜、在视场中觅得亮度一 致且暗的位置，再从度盘上读数。读数是正（顺时针方向旋 转）的为右旋物质，读数是负（逆时针方向旋转）的为左旋 物质。
读数方法： 主尺分180格，每格1°；游标尺分10格，每大格0.1 °，每小格0.05 ° 。
1.先看游标尺0刻度线指向主尺的哪两个数之间：图中9和10 之间 则旋光度为9.x
养皿饱和5~10分钟。
3.把滤纸芯儿压下去，使滤纸芯儿的另一端稍微扇开，并接触展开剂到达滤纸边1cm左右时，停止展开，立即
取出滤纸，用铅笔画出展开剂前沿线。
5.去溶剂：烘干
展开剂前沿线
饱和
展开
画出展开剂前沿
4.显色
可见光下观察 紫外灯下观察 显色剂显色： 通用：10% 硫酸乙醇溶液；碘蒸气；
3.展开
将薄层板斜放入层析缸中（或将滤纸挂在层析缸中），层析缸中流 动相（展开剂）的量以不浸泡样点为宜。有些层析缸如下图，易进 行先饱和后展开操作，提高重现性和避免边缘现象。
边缘现象：两边高
本次纸色谱实验展开步骤：
1.在培养皿中加入适量展开剂
2.把点好样的滤纸放到培养皿上，注意滤纸芯儿不能碰展开剂。盖上培
THANK YOU
谢谢大家观看
大部分有机样品：磷钼酸/乙醇溶液 专用： 碘化铋钾 —生物碱；
三氯化铁 —黄酮； 茚三酮 — 氨基酸
显色操作：将茚三酮喷至滤纸润湿，不易流淌
5.计算比移值
Rf 值的意义： 定性分析的指标 评价展开剂选择是否合适、评价分离效果
薄层层析：Rf 0.30～0.80， △Rf ≥0.05 纸 层 析：Rf 0.05～0.85， △Rf ≥0.05
2、影响旋光度的因素 测定波长、浓度、测定管长度、溶剂、温度
最新实验2氨基酸薄层层析PPT课件
3. 关闭空调、电脑、投影、水、电、门和 窗。
4. 填写值日登记本。
直径不超过2mm。
2cm Ala Arg Gly Mix
轻触疾起
1cm
操作步骤— 展层、显色
将薄层板点样端浸入展层 -显色剂，展层-显色剂液面 应低于点样线。盖好层析缸 盖，上行展层。当展层剂前 沿离薄板顶端2cm时，停止 展层，取出薄板，用铅笔描 出溶剂前沿界线，用热风吹 干或在85℃下烘干，即可显 出各层斑点。
② 硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用 于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它 分离。
③ 硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不 能过高。
实验原理
2. 氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基
酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与 此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生 成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。
实验原理
硅胶吸附薄层层析
• 吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶 • 硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种
多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性 硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许 多化合物形成氢键而产生吸附.
实验原理
硅胶吸附薄层层析的特点：
① 硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活 性也与含水量呈负性相关。
• 吸附剂：硅胶 • 粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠 • 氨基酸的异丙醇溶液
丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 • 展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） • 分析样品：氨基酸混合液
器材
• 层析板、尺子、铅笔 • 烧杯、玻棒、量筒 • 吹风机 • 毛细管、层析缸 • 药匙 • 烘箱
操作步骤—薄层板的制备
1、调浆 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤 维素钠8毫升，调成均匀的糊状。 2、涂布 取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然凉 干。 4、活化 70℃烘干30分钟。切断电源，待玻 璃板面温度下降至不烫手时取出。
4. 填写值日登记本。
直径不超过2mm。
2cm Ala Arg Gly Mix
轻触疾起
1cm
操作步骤— 展层、显色
将薄层板点样端浸入展层 -显色剂，展层-显色剂液面 应低于点样线。盖好层析缸 盖，上行展层。当展层剂前 沿离薄板顶端2cm时，停止 展层，取出薄板，用铅笔描 出溶剂前沿界线，用热风吹 干或在85℃下烘干，即可显 出各层斑点。
② 硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用 于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它 分离。
③ 硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不 能过高。
实验原理
2. 氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基
酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与 此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生 成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。
实验原理
硅胶吸附薄层层析
• 吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶 • 硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种
多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性 硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许 多化合物形成氢键而产生吸附.
