第九章细菌感染的分子生物学检验
真菌与其他病原体的分子生物学检验
新型隐球菌为单倍体，基因组约
20Mb,G+C含量46.0%-49.8%，共有14条 染色体，分8个基因型。
采用墨汁染色可发现隐球菌，但极易误 诊。真菌培养是确诊的 “金标准”，但 培养的阳性率不高。
血清学检测方法主要是检测隐球菌的荚 膜多糖特异性抗原。
沙眼衣原体（CT）
根据其外膜蛋白的抗原部分分为18个血清型。 CT含有DNA和RNA两种核酸。
染色体长度多态性现象, 抗 原 （ BDG ） 和 鹅口疮
基因组中碱基的转换率 （GM）
酵母菌性阴道炎
和颠换率约是1/273
单倍体
墨汁染色
检测荚膜多糖特异性抗 原
新型隐球菌性脑膜炎或肺 炎
含有DNA和RNA两种核酸
依据膜蛋白MOMP进行 分型
沙眼，包涵体眼结膜炎等
双链环状DNA
特 异 性 抗 原 为 98KD 的 MOPO
分子生物学检验方法与传统的检验方法相比 具有简便、快速、灵敏、特异的优点，其临 床意义在于：
1.对真菌及其他病原体感染的早期诊断
2.从分子水平研究真菌及其他病原体的耐药 机制，指导临床合理用药。
3.适用于真菌及其他病原体的分型。
4.从分子水平对真菌及其他病原体感染进行 流行病学调查。
真菌及其他病原体
Tox染色体DNA均为单倍体，约70Mb, G+C含量为55%。
弓形虫有5种不同的形态阶段：滋养体 （速殖子）、包囊、裂殖体、配子体 和卵囊。
以往诊断弓形虫感染主要依靠从患者 组织中发现弓形虫速殖子或包囊，或 用血清学试验检查特异性表膜抗原蛋 白。
疟原虫是引起人体疟疾的病原体，寄生于人体 的疟原虫有4种：恶性疟原虫、间日疟原虫、三 日疟原虫和卵形疟原虫。
感染性疾病的分子生物学检验
Molecular diagnosis for infectious diseases
感染的慨念
感染是病原体和人体之间的相互作用过程 病原体：衣原体、螺旋体、病毒、细菌、真菌、原虫、寄生虫 病原微生物：致病菌（条件致病菌）
共
生
微 生
状
物
态
人
体
微
生
物
不
人
同
体
的
感
染
状
态
HBV DNA检测（PCR） PCR 引物是PCR扩增的关键，决定扩 增的特异性和敏感度。PCR引物常根据 其S、C、P和X基因中的高度保守序列 来设计。
部分常用的引物序列
扩增位置 P、X基因特
异片段
Ｃ基因特异 片段
Ｃ基因特异 片段
引物序列 5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’ 5’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’ 5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’ 5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’ 5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’ 5’-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3’
扩增片段大小(bp) 278
477
258
HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）
进行HBV DNA检测的同时使其进行相对的量化 更直接了解乙肝患者体内HBV的复制及传染性，能 准确地反映出HBV DNA的复制水平、病程变化和治 疗恢复情况等。
其特异性高，灵敏度可达0.01fg，检测范围为 2.5×102～2.5×109copies/ml。
细菌分子生物学鉴定
是的，要做PCR。
首先你要提出细菌的DNA。
方法如下：1、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min）培养16小时。
吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP 管中，再加甘油（30-40%）进行保种。
（-80摄氏度保藏2年）2、提取DNA（CTAB法）：（1）取1.5ml菌液于1. 5ml离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。
（2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。
（3）加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），溶菌酶3ul，混匀，于50℃温育1h。
（4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl 溶液，混合后再65℃温育30min。
（6）冷却后加入等体积的酚(沉淀蛋白质)：氯仿：异戊醇（增强酚的作用）（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的EP管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。
