实验室与基本操作(植物组织培养)

1 实验室与基本操作(植物组织培养)

第一章实验室与基本操作

第一节实验室及其基本设备

实验室的大小取决于工作的目的和规模：

1.以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产影响效率。

2.在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。

实验室设计

标准的组织培养实验室包括：洗涤室(准备室)；配置室；灭菌室；接种室；培养室；观察室等

一、准备室

作用：材料、培养器械的清洗、培养基准备、灭菌等的准备工作。

普通化学实验室：仪器及设备、化学药品。

纯水仪、冰箱、移液枪、过滤灭菌器、电炉、微波炉、磁力搅拌器、低速台式离心机、电脑等作用：配制培养基。

洗涤室：清洗、贮存器皿设施、鼓风干燥箱等。作用：玻璃器皿、用具和培养材料的洗涤。

灭菌室：

①高压蒸气灭菌装置：如立式、卧式和手提式灭菌器。作用：培养基、器械、棉塞、无菌纸等灭菌消毒②细菌过滤器

作用：进行植物材料分离接种的重要场所，需长期的无菌操作，对

组织培养成功起关键作用。

试验设施；超净工作台；紫外灯；固定式和挪移式载物台；消毒器、广口瓶、酒精灯、酒精棉、机械支架；手术剪、解剖刀、解剖针、镊子等超净工作台(alaminarflowhood)

工作原理:利用鼓风机驱动空气通过高效过滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

作用：进行材料的培养的场所。其大小、规模可根据工作性质设定。以充分利用空间和节能为原则。

设备：可调控光、温、湿度等设备。还有固定式培养架、转床、摇床。合用于器官(芽、茎、花药等)、愈伤组织、细胞和原生质体的固体培养和液体培养。

作用：细胞学和组织学观察。

设备：需备有高倍显微镜、体视显微镜、倒置显微镜、各种相机、恒温箱、切片机、恒温水浴、滴瓶、染色缸、载玻片、盖玻片等。

作用：哺育组织与细胞培养出来的材料，组培苗的移栽锻炼。

第二节基本操作

1、重铬酸钾洗液：

饱和的重铬酸钾洗液： 43 克重铬酸钾溶于 1000 毫升蒸馏水中(饱和

溶液)。按 1：1 体积比将浓硫酸缓慢地倒入饱和重铬酸钾水溶液中。

流程：(12h)

水洗→晾干→重铬酸钾洗液→→ 自来水冲净、蒸馏水洗两次→干燥 2、洗涤剂：洗衣粉、洗液

3、超声波洗净器：小型玻璃器皿，顽强性污渍。超声波除污。(要

加水)新的玻璃器皿： 0.1﹪HCl 浸泡 12 小时，洗衣粉、自来水洗、蒸馏

水冲。污染的玻璃器皿：要先高压灭菌后，然后再刷洗。要避免交叉污染。

1、干热灭菌：利用鼓风干燥箱(烘箱)进行烘烤灭菌的方法。箱内

温度控制在150℃， 120min。玻璃器皿.2、湿热灭菌：利用高压蒸汽灭菌

的方法。普通温度为121℃，压力 0.1MPa，消毒 15~20min。培养基灭菌.

3、熏蒸灭菌：利用药物熏蒸以达到灭菌的目的。用甲醛内加入高锰

酸钾、百菌清、硫磺熏蒸。用 3%来苏尔溶液或者 1%漂白粉水溶液，或

者0.2% 过氧乙酸溶液喷洒、拖擦地板。培养室、接种室灭菌.

4、过滤灭菌：使溶液通过夹有微孔滤膜的漏斗，滤膜孔径需选用

0.3~0.45μm。在无菌环境下，用真空泵抽滤，其滤液为无菌。液体培养 (不耐高温活性物质)

5、药剂灭菌：用 70~75%酒精、 0.1~0.2%升汞、 10%的次氯酸钠、

新洁尔灭、 Cloro 某等药剂灭菌的方法。培养材料灭菌。 6、烧灼灭菌：

用酒精灯烧灼达到灭菌的目的。接种器具灭菌。

7、射线灭菌：用紫外线照射的方法灭菌。照射时间普通为 15~

30min。接种时应关闭紫外灯。室内灭菌。

1.接种室以及工作台灭菌：紫外灯 30 分钟，用时一定要关闭它。

2. 工作台消毒： 70%乙醇，用小型喷壶消毒或者棉球擦拭。

3.点燃酒精灯，开启灭菌器,对使用器械进行烧烤灭菌。器械冷却后

方可使用。

第三节培养基的配置

1、无机盐：包括大量元素( N，P，K，Ca、S、Mg)，微量元素( Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I)。

2、有机化合物：碳源(糖类)，维

生素类，有机含氮化合物。

3、植物生长调节物质：生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸等。

4、附加物类：琼脂，活性炭，椰乳，硝酸银等。

1、无机盐——大量元素和微量元素大量元素：

N：用量最多。常用的有硝态氮和铵态氮， KNO3、NH4NO3 植物组织，从培养基中吸收氮后形成蛋白质。 P：在植物组织培养在的细胞增殖分化大量需要。主要从 NaH2PO4、KH2PO4 供应。磷参预核酸、能量代谢。 K：直接影响培养物中酶的活性。主要由 KCl、KNO3 或者 KH2PO4 供应。

主要包括 Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I 等。植物对这些元素需要量甚微，稍多会发生毒害。 Fe 是用量较多的一种微量元素，对组织

中叶绿素的合成和延伸生长起重要作用。铁常以 FeSO4 和乙二胺四乙酸钠(Na2-EDTA)的螯合物存在于培养基中。

作用：维持培养基的合适渗透压对初生细胞和原生质体的完整性有十分重要作用。此外，糖类也是合成有机物的碳源。最常用有：蔗糖、葡萄糖、果糖、多糖、可溶性淀粉和糊精。作为氮源，蔗糖普通浓度为 2%~ 3%。

糖的浓度影响组织分化类型：

在高浓度(3%~4%)的蔗糖有利于韧皮组织分化；低糖浓度(1.5%~

2.5%)时，仅生长出木质部；适中浓度时形成具有木质部和韧皮部。

②维生素类

作用：直接参预生物催化剂(酶)的形成、蛋白质、脂肪代谢等重要生命活动。

③有机含氮化合物

氨基酸：常用的为：甘氨酸及酰胺类物质。如谷氨酰胺、天冬酰胺和多种氨基酸混合物。水解乳蛋白、水解酪蛋白。

3、植物生长调节物质①生长素：