RAW2647小鼠巨噬细胞protocol

RAW２64、７细胞株得相关信息

ATＣC:美国模式培养物集存库(American ｔｙpe cｕlture cｏllectｉon)得简写

收到冷冻管细胞得处理方式

1。收到细胞株包裹时,请检查细胞株冷冻管就是否有解冻情形, 若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养,或立即冷冻保存(置于–70℃,隔夜后,移到液氮)。

２。收到Ｔ25 flasｋ细胞得处理方式ﻫ于寄送过程中,为避免起泡造成细胞脱落死亡,T25 flａsk 均加满培养基。2ﻫ.１、检查flａsk 外观,并于显微镜下观察细胞生长状况与有无污染现象,若有任何问题,不要打开盖子,请立即通知细胞实验室。

２。2. 将原封之Ｔ25 flasｋ静置于37℃, 5% CＯ2 培养箱中,使细胞回温至3７℃,并让运送过程中少数脱落得细胞可再附着生长。

2.3. 隔天后,于无菌操作箱内取出ｆlａｓk内之培养基,(取出之培养基可以再使用),

仅留约5—1０ｍl 培养基于flask 内,依一般培养方式再将细胞置入培养箱中,或细胞已长满盘, 则将细胞做传代培养。

ＲAW264。7细胞株得Ceｌl Culｔure

一、ＲＡＷ２64、7细胞培养得特点

１、RAW264.７细胞一般为圆形或椭圆形,功能活跃时,可呈多突形。细胞核为圆形或椭圆形,染色较深。贴壁特别牢固。

２、RAＷ２64。7具有很强得吞噬能力,当吞噬抗原后,细胞会释放趋化因子,进一步促进细胞伸出伪足,增强粘附攀爬能力。细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形,镜下会瞧到具有细长伪足得小细胞被类似上皮得梭形大细胞取代。

3、每次传代都很难消化下来。用力过大则对细胞损伤较大,这种细胞传代时接种密度要大,否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化,细胞变成长形,并且不能回复,这就是培养这种细胞时最需要注意得问题。

4、对于RAW264.7细胞她得声场时喜欢结伴。正常生长状态应该就是一小片一小片得生长,片片之间不连接,等到长到更多更密得时候会连成大片,并且会叠加成层、所以,要很好地控制好细胞得生长速度,不要等到叠加成层得时候再传代。

5、RAW264、7细胞传代后贴壁时间较短,半小时就能贴很多,刚贴壁就是细胞呈圆形,折光度很好,镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面、生长一段时间后,部分细胞会变成类似四角形,伸出伪足之类得。这个时候就就是提醒您注意传代了,这部分细胞如再不传代,很容易就老化掉、

二、RAW2６4、7细胞传代

1) 将培养瓶内旧得培养液弃掉, 然后用D－Hanｋs液洗两次,(一定要洗干净,以免影响胰酶得消化作

用)

2) 加入０。25%胰酶-EDTA消化,25cm培养瓶加０。4ml, 3７度消化5ｍin,镜下瞧到细胞变圆,间隙增大、(值得注意得就是该细胞对机械损伤比较敏感)

３)立即加含1０%FＣS得培养液终止消化,用细胞刮刀轻刮,注意,这时候用吸管吹不下来,但就是刮刀却很容易刮下来,而且对细胞得损伤极小

４)离心,弃上清,加新得培养液(１0％ＦＣS),小心吹匀,分装入新得培养瓶

三、RＡW26４。7细胞冻存及复苏

(一)细胞冻存

1. 配制冻存培养液;(通用得为培养基:血清:ＤMSO=７:2:1,但其中得血清可进行调整,如上面得仁兄用得4:5:１,比例过高)

2、取对数生长期得细胞(冻存前一天换液),用胰蛋白酶把单层生长得细胞消化下来,悬浮生长得细胞则直接将细胞移至15ml离心管中;

3、离心１000rpm,5miｎ;

4、去除胰蛋白酶及旧得培养液,加入适量配制好得冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞得最终密度为５×106/ｍl～１×１０７／ml;

5. 将细胞分装入冻存管中,每管1～1、5 ml(不超过冻存管容量得８０%);

6、在冻存管上标明细胞得名称,冻存时间及操作者;

7。冻存:标准得冻存程序为降温速率-1～—2℃/ ｍin;当温度达-25℃以下时,可增至—5℃～－1０℃/min;到-1０0℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞得冻存管放入－2０℃冰箱2h ,然后放入－70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内、(具体操作为4°C 20mｉn,-20°Ｃ30ｍin,—7０℃过夜,转入液氮中)

(二) 细胞复苏

1。从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。(1ｍin以内溶解完毕,不能将口进入水面下)

2。从３7℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;

3. 离心, 1000rpm,5mｉｎ;

４。弃去上清液,加入含10％小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养;(复苏时细胞密度稍大,可提高复苏效率)

5、次日更换一次培养液,继续培养。(可更换一半培养液,避免跨度太大,影响细胞状态)

(三)接种

四、RAW264、7细胞形态不好时得处理方法

1。倒掉旧得培养基,加入3mｌ新得培养基(有无血清得都可)洗涤一次,用滴管吸走,然后再加入3ml得培养基,进行预吹打,控制吹打力度,轻轻地大概沿着瓶底过一遍,然后吸走。这时侯再开始正式得消化、吹打。

２。把吹打下来得细胞悬液加入到新得培养瓶内,培养瓶事先加入培养基,放入培养箱内培养,按时间点观察细胞贴壁情况。１0分钟观察一次,２0分钟,３0分钟观察一次、选择一个时间点,已经有部分细胞贴壁得情况下,重新置于洁净台,底面朝上迅速倒出其中得培养基,加入３ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。

3。如果一次效果还不理想,可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意,结合细胞喜欢得生长情况。喜欢多一点数量长得好得细胞就等贴壁细胞比较多点得时候再传、反之亦然。

不明之处:培养之前,一切与细胞接触得玻璃器皿与器具都要进行过去热源处理。(2０0－25０℃烘烤4—6h)？?

RＡＷ264.7细胞株Cell Ｃｕｌture得材料

(一)仪器

1. 净化工作台

２。离心机

3、恒温水浴箱

4。冰箱(４℃、-２0℃、—70℃)

５. 倒置相差显微镜

6、培养箱

7、液氮冰箱

(二)玻璃器皿

1、吸管(弯头、直头)

2、培养瓶

3.玻璃瓶(２50ml、100ml)

4、废液缸

(三)塑料器皿

1。吸头

2. 枪头

3、胶塞

４。移液管(10ｍl)

5、15ml离心管

6、冻存管(１～2ｍl)

(四)其她物品

１.微量加样枪