（7）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12000r/min 离心5min将上清液转移到新的EP管。
（纯化作用）（8）加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min离心15min弃上清。
（9）向离心管中加入75%乙醇，12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。
（10）加入50ul（双蒸水）/ TE Buffer溶解DNA于4℃保存。
（11）电泳检测6、PCR扩增：（细菌的通用引物为27F和1492R）将提取得到的DNA 进行PCR扩增，电泳检测扩增得到的16S rDNA（如果菌类分明，条带清晰，PCR原液可直接送去测序，双向测通，得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对，得出鉴定结果）7、酶切带型分型确定操作单元：将扩增产物用HhaI和HaeIII两种限制性内切酶进行酶切，电泳检测酶切产物，酶切带型相同的分为一个操作单元。
分子生物学鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
分子生物学鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法
基因组测序技术
Sanger测序
基于双脱氧核苷酸链终止法的第一代测序 技术，具有读长长、准确性高的特点。
第二代测序技术
如Illumina测序，采用边合成边测序的原 理，具有高通量、低成本的优势。
第三代测序技术
如PacBio测序和Oxford Nanopore测序 ，具有长读长和实时测序的特点。
利用质谱仪对细菌代谢物 进行分离和检测，获得代 谢物的质荷比和相对丰度 信息。
核磁共振技术
通过核磁共振仪对细菌代 谢物进行分析，获得代谢 物的结构和浓度信息。
色谱技术
利用色谱柱对细菌代谢物 进行分离，结合检测器对 代谢物进行检测和定量。
代谢组数据分析
数据预处理
对原始数据进行去噪、归一化、 标准化等处理，提高数据质量。
转录因子与靶基因分析
预测转录因子与靶基因的相互作用， 解析转录调控网络。
功能注释与富集分析
对差异表达基因进行功能注释，揭示其在 细菌生理过程中的作用，并通过富集分析 确定显著富集的生物学过程或通路。
转录组学在细菌鉴定和分类中的应用
物种鉴定
通过分析特定基因或基因集合的
表达模式，可以对细菌进行物种
水平的鉴定。
基因组比较分析
全基因组比对
通过比对不同细菌的全基 因组序列，揭示基因组间
的共线性和重排事件。
基因家族分析
鉴定不同细菌基因组间共 享的基因家族，以及特定
细菌特有的基因家族。
比较基因组学
基于大量细菌基因组数据 ，研究基因组的进化、功
能和多样性。
03
细菌转录组学
转录组测序技术
01
02
细菌感染的分子生物学检验
第二节 结核分枝杆菌的分子生物学检验
结核分枝杆菌(TB)，简称结核杆菌，是引起结核 病的病原体。随着抗结核药物的不断发展和卫生 生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度 大幅下降。近年，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐 药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困 及人口广泛流动等因素，全球范围内结核病的疫 情死灰复燃。 据WHO统计，全世界约1/3的人感染了结核分枝 杆菌，在某些发展中国家成年人中群中结核分枝 杆菌携带率高达80%，其中的5%~10%携带者可 发展为活动性结核病。
TB是一种革兰氏阳性菌，G+C含量高，其细胞壁 除肽聚糖层外，还含有另外一层由特殊脂质、糖 脂和多糖组成的附加层。TB呈细长略弯曲，常聚 集成团，用抗酸性染色被染成红色。
对养要培求特殊条件，一 般要经4-6周才出现肉眼可 见的菌落。TB通过呼吸道、 消化道和破损的皮肤粘膜 侵入机体，它被吞噬后能 在吞噬细胞内繁殖，导致 巨噬细胞裂解，还可在细 胞外繁殖。
6、扩增结核分枝杆菌直接试验（ AMTDT）
AMTDT以结核分枝杆菌的16SrRNA为扩增模板，采 用转录介导的扩增技术对靶核酸进行扩增，采用化 学发光物吖啶酯标记的cDNA探针与扩增的靶基因杂 交，探针与扩增产物杂交后利用杂交保护试验除去 未杂交的标记探针，最后利用化学发光仪检测化学 发光信号。
结核分枝杆菌天然地对很多抗生素有抵抗力，使得 治疗极其困难。该菌的药物抵抗力主要由于其具有 高度疏水的细胞壁充当渗透屏障。同时，在基因组 中还发现有许多药物抗性决定因子的编码序列，包 括水解酶或者药物修饰酶，例如乙酰转移酶和很多 药物外排泵系统。
抵抗力特点：“三耐四敏” ※耐干燥、耐酸碱、耐孔雀绿（1：13000） ※对湿热、70％乙醇、紫外线、常用抗结核药物（但长
感染性疾病的分子生物学检验
THANKS.