实验原理
硅胶吸附薄层层析的特点：
① 硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活 性也与含水量呈负性相关。
• 吸附剂：硅胶 • 粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠 • 氨基酸的异丙醇溶液
丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 • 展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） • 分析样品：氨基酸混合液
器材
• 层析板、尺子、铅笔 • 烧杯、玻棒、量筒 • 吹风机 • 毛细管、层析缸 • 药匙 • 烘箱
操作步骤—薄层板的制备
1、调浆 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤 维素钠8毫升，调成均匀的糊状。 2、涂布 取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然凉 干。 4、活化 70℃烘干30分钟。切断电源，待玻 璃板面温度下降至不烫手时取出。
纸层析分离丝氨酸和甘氨酸PPT课件
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4
所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸 停留点（又称为层析点）中心的距离（X） 与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值：
在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值 的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、 温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因 素有关。
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5
三、实验器材与试剂
（一）器材
1. 层析缸 2. 点样毛细管 3. 小烧杯 4. 培养皿 5. 量筒 6. 喷雾器 7. 吹风机（或烘箱）8. 层析滤纸9. 直尺及铅笔
2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做 一记号，标出5个原点。 3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上， 用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不 超过3 mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。 干后再点一次。
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7
4．扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。 将盛有约20 mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的 层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端 在下，扩展剂的液面需低于点样线1 cm)。待溶剂 上升15―20 cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前 沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
5．显色 用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶 液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹 干即可显出各层析斑点。
6．计算各种氨基酸的Rf值。
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8
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9
(二) 试剂
1. 扩展剂(正丁醇: 80%甲酸:水＝15:3:2)
2. 甘氨酸溶液及丝氨酸溶液
3. 显色剂：0.5%的茚三酮—正丁醇溶液
（0．5g茚三酮溶于100ml正丁醇即得0.5%的茚三酮—正丁 醇溶液，
使用茚三酮溶液显色时要戴手套）.6四 Nhomakorabea实验步骤
糖的旋光性和变旋现象PPT课件
糖的旋光性和变旋现象
-
1
一、实验目的
1．了解糖的变旋现象，掌握用糖的旋光性 测定糖浓度的方法；
2．学会使用旋光仪。
-
2
二、实验原理
光是一种电磁波，光波振动的方向与光的 前进方向垂直。普通光的光波在各个不同 的方向上振动。但如果让它通过一个尼科 尔(Nicol)棱镜（用冰洲石制成的棱镜）， 则透过棱镜的光就只在一个方向（偏振面） 上振动，这种光就叫做平面偏振光。偏振 光能完全通过晶轴与其偏振面平行的尼科 尔棱镜，而不能通过晶轴与其偏振面垂直 的尼科尔棱镜。
试剂：未知浓度的蔗糖溶液、10%葡萄糖溶液。
Байду номын сангаас
-
7
四、实验内容及步骤
一、利用糖的旋光性测定糖的浓度
1．转开样品管螺母，洗净玻管，然后向管中注满 蒸馏水，盖上玻片，注意管中不能有气泡，玻片 上的水渍必须擦干。
2．把样品放入旋光仪内，打开电源，待钠光源稳 定1-2min后，转动刻度盘，使目镜中两半圆的亮 度相等，记下刻度盘的读书，以此为零点。
旋光度的大小不仅取决于物质的本性，还与溶液的浓度、 液层的厚度、光的波长、测定温度以及溶剂的性质等等有 关。
