冰冻切片实验步骤
冰冻切片操作流程
冰冻切片操作流程
1.包埋切片
将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天沉底，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。
取出组织，预冷PBS清洗后平放于软塑瓶盖或特制小盒内（比如用铝箔纸折成有口的方盒），加入适量OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。
2.固定
在冰冻切片机上切片，完成后用预冷的4%多聚甲醛室温固定
20-30min，冷水清洗3-5次，-20度保存。
3.冰冻切片机切片，厚度3-5微米
4.切片后固定
将切好的冰冻片用预冷的组织固定液固定30min，蒸馏水洗3-5次，洗干净固定液，自然晾干后进行下一步实验或-20℃保存
冰冻片免疫荧光实验步骤
热修复抗原:将切片浸入修复缓冲液（柠檬酸盐或EDTA修复液）,电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10 min后，反复1-2 次。
室温自然冷却后水洗一次
滴加封闭液（5%BSA或二抗同源血清）, 37℃孵育30 分钟。
甩去多余液体, 不洗。
滴加适当稀释的一抗，4℃过夜后37℃复温30min，也可37 ℃孵育2 h。
PBS洗5min×3 次。
滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(或兔IgG)，37℃30 min。
PBS洗5min×3 次。
滴加试剂SABC-FITC，37℃孵育30 min。
PBS洗5 min×4 次。
DAPI复染2-3min，充分水洗，封片观察。
实验八 冰冻切片法
一 、实验目的• 学习冰冻切 Nhomakorabea法 • 了解组织染色原理
二、实验原理
• 用包埋剂包埋并冷冻固化组织； • 用碱性染料如苏木精、碱性品红等，使细 胞核着色； • 用酸性染料如伊红、酸性品红等，使细胞 中的嗜酸性成分着色，如蛋白质。
三 、实验用品
• 1、器材： • 切片机、染色缸、玻片、显微镜、试剂瓶、剪刀、镊子、 烘箱或酒精灯。 • 2、试剂 • 苏木色精、伊红、二甲苯、中性树胶、酒精、氨水、盐酸。 • 3、材料 • 各类你感兴趣的新鲜或固定标本。
四、实验步骤
• • • • • 1、取材：将材料切成5-8mm³的小块。 2、包埋：包埋剂包埋。 3、冷冻：放入冷冻切片机标本冷冻台。 4、切片：厚度7-8µm。 5、烘片、固定：烘箱烘片20-30min，甲醛 固定液固定；或直接酒精灯烘片。 • 6、染色与观察：（见下页）。
染色与观察
• 1%苏木色精（5min）——水洗——0.5%盐 酸分色（数秒）——水洗——0.4%氨水蓝 化——水洗（ 5min ）——70%酒精—— 80%酒精——1%伊红（95%酒精溶解）— —95%酒精——95%酒精——100%酒精— —100%酒精——酒精/二甲苯——二甲苯— —二甲苯——中性树胶封片。 • 未注明时间的一律处理2-3min。
五、作业
• 简述冰冻切片过程，绘制你所观察到的细 胞形态。 • 提交一张你认为制作较好的玻片。
冰冻切片步骤2010.6
1.速冻组织：冰冻切片机的使用需要加强！！将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾?，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
2．组织固定与切片：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。
取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。
组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。
修片，切片。
重点步骤室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。
PBS洗，5分钟×3。
进行抗原热修复（7-1-5-1-5）微波热修复可以吗，室温自然冷却。
（选做：用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性）。
3．组织切片免疫荧光染色：冰冻切片室温晾干15min,用组化油笔将待染组织圈好，圈不可太小，太小时若阻水胶粘到组织上，组织便不能染上色。
圈也不宜太大，太大则浪费抗体。
选做：用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸，我们的胰腺组织一般是加10-20μl)，将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。
第二天早上，先将湿盒放到37℃回温1h（37℃环境可用二氧化碳培养箱或者分子杂交箱提供），然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗，。
滴加用PBS稀释好的二抗（从此开始所有步骤都在暗房进行）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。
冰冻切片步骤很全面
冰冻切片步骤很全面冰冻切片是一种常用的实验技术，在生物学、医学研究、组织学观察等领域有着广泛应用。
以下是一份详细的冰冻切片步骤，旨在提供全面的指导。
注意，不同的实验目的可能会有一些差异，因此请根据实际需求调整步骤。
1.準备1.1获取你所需的样本。
这个样本可以是活体动物的组织，也可以是固定处理后的组织。
1.2准备冷冻介质。
通常使用的冷冻介质包括液氮、干冰和冷冻套。
液氮是一种非常冷的液体，可以迅速冻结样本。
干冰是固态二氧化碳，可以提供较低的温度。
冷冻套是一种装置，可以通过循环冷却剂来维持全套工具的较低温度。
1.3准备工具和设备。
这些工具和设备通常包括切片机、切片模具、刀片、显微镜片和刷子。
1.4调整工作环境。
确保实验室温度适宜、空气流通，并消毒工作台和其他工具。
2.样本取样和固定2.1根据实验目的，选择合适的样本区域。
例如，在动物研究中，你可能需要选择大脑的特定区域。
2.2切下样本。
使用手术器械，例如手术剪刀和手术刀，在样本区域周围切下足够大小的组织块。
2.3快速固定样本。
使用适当的固定液将样本固定。
常用的固定液包括10%缓冲福尔马林和4%聚乙二醇。
将样本完全浸没在固定液中，确保完全固定，避免其损伤。
3.冷冻3.1冷冻样本。
将固定的样本迅速置于冷冻介质中。
如果使用液氮，直接将样本放入液氮中。
如果使用干冰，将样本放入常温下事先准备好的干冰盒中，并立即放入冷冻套中。
3.2冷冻条件。
根据样本的性质和实验要求，选择适当的冷冻条件。
通常情况下，液氮的温度低于-150°C，而干冰的温度大约为-78°C。
3.3冷冻时间。
样本的冷冻时间取决于其大小和固定液的穿透性。
通常情况下，较小的样本需要较短的冷冻时间，而较大的组织块需要较长的冷冻时间。
一般而言，冷冻时间为几个小时到几天。
4.切片4.1为切片做准备。