免疫治疗
利用患者自身的免疫系统，通过免疫调节和免疫细胞治疗等方法，提 高患者的免疫力，控制感染性疾病的发展。
加强国际合作与交流
跨国合作研究
加强国际间的合作与交流，共同开展 感染性疾病的分子生物学研究，共享 研究成果和技术资源。
学术交流平台
建立国际性的学术交流平台，促进各 国学者之间的学术交流和技术合作， 推动感染性疾病的分子生物学检验领 域的快速发展。
耐药性分析
对于已经产生耐药性的病原体，分子生物学检验可以帮助分析其耐药机制，为 临床治疗提供参考。
展望与未来发展方
05
向
新技术的研发与应用
1 2 3
基因组学技术
利用新一代测序技术，对感染性疾病的基因组进 行全面解析，为疾病的诊断、治疗和预防提供更 精确的信息。
蛋白质组学技术
研究感染性疾病发生发展过程中蛋白质的表达和 功能变化，为药物研发和个性化治疗提供有力支 持。
VS
详细描述
蛋白质组学技术包括蛋白质分离、质谱分 析和功能研究等方面。通过对感染性疾病 患者体内蛋白质的表达谱进行分析，有助 于揭示感染性疾病的发病机制、疾病进程 和耐药性机制。蛋白质组学技术为感染性 疾病的诊断和治征
细菌性感染的分子生物学特征
详细描述
PCR技术利用特定的引物和耐高温的DNA聚合酶，通过循环加热和冷却的过程， 将特定的DNA片段进行指数级扩增，从而实现对微量DNA的检测。PCR技术在 感染性疾病诊断中具有高灵敏度和特异性，可检测出极低浓度的病原体DNA。
基因测序
总结词
基因测序是通过测定DNA序列，对感染性疾病进行诊断和溯源的技术。
详细描述
基因测序能够测定病原体全基因组的序列，提供关于病原体种属、基因型、耐药性等重要信息。通过比较不同病 原体基因组的序列差异，有助于追踪疾病的传播途径和溯源。基因测序在感染性疾病的防控、诊断和治疗中具有 重要意义。
菌种鉴定的分子生物学方法
菌种鉴定的分子生物学方法——16S rDNA 测序鉴定菌种一． 原理细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA 。
5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。
而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。
在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补，而细菌的16S rDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。
因此，16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
二． 技术路线该方法包括细菌基因组DNA 提取、16S rDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
具体技术路线如下：三． 方法步骤（一）细菌基因组DNA 提取（酶解法）1. 挑取单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。
细菌培养液基因组DNADNA 提取PCR 扩增16S rDNA 片段片段回收连接克隆载体阳性克隆鉴定 测序2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
感染性疾病的分子生物学检验 医学课件
感染性疾病的分子生物学检验
Molecular diagnosis for infectious diseases
1
分子生物学检验 ∙
感染的慨念
感染是病原体和人体之间的相互作用过程 病原体：衣原体、螺旋体、病毒、细菌、真菌、原虫、寄生虫 病原微生物：致病菌（条件致病菌）
共
生
微 生
潜伏感染期间，病原体一般不排出体外 病原携带状态 ------ 可以没有临床症状，而能排出病原体