偏振光通过厚度为1dm，浓度含有1g/ml的待测物质的溶 液所测得的旋光度称为比旋光度[α]，它是物质的一个特性 常数，如下式所示：
[α]λt=α/cl
式中 t：测定时的温度；
λ：测定时所用光源的波长；
旋光度的大小丌仅取决于物质的本性还不溶液的浓度旋光度的大小丌仅取决于物质的本性还不溶液的浓度液层的厚度光的波长测定温度以及溶剂的性质等等有液层的厚度光的波长测定温度以及溶剂的性质等等有偏振光通过厚度为偏振光通过厚度为1dm1dm浓度含有浓度含有1gml1gml的待测物质的溶液所测得的旋光度称为比旋光度液所测得的旋光度称为比旋光度它是物质的一个特性它是物质的一个特性常数如下式所示
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1
一、实验目的
1．了解糖的变旋现象，掌握用糖的旋光性 测定糖浓度的方法；
2．学会使用旋光仪。
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二、实验原理
光是一种电磁波，光波振动的方向与光的 前进方向垂直。普通光的光波在各个不同 的方向上振动。但如果让它通过一个尼科 尔(Nicol)棱镜（用冰洲石制成的棱镜）， 则透过棱镜的光就只在一个方向（偏振面） 上振动，这种光就叫做平面偏振光。偏振 光能完全通过晶轴与其偏振面平行的尼科 尔棱镜，而不能通过晶轴与其偏振面垂直 的尼科尔棱镜。
试剂：未知浓度的蔗糖溶液、10%葡萄糖溶液。
Байду номын сангаас
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四、实验内容及步骤
一、利用糖的旋光性测定糖的浓度
1．转开样品管螺母，洗净玻管，然后向管中注满 蒸馏水，盖上玻片，注意管中不能有气泡，玻片 上的水渍必须擦干。
2．把样品放入旋光仪内，打开电源，待钠光源稳 定1-2min后，转动刻度盘，使目镜中两半圆的亮 度相等，记下刻度盘的读书，以此为零点。
旋光度的大小不仅取决于物质的本性，还与溶液的浓度、 液层的厚度、光的波长、测定温度以及溶剂的性质等等有 关。
偏振光通过厚度为1dm，浓度含有1g/ml的待测物质的溶 液所测得的旋光度称为比旋光度[α]，它是物质的一个特性 常数，如下式所示：
[α]λt=α/cl
式中 t：测定时的温度；
λ：测定时所用光源的波长；
旋光度的大小丌仅取决于物质的本性还不溶液的浓度旋光度的大小丌仅取决于物质的本性还不溶液的浓度液层的厚度光的波长测定温度以及溶剂的性质等等有液层的厚度光的波长测定温度以及溶剂的性质等等有偏振光通过厚度为偏振光通过厚度为1dm1dm浓度含有浓度含有1gml1gml的待测物质的溶液所测得的旋光度称为比旋光度液所测得的旋光度称为比旋光度它是物质的一个特性它是物质的一个特性常数如下式所示
氨基酸含量的测定及分离鉴定ppt课件
5
实验结果:
丙氨酸 苯丙氨酸 天冬氨酸
L/㎝ d/㎝ Rf
原点到溶剂前沿距离为L，原点到层析点中心距离为d
6
氨基酸的定量分析 —甲醛滴定法
一、目的：
初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点
7
二、实验原理
水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基 。甲醛可与氨 基酸上的 —N+H3结合，形成 —NH—CH2OH、—N(CH2— OH)2 等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定 N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
12
五、计算
标准甘氨酸氨基氮的回收率=
VNaoH*0.0200mol/L 理论计算值
*14.008
理论计算值:取用氨基酸的体积乘以浓度,再乘以14.008 VNaoH 两次测定所用氨基酸的体积的平均值
13
每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为
式中：V1为滴定样品消耗氢氧化钠的体积（ml）； V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）； MNaOH 标准NaOH溶液的摩尔浓度
14
思考题
1、甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么？ 2、根据滴定结果，总结分析此法在实际应用中的
优缺点。 3、为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的—N+H3基上
的H+，不能用一般的酸碱指示剂？
15
8
若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基 酸的含量。若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由 此法算出氨基酸的含量。 脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低； 酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
实验结果:
丙氨酸 苯丙氨酸 天冬氨酸
L/㎝ d/㎝ Rf
原点到溶剂前沿距离为L，原点到层析点中心距离为d
6
氨基酸的定量分析 —甲醛滴定法
一、目的：
初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点
7
二、实验原理
水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基 。甲醛可与氨 基酸上的 —N+H3结合，形成 —NH—CH2OH、—N(CH2— OH)2 等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定 N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。
12
五、计算
标准甘氨酸氨基氮的回收率=
VNaoH*0.0200mol/L 理论计算值
*14.008
理论计算值:取用氨基酸的体积乘以浓度,再乘以14.008 VNaoH 两次测定所用氨基酸的体积的平均值
13
每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为
式中：V1为滴定样品消耗氢氧化钠的体积（ml）； V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）； MNaOH 标准NaOH溶液的摩尔浓度
14
思考题
1、甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么？ 2、根据滴定结果，总结分析此法在实际应用中的
优缺点。 3、为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的—N+H3基上
的H+，不能用一般的酸碱指示剂？
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若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基 酸的含量。若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由 此法算出氨基酸的含量。 脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低； 酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。
氨基酸分析检测方法ppt课件
氨基酸分析检测方法
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1
分光光度法
• 物质对光的选择性吸收 • 只有芳香族氨基酸在紫外区有吸收。 • 通常利用氨基酸与衍生剂反应生成有色物
质。 • 常用的衍生化试剂：茚三酮 • 其它试剂：乙酰丙酮－甲醛等
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2
气相色谱法
• 将氨基酸衍生为易气化的物质，利用气态 试样中各组分在两相间的分配系数不同进 行分析。
• 衍生化方法：硅烷化、酯化和酰化等
• 不能用一根色谱柱实现全氨基酸测定，应 用不广泛。
• 气质联用除了可以测定浓度外还可以发现 新的氨基酸。
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3
液相色谱法
• 各组分在两相间分配系数不同，经过反复的吸附 －解吸附过程对其进行分离检测。
• 柱后衍生法：高效离子交换色谱柱后茚三酮衍生 法。
• 柱前衍生法： • A、紫外可见光检测器 • B、荧光检测器 • C、质谱检测器 • D、积分脉冲安培检测技术 • E、蒸发发散射检测技术
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7
荧光光谱法
• 大多数氨基酸本身不发荧光，但与乙酰丙 酮－甲醛体系反应有强荧光。
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感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络， 如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！
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4
毛细管电泳法
• 高压电场的驱动下据各组分间分配行为上 的差异实现分离。具进样少、绝对灵敏度 及分辨率高。无须梯度洗脱，分析速度快。
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5
近红外光谱法
• 用统计学方法在样品待测属性值与近红外 光谱数据间建立一个关联模型而间接对待 测物质进行定量分析。
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• 物质对光的选择性吸收 • 只有芳香族氨基酸在紫外区有吸收。 • 通常利用氨基酸与衍生剂反应生成有色物
质。 • 常用的衍生化试剂：茚三酮 • 其它试剂：乙酰丙酮－甲醛等
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气相色谱法
• 将氨基酸衍生为易气化的物质，利用气态 试样中各组分在两相间的分配系数不同进 行分析。
• 衍生化方法：硅烷化、酯化和酰化等
• 不能用一根色谱柱实现全氨基酸测定，应 用不广泛。
• 气质联用除了可以测定浓度外还可以发现 新的氨基酸。
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液相色谱法
• 各组分在两相间分配系数不同，经过反复的吸附 －解吸附过程对其进行分离检测。
• 柱后衍生法：高效离子交换色谱柱后茚三酮衍生 法。
• 柱前衍生法： • A、紫外可见光检测器 • B、荧光检测器 • C、质谱检测器 • D、积分脉冲安培检测技术 • E、蒸发发散射检测技术
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• 大多数氨基酸本身不发荧光，但与乙酰丙 酮－甲醛体系反应有强荧光。
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毛细管电泳法
• 高压电场的驱动下据各组分间分配行为上 的差异实现分离。具进样少、绝对灵敏度 及分辨率高。无须梯度洗脱，分析速度快。