带病原体的种类不同：带病毒者、带菌者与带虫者 不同携带状态 潜伏期携带者、健康携带者、急性与慢性
携带者 是很多传染病的重要传染源
3
分子生物学检验 ∙
感染性疾病的分子生物学检验策略
一般性检出策略（检出病原体）：
判断有无感染 是何种病原体感染 常用方法：PCR ＋ 杂交
完整性检出策略：
检出病原体 分型（分类）－亚型－耐药性 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序
4
分子生物学检验 ∙
感染性疾病分子生物学检验标志物
病原体核酸分子（DNA/RNA）
基因表达产物
代谢物
免疫应答分子 细
致敏T细胞
状
物
态
人
体
微
生
物
不
人
同
体
的
感
染
状
态
在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生
2
分子生物学检验 ∙
感染后果（转归）
病原体被清除 ------ 通过非特异性或特异性免疫 隐性感染 ------ 是感染过程中最常见的类型 显性感染（临床感染） ------ 感染致病，慢性感染引起炎症 潜伏性感染
9细菌感染的分子生物学检验
gyrA、parC基因
gyrA基因突变→DNA旋转酶结构改变→阻止氟喹诺酮类 药物进入霸位（低、中水平耐药）
gyrA、parC基因突变：高水平耐药
penA、ponA基因突变 → 编码的青霉素结合蛋白结 构改变 → 酶与青霉素的亲和力下降
31
NG的分子生物学检验内容
耐氟喹诺酮类药
gyrA基因突变 → DNA旋转酶上氟喹诺酮类药物 结合位点构象改变
23
分子生物学技术检测TB耐药性
DNA测序 PCR-SSCP(单链构象多态性)：PCR + 核酸电泳 PCR-RFLP：PCR + 酶切 PCR-RDB(反向点杂交) 基因芯片
24
TB分子生物学检验的临床意义
探针的种类有：全染色体DNA、染色体克隆片段DNA、质粒 DNA、rRNA基因、寡核苷酸等
核酸扩增技术：是分子生物学中最具有重大意义的技术之 一。方法有聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应等。以 PCR最为广泛应用。
PCR技术在细菌的快速检测、细菌的毒素基因检测、细菌的 耐药性检测及感染细菌的流行病学调查中得到日益广泛的应用
青霉素、四Hale Waihona Puke 素、环丙沙星、头孢克肟27
淋病奈瑟菌
传统检测方法
直接图片镜检：灵敏度、特异性差 分离培养法：诊断金标准。对标本、培养基要求高，
周期长 免疫学方法：非特异性反应严重，稳定性差
28
NG的基因组结构特征
淋球菌FA1090, 最早被测序 染色体DNA长2.15Mbp，编码区占78% 2069个基因
19
TB的分子生物学检验内容
TB核酸检测
PCR real-time PCR PCR-RFLP：PCR + 酶切 线性探针杂交：PCR + 杂交 + 显色 链替代扩增技术 扩增TB直接试验 基因芯片 GeneXpert全自动结核检测平台
分子生物学检验完整版
分子生物学检验完整版分子生物学检验是一门在生命科学领域中具有重要地位的学科，它通过对生物大分子，如核酸和蛋白质的研究和分析，为疾病诊断、遗传咨询、法医学鉴定、农业和畜牧业的改良等众多领域提供了关键的技术支持和科学依据。
首先，让我们来了解一下分子生物学检验的基本原理。
其核心在于利用分子生物学的技术手段，对生物样本中的核酸（DNA 和 RNA）和蛋白质进行检测和分析。
DNA 是遗传信息的携带者，它的序列和结构变化能够反映出个体的遗传特征、疾病易感性以及疾病的发生发展过程。
RNA 则在基因表达调控中起着重要作用，对 RNA 的分析可以帮助我们了解基因的活性和表达水平。
而蛋白质作为生命活动的执行者，其种类、数量和结构的变化也与各种生理和病理过程密切相关。
在实际应用中，分子生物学检验涵盖了众多技术方法。
其中，聚合酶链式反应（PCR）技术是最为常见和重要的之一。
PCR 能够在体外快速扩增特定的 DNA 片段，使其数量达到可检测的水平。
通过设计针对特定基因或序列的引物，PCR 可以用于检测病原体的存在、基因突变的鉴定以及基因分型等。
实时荧光定量 PCR 技术则在 PCR 的基础上，实现了对扩增产物的实时定量监测，大大提高了检测的准确性和灵敏度。
另一个重要的技术是核酸杂交。
它基于核酸分子碱基互补配对的原理，通过将待测核酸与已知序列的探针进行杂交，从而检测待测样本中是否存在特定的核酸序列。
这种技术在基因诊断、病毒检测以及遗传性疾病的筛查中发挥着重要作用。
除了核酸检测，蛋白质的分析也是分子生物学检验的重要组成部分。
蛋白质免疫印迹（Western blotting）技术可以检测特定蛋白质的表达水平和分子量。
酶联免疫吸附测定（ELISA）则能够对蛋白质进行定量分析，广泛应用于疾病标志物的检测和药物研发等领域。
在疾病诊断方面，分子生物学检验展现出了巨大的优势。
例如，对于传染病的诊断，它可以快速准确地检测出病原体的核酸，如新型冠状病毒的核酸检测，为疫情防控提供了有力的支持。
分子生物学技术在细菌分子特征鉴定中的应用
分子生物学技术在细菌分子特征鉴定中的应用细菌是普遍存在于地球上的微生物，它们可以在环境中起着重要的作用。
但是，某些细菌可以引起疾病，导致健康问题。
鉴定细菌种类和特征对于诊断疾病和预防传染病至关重要。
近年来，分子生物学技术在细菌分子特征鉴定中的应用得到了长足的发展。
本文将探讨分子生物学技术在细菌分子特征鉴定中的应用，并介绍其在健康领域的重要性。
一、分子生物学技术介绍分子生物学技术是一系列基于分子水平的实验方法，用于探讨生命的分子基础。
其中，PCR(聚合酶链式反应)和DNA测序被广泛应用于检测和鉴定细菌种类和特征。
PCR是一种快速、高灵敏度和高特异性的DNA扩增技术，可以在短时间内扩增极少数量的DNA模板。
DNA测序技术可以解读DNA序列，进一步了解DNA之间的相互作用和功能。
二、PCR在细菌鉴定中的应用PCR技术特别适用于细菌鉴定。
目前，常用的PCR技术有16S rRNA PCR、18S rRNA PCR、ITS PCR、gyrB PCR和groEL PCR等。
其中，16S rRNA PCR被广泛应用于细菌鉴定中，因为16S rRNA在细菌中存在着高度保守性。
此外，16S rRNA PCR还有以下优点：(1)细菌基因组中16S rRNA序列长度大约为1500 bp，便于PCR扩增；(2)细菌的16S rRNA序列在不同物种之间具有较大差异性，具有很强的特异性；(3)16S rRNA序列具有足够的变异性，可以用于构建系统发生树和分析细菌进化关系。
三、DNA测序在细菌鉴定中的应用除了PCR技术，DNA测序也被广泛应用于细菌鉴定。
DNA测序技术包括Sanger测序和高通量测序。
Sanger测序是一种传统的DNA测序方法，它可以测序较小的DNA材料。
高通量测序则是一种新的DNA测序方法，它可以同时快速测序数百万条DNA序列。
DNA测序技术可以用于鉴定细菌物种和检测细菌基因组中的不同。
例如，在细菌群体中检测特定基因、分析基因组结构和比较基因组表达的差异性。
细菌感染分子生物学检验课件
个性化治疗：根据 个体基因和健康状 况进行个性化治疗，
提高治疗效果
谢谢
02
细菌感染分子生物学检验可以区分不同类型的细菌感染，为治疗提供依据。
03
细菌感染分子生物学检验可以监测细菌耐药性，为抗生素治疗提供指导。
04
细菌感染分子生物学检验可以辅助诊断免疫缺陷病，为免疫治疗提供依据。
病原体研究
细菌分类：通过分子生物学方法对细 01 菌进行分类和鉴定
耐药性研究：研究细菌对抗生素的耐 0 2 药性机制，为临床治疗提供指导
04
代谢组学：研 究代谢物的种 类、含量和变
化规律
02