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近红外光谱法
• 用统计学方法在样品待测属性值与近红外 光谱数据间建立一个关联模型而间接对待 测物质进行定量分析。
氨基酸的测定--纸层析法
【实验目的】1. 学习氨基酸纸层析法的基本原理2. 掌握氨基酸纸层析的操作技术【实验原理】层析分离技术是利用被分离的混合物中各组分物理化学的性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相（流动相和固定相）中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，从而达到分离。
纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。
在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值（rat e of flow, Rf）来表示。
所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值：物质的移动速率以 R f 值表示： Rf=原点至层析点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离=X/ Y在一定条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
【器材与试剂】（一）器材 1. 层析缸 2. 点样毛细管 3. 小烧杯 4. 培养皿 5. 量筒 6. 喷雾器 7. 吹风机（或烘箱）8. 层析滤纸（新华一号）9. 直尺及铅笔(二) 试剂1. 扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液)2. 氨基酸溶液3. 显色剂:茚三酮溶液【实验步骤】1.准备滤纸:在纸的一端距边缘2～3㎝处用铅笔划一条直线，间隔2㎝作一记号。
2.点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在标记的位置上，点样时，毛细管口应与滤纸轻轻接触，样点直径一般控制在 0.3cm 之内。
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2.点样
毛细管点样：毛细管与板（纸）垂直， 点样位置、点样距离：不被展开剂浸泡、以显色后点之间易分开为准。 点样量、样品浓度：轻轻点一次即可。 本次实验：点三个样品——两个标准样品，一个混合样品
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3.展开
将薄层板斜放入层析缸中（或将滤纸挂在层析缸中），层析缸中流 动相（展开剂）的量以不浸泡样点为宜。有些层析缸如下图，易进 行先饱和后展开操作，提高重现性和避免边缘现象。
4
纸色谱、薄层色谱的一般操作步骤
5
滤纸芯儿的制作
将一个1.5cm 长、1cm 宽的滤纸，剪成扇子状，并卷 起来
6
在滤纸中央，用铅笔画一个半径0.5cm的圆圈（直径一角硬 币大小）。
在圆圈中心扎一个孔，插入准备好的滤纸芯儿。 插入时，滤纸芯的扇花部分插进滤纸孔一小部分，以盖到培 养皿上方时不碰到液体为准。
充满蒸馏水的试管时，观察零度时视场亮度是否一致。
如不一致，说明有零位误差，应在测量读数中减去或加
上该偏差值。
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②测定旋光读数：转动度盘、检偏镜、在视场中觅得亮度一 致且暗的位置，再从度盘上读数。读数是正（顺时针方向旋 转）的为右旋物质，读数是负（逆时针方向旋转）的为左旋 物质。
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提问与回答
用思想传递正能量
滤纸，用铅笔画出展开剂前沿线。
5.去溶剂：烘干
展开剂前沿线
饱和
展开
画出展开剂前沿
10
4.显色
可见光下观察 紫外灯下观察 显色剂显色： 通用：10% 硫酸乙醇溶液；碘蒸气；
大部分有机样品：磷钼酸/乙醇溶液 专用： 碘化铋钾 —生物碱；
三氯化铁 —黄酮； 茚三酮 — 氨基酸
显色操作：将茚三酮喷至滤纸润湿，不易流淌
边缘现象：两边高
9
本次纸色谱实验展开步骤：
1.在培养皿中加入适量展开剂
2.把点好样的滤纸放到培养皿上，注意滤纸芯儿不能碰展开剂。盖上培养皿
饱和5~10分钟。
3.把滤纸芯儿压下去，使滤纸芯儿的另一端稍微扇开，并接触展开剂，开始
展开左右时，停止展开，立即取出
11
5.计算比移值
Rf 值的意义： 定性分析的指标
评价展开剂选择是否合适、评价分离效果
薄层层析：Rf 纸 层 析：Rf
0.30～0.80， △Rf ≥0.05 0.05～0.85， △Rf ≥0.05
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2、影响旋光度的因素 测定波长、浓度、测定管长度、溶剂、温度
比旋光度
：旋光管长度，dm
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结束语
感谢参与本课程，也感激大家对我们工作的支持与积极 的参与。课程后会发放课程满意度评估表，如果对我们
课程或者工作有什么建议和意见，也请写在上边
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感谢观看
The user can demonstrate on a projector or computer, or print the presentation and make it into a film
氨基酸的纸层析 糖旋光度的测定
1
整体概述
概述一
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概述二