转录组学：研 究基因表达和
调控机制
05
系统生物学： 研究生物系统 的结构和功能
关系
03
蛋白质组学： 研究蛋白质的 结构、功能和
相互作用
06
合成生物学： 设计和构建新 的生物系统或
生物部件
3
细菌感染分子生 物学检验的应用
临床诊断
01
细菌感染分子生物学检验可以用于快速诊断细菌感染，提高诊断准确性。
于检测细菌的基因序列
和表达情况
基因测序技术：如二代 3 测序、三代测序等，用 于检测细菌的基因组序 列
生物信息学方法：如序
4
列比对、基因注释等，
用于分析细菌的基因功
能和进化关系
比较与优势
传统检测方法：培养法、免疫学检测法等，耗时 长，灵敏度低
分子生物学检验方法：PCR、基因芯片等，快速、 灵敏度高，可检测多种细菌
RNA片段
03
qPCR技术：实时 荧光定量PCR，
用于定量检测 DNA或RNA片段
04
NASBA技术：核 酸序列扩增技术， 用于扩增RNA片
细菌感染分子生物学检验
利用分子生物学技术，可以对细菌进行快速、准确的检测，提高诊断效率。
03
细菌感染分子生物学检验可以提供更精确的诊断结果，为临床治疗提供依据。
04
检验方法
01
细菌培养：通过培养基培养细菌，观察其生长特性和形态特征
02
核酸杂交：利用核酸探针与细菌DNA或RNA杂交，检测特定基因的存在
03
基因测序：通过测序技术分析细菌的基因序列，了解其遗传特性
细菌感染分子生物学检验可以快速、准确地鉴定病原体
01
鉴定结果可用于指导临床治疗和预防
02
病原体鉴定有助于了解病原体的传播途径和流行病学特征
03
病原体鉴定有助于制定有效的防控措施和公共卫生政策
04
耐药性检测
STEP4
STEP3
STEP2
STEP1
检测方法：PCR、基因测序等
检测对象：细菌、病毒等病原体
应用：用于细菌感染诊断、耐药性检测、病原体鉴定等
技术类型：第二代测序技术（NGS）、第三代测序技术（PacBio）等
优点：速度快、准确率高、信息量大
生物信息学分析
生物信息学：研究基因、蛋白质等生物信息的学科
01
生物信息学分析技术：利用计算机技术对生物信息进行分析和处理
02Βιβλιοθήκη 应用领域：基因测序、蛋白质结构预测、药物设计等
03
优势：提高分析效率，降低成本，提高准确性
04
细菌感染分子生物学检验的应用
临床诊断
01
细菌感染分子生物学检验在临床诊断中的应用
02
细菌感染分子生物学检验在细菌感染性疾病诊断中的应用
03
细菌感染分子生物学检验在细菌耐药性检测中的应用
第九章 细菌感染的分子生物学检验
（5）耐乙胺丁醇分子机制：耐乙胺丁醇主要与操纵子 cmbB基因有关， cmbB突变导致糖基转移酶结构，影响 乙胺丁醇和糖基转移酶的结合而产生耐药，其中第306 位密码子的错义突变最为常见。 （6）耐氟喹诺酮类药物分子机制：氟喹诺酮类药物主 要靶位是结核杆菌的DNA旋转酶，该酶由gyrA和gyrB两 种基因编码的两个A亚单位和两个β亚单位组成。 其中编码的gyrA基因发生突变则导致氟喹诺酮类药物结 合位点构象改变，从而产生耐药性。 突变大多数发生在gyrA基因保守区67~106位密码子区， 常见有94位GAC→GCC或CAC或TAC， 90位GCC→GTG的突变。
目前结核杆菌常规检测方法
痰涂片法阳性率低，且易受非结核杆菌的污染。 培养法目前认为是诊断的“金标准”但结核杆菌 生长缓慢，不利于临床上的及时诊断和治疗。 清学试验由于分枝杆菌属各菌之间抗原有着广 泛的交叉，特异性不强。
一、结核分枝杆菌的基因组结构特征
TB H37Rv 全基因组为环状双链 DNA，长约4 411 529bp，共有 4000基因， G+C平均值65.6%， 其基因序列高度保守。 H37Rv 基因组中有50 个编码功能 RNA 的基因，其中 45 个 tRNA基 因，3 个 rRNA 基因和 2 个核稳定 （stable）RNA基因，这些 RNA 分子是由特异的核糖体RNA 操纵 子产生的。 在H37Rv 全基因组中有16个拷贝的IS6110插入序列和6个 拷贝的IS1018，大多数插入序列位于基因间或非编码区， 通常靠近tRNA基因聚集成串，插入序列在染色体中主要分 布在重复区。
（3）耐氨基糖苷类药物分子机制：耐链霉菌的结核杆菌 主要由于编码核算糖体16S rRNA的rrs基因与编码核糖体 蛋白S12的rpsL基因发生突变，从而降低了氨基糖苷类药 物结合到核糖体上的能力，形成耐药。 rpsL基因中编码第43位氨基酸的碱基A→G的突变是常见 的突变位点出。Rrs基因突变点为512、513位的碱基插 入，这些碱基突变均可导致高水平的耐药。 （4）耐吡嗪酰胺分子机制：吡嗪酰胺需经结核分枝杆菌 体内的吡嗪酰胺酶催化才能转变成具有活性的吡嗪酸。 耐吡嗪酰胺主要由 pncA 基因突变所造成的吡嗪酰酶的 蛋白结构改变，失去了将吡嗪酰胺转换成活性形式的能 力，形成耐药。
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临床分子生物学检验
第九章
细菌感染的分子生物学检验
湖南省中医药大学生化与分子生物学教研室 Jake Li
细菌感染是致病菌或条件致病菌入侵机体，并在机体 中生长繁殖，产生毒素或其他代谢产物所引起的全身 性感染，临床上以寒战、高热、关节疼痛等为特征， 部分患者还可以出现烦躁、四肢厥冷、发绀、呼吸加 速、血压下降、感染性休克等临床症状。
TB具有合成所有必需氨基酸、维生素和酶辅助因 子的潜在能力。该菌具有代谢各种各样碳水化合 物、乙醇、酮和羧酸的能力。此外，还具有许多 涉及脂代谢、糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸和 乙醛酸循环所必须的酶分子。
TB的培养特点：馋、懒、丑。 馋--营养要求较高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、 甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基（罗氏） 上才能生长良好。 懒--生长缓慢，14～18h分裂1次，在固体培养基 上2～5w才出现肉眼可见的菌落。 丑--典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透 明，乳白色或淡黄色，如菜花样。
一、细菌感染的一般性检出策略
细菌感染性的分子生物学检验的一般性检出就是以感 染病原体的特异核酸序列作为检测目标序列，利用分 子生物学技术对目标序列进行检测，从而直接判断有 无细菌感染和是何种病原体感染。
二、细菌感染的完整性检出策略
完整性检出策略，即不仅对病原体作出快速准确诊断， 还需要对其进行分型（包括亚型）和耐药性等方面的 检测，尽可能地为临床诊疗提供更为详尽的细菌病原 体的相关信息。
二、结核分枝杆菌的分子生物学检验内容
（一）结核分枝杆菌核酸的检测
可采用PCR、real-time PCR、PCR-RFLP、线性探针杂 交、链替代扩增技术、扩增结核分枝杆菌直接试验、基 因芯片技术、全自动结核检测平台等方法检测标本中的 TB DNA。 1、 PCR PCR扩增所选靶序列主要有65kD抗原基因、 MPB蛋白基因、rRNA基因、TB IS6110插入序列、染色 体DNA的重复序列等。常规PCR的不足：产物的交叉污 染、假阳性、假阴性、实验室污染。 2、real-time PCR 与传统PCR相比，具有敏感度、特 异性高及方便快速等优点，特别是对难以培养与生长缓 慢的结核杆菌的检测更有优势。
一、结核分枝杆菌的基因组结构特征
TB H37Rv 全基因组为环状双链 DNA，长约4 411 529bp，共有 4000基因， G+C平均值65.6%， 其基因序列高度保守。 H37Rv 基因组中有50 个编码功能 RNA 的基因，其中 45 个 tRNA基 因，3 个 rRNA 基因和 2 个核稳定 （stable）RNA基因，这些 RNA 分子是由特异的核糖体RNA 操纵 子产生的。