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概述三
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2
实验目的：
1.学习纸层析分离技术。 2.学习旋光度测定技术。
3
一、氨基酸的纸色谱
纸色谱：（纸上层析）属于分配色谱的一种。主要用于多功 能团或高极性化合物如糖、氨基酸等的分析分离。 滤纸为载体，固定相为滤纸上的水分，流动相（展开剂） 为用水饱和过的有机溶剂。 操作技术：上行法、下行法、环行法
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4、旋光仪的使用和旋光度的测定方法
1）按通电源，预热约5min
2）零点误差校正
选定并清洗测定管：用水洗（留意密封垫和玻璃透光片，
不要宁得太紧，否则读数不准）
装入水：排气泡，旋上螺盖（不易过紧）
放入样品管槽：玻璃泡部位在上部
①调零点视野确定零点误差：数值与误差方向
检查旋光仪零位是否准确，即在旋光仪未放试管或放进
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2.点样
毛细管点样：毛细管与板（纸）垂直， 点样位置、点样距离：不被展开剂浸泡、以显色后点之间易分开为准。 点样量、样品浓度：轻轻点一次即可。 本次实验：点三个样品——两个标准样品，一个混合样品
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3.展开
将薄层板斜放入层析缸中（或将滤纸挂在层析缸中），层析缸中流 动相（展开剂）的量以不浸泡样点为宜。有些层析缸如下图，易进 行先饱和后展开操作，提高重现性和避免边缘现象。
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纸色谱、薄层色谱的一般操作步骤
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滤纸芯儿的制作
将一个1.5cm 长、1cm 宽的滤纸，剪成扇子状，并卷 起来
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在滤纸中央，用铅笔画一个半径0.5cm的圆圈（直径一角硬 币大小）。
在圆圈中心扎一个孔，插入准备好的滤纸芯儿。 插入时，滤纸芯的扇花部分插进滤纸孔一小部分，以盖到培 养皿上方时不碰到液体为准。
充满蒸馏水的试管时，观察零度时视场亮度是否一致。
如不一致，说明有零位误差，应在测量读数中减去或加
上该偏差值。
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②测定旋光读数：转动度盘、检偏镜、在视场中觅得亮度一 致且暗的位置，再从度盘上读数。读数是正（顺时针方向旋 转）的为右旋物质，读数是负（逆时针方向旋转）的为左旋 物质。
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提问与回答
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滤纸，用铅笔画出展开剂前沿线。
5.去溶剂：烘干
展开剂前沿线
饱和
展开
画出展开剂前沿
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4.显色
可见光下观察 紫外灯下观察 显色剂显色： 通用：10% 硫酸乙醇溶液；碘蒸气；
大部分有机样品：磷钼酸/乙醇溶液 专用： 碘化铋钾 —生物碱；
三氯化铁 —黄酮； 茚三酮 — 氨基酸
显色操作：将茚三酮喷至滤纸润湿，不易流淌
边缘现象：两边高
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本次纸色谱实验展开步骤：
1.在培养皿中加入适量展开剂
2.把点好样的滤纸放到培养皿上，注意滤纸芯儿不能碰展开剂。盖上培养皿
饱和5~10分钟。
3.把滤纸芯儿压下去，使滤纸芯儿的另一端稍微扇开，并接触展开剂，开始
展开左右时，停止展开，立即取出
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5.计算比移值
Rf 值的意义： 定性分析的指标
评价展开剂选择是否合适、评价分离效果
薄层层析：Rf 纸 层 析：Rf
0.30～0.80， △Rf ≥0.05 0.05～0.85， △Rf ≥0.05
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2、影响旋光度的因素 测定波长、浓度、测定管长度、溶剂、温度
比旋光度
：旋光管长度，dm
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氨基酸的纸层析 糖旋光度的测定
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实验目的：
1.学习纸层析分离技术。 2.学习旋光度测定技术。
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一、氨基酸的纸色谱
纸色谱：（纸上层析）属于分配色谱的一种。主要用于多功 能团或高极性化合物如糖、氨基酸等的分析分离。 滤纸为载体，固定相为滤纸上的水分，流动相（展开剂） 为用水饱和过的有机溶剂。 操作技术：上行法、下行法、环行法
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4、旋光仪的使用和旋光度的测定方法
1）按通电源，预热约5min
2）零点误差校正
选定并清洗测定管：用水洗（留意密封垫和玻璃透光片，
不要宁得太紧，否则读数不准）
装入水：排气泡，旋上螺盖（不易过紧）
放入样品管槽：玻璃泡部位在上部
①调零点视野确定零点误差：数值与误差方向
检查旋光仪零位是否准确，即在旋光仪未放试管或放进