传统上对于细菌感染的病原体检测主要采用免疫学、 微生物学和血液学等相关技术，但这些技术方法受灵 敏度和特异性的限制，不易达到早期诊断。
利用分子生物学技术检验感染性病原体自身遗传物质 （RNA或DNA），从而达到早期、快速、敏感、特异 地检测已经成为临床检验的主流技术之一。
第一节 细菌感染的分子生物学检验策略
第二节 结核分枝杆菌的分子生物学检验
结核分枝杆菌(TB)，简称结核杆菌，是引起结核 病的病原体。随着抗结核药物的不断发展和卫生 生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度 大幅下降。近年，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐 药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困 及人口广泛流动等因素，全球范围内结核病的疫 情死灰复燃。 据WHO统计，全世界约1/3的人感染了结核分枝 杆菌，在某些发展中国家成年人中群中结核分枝 杆菌携带率高达80%，其中的5%~10%携带者可 发展为活动性结核病。
187个ORF参与脂类代谢、细胞壁合成， 360个参与细胞壁代谢， 66个参与脂类合成， 287个参与能量代谢， 95个参与氨基酸合成， 38个与细菌毒力相关， 69个参与DNA合成。
所编码的蛋白约有40%的为功能性蛋白，44%的 与已知蛋白有相似性信息，16%的则为未知蛋白。 TB不同菌株之间存在多个差异基因。 基因组中有3个毒力因子：mce、过氧化氢酶-过 氧化物酶和sigA。除了这些单基因毒力因子，细 菌的胞壁也对致病性起着重要的作用。
在H37Rv 全基因组中有16个拷贝的IS6110插入序列和6个 拷贝的IS1018，大多数插入序列位于基因间或非编码区， 通常靠近tRNA基因聚集成串，插入序列在染色体中主要分 布在重复区。
TB H37Rv 基因组中共有3924个开放阅读框，其 中91%有潜在的编码能力，ORF中最常见的起始 密码子61%为ATG，35%为GTG。
期使用易产生耐药性） 变异性 ※典型形态→耐药
目前结核杆菌常规检测方法
痰涂片法阳性率低，且易受非结核杆菌的污染。 培养法目前认为是诊断的“金标准”但结核杆菌 生长缓慢，不利于临床上的及时诊断和治疗。 血清学试验由于分枝杆菌属各菌之间抗原有着广 泛的交叉，特异性不强。
分子生物学检验是以核酸（DNA或RNA）或蛋 白质分子为检验目标，通过检查人体内源基因 或外源（病原体）基因的存在、缺陷或表达异 常，对人体状态或疾病作出特异性诊断的方法 和过程。
机体感染细菌后，应用分子生物学技术直接测 定这些细菌病原体基因，不仅可以对微生物感 染作出明确诊断，同时也能诊断出带菌者或潜 在性感染，还可以对感染性病原体进行分型和 耐药性监测。
结核分枝杆菌天然地对很多抗生素有抵抗力，使得 治疗极其困难。该菌的药物抵抗力主要由于其具有 高度疏水的细胞壁充当渗透屏障。同时，在基因组 中还发现有许多药物抗性决定因子的编码序列，包 括水解酶或者药物修饰酶，例如乙酰转移酶和很多 药物外排泵系统。
抵抗力特点：“三耐四敏” ※耐干燥、耐酸碱、耐孔雀绿（1：13000） ※对湿热、70％乙醇、紫外线、常用抗结核药物（但长
TB是一种革兰氏阳性菌，G+C含量高，其细胞壁 除肽聚糖层外，还含有另外一层由特殊脂质、糖 脂和多糖组成的附加层。TB呈细长略弯曲，常聚 集成团，用抗酸性染色被染成红色。
对养要培求特殊条件，一 般要经4-6周才出现肉眼可 见的菌落。TB通过呼吸道、 消化道和破损的皮肤粘膜 侵入机体，它被吞噬后能 在吞噬细胞内繁殖，导致 巨噬细胞裂解，还可在细 胞外繁殖。