在切片之前，将切片模具放在切片机上，并冷却至所需的温度。
同时，将刀片插入切片机。
4.2取出样本。
冰冻切片制片实验步骤及注意事项
冰冻切片制片实验步骤及注意事项冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。
因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。
冰冻切片制片实验步骤1、组织固定：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。
将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。
2、脱水：将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。
3、OCT包埋：将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。
4、切片：将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚°8-10μm。
将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。
-20°保存备用。
注意事项1、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（-78℃）② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（-80℃）③ 液氮（-190℃）④ 液氮冷却的丙烷（-19℃）。
液氮适用于组织化学，较安全。
缺点：组织块易发生龟裂。
2、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。
但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。
故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。
3、电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4%缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.）84ml；蔗糖8g）固定较好。
这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。
冰冻切片步骤很全面
冰冻切片步骤很全面1.标本采集：标本采集是制备冰冻切片的第一步，要确保标本的新鲜度和完整性。
采集时需注意使用无菌器械，避免受到外界污染。
对于细胞切片，可采用细胞培养技术培养的细胞；对于组织切片，采集适量的组织，尽量保持其原有结构。
2.固定：在采集后，为了防止细胞或组织的结构和形态发生变化，需要进行固定处理。
常用的固定方法有：a.4%的硫酸镁：使用4%的硫酸镁固定剂，固定15-30分钟。
b.4%的甲醛：使用4%的甲醛固定剂，固定15-30分钟。
c.10%的缓冲福尔莫林：使用10%的缓冲福尔莫林固定剂，固定4-24小时。
3.包埋：包埋是将固定的细胞或组织进行预处理，以便后续的冷冻切片。
常用的包埋方法有：a.脱水：使用不同浓度的乙醇进行脱水处理，通常有70%、80%、95%和100%四个浓度。
b.渗透剂：使用溶解在脱水剂中的渗透剂，如氯仿、苯酚、醋酸酯等，以提供组织切片的硬度和稳定性。
c.包埋剂：将脱水后的组织切片放入包埋剂中，如石蜡、冻脂等；对于细胞切片，可直接在载玻片上进行包埋。
4.冰冻：冰冻是制备冰冻切片必不可少的步骤，它能够保持细胞或组织的原有形态和结构。
常用的冰冻方法有：a.冷冻板法：将包埋好的标本放置在预冷冻的金属冷冻板上，然后放入液氮中进行快速冷冻。
b.冷冻微才法：将包埋好的标本进行逐步冷冻，在每一步冷冻前都将标本表面的水分吹干。
c.冷冻机法：使用专用的冷冻机进行冷冻，通常温度在-20至-30°C。
5.切片：切片是冰冻切片的核心步骤，需要使用显微切片机或冰冻切片机进行操作。
切片前需将冷冻的标本块取出，等待恢复到适宜切片的温度（一般为-20至-30°C）。
然后，使用坚硬的切片刀或切片刀片切取薄片，通常厚度为5-20微米。
切片时需注意保持刀片的锋利度和角度，以保证切片的质量。
总结：冰冻切片是一种常用的生物学实验和临床诊断技术，它通过对细胞和组织进行固定、包埋、冰冻和切片等步骤，帮助研究人员观察和分析样本的结构。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片免疫组化染色步骤引言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于研究细胞和组织的分子表达。
它结合了冷冻样本的切片技术和免疫组织化学染色的原理，能够可视化特定分子在组织中的位置，从而帮助我们理解生物过程和疾病机制。
本文将介绍冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项。
步骤一：样本制备1.收集组织样本，根据需要进行切割和处理。
2.快速冷冻组织样本，可用液氮或乙醚等方法冷冻，并保存在低温环境中。
步骤二：切片制备1.取出冷冻样本，将其置于切片机或切片冷冻器中。
2.进行组织切片，通常厚度为5-10微米，利用切片刀或者切片冷冻器的微调装置。
3.将切片收集在清洁的载玻片上，可以使用专门的载玻片来增强切片与载玻片间的附着力。
步骤三：固定和脱水1.将载玻片上的切片放入4%的中性缓冲福尔马林缓冲液中固定细胞和蛋白质。
2.固定15-30分钟后，用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将福尔马林去除。
3.将切片脱水，使用逐渐浓度的乙醇和脱水溶液，如70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。
步骤四：抗原修复1.对于有些抗原，如细胞核抗原，需要进行抗原修复。
这可以通过热、酸或酶消化等方法进行。
2.一种常用的抗原修复方法是将切片置于高温或高压下进行热诱导抗原修复。
步骤五：阻断和孵育1.使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白、BSA等，在切片上进行孵育，以防止非特异性结合。
2.孵育时间通常为30分钟至1小时。
步骤六：一抗孵育1.加入一抗，即特异性抗体，与切片上的靶分子结合。
2.一抗浓度和孵育时间根据实验需要和抗体质量进行优化。
步骤七：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的一抗去除。
2.洗涤时间和次数根据实验要求和抗体特性进行优化。
步骤八：二抗孵育1.加入荧光标记的二抗，与一抗结合形成复合物。
2.二抗可以识别一抗的种类，常见的二抗有荧光标记的抗鼠IgG、抗兔IgG等。
步骤九：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的二抗去除。
冷冻切片sop操作流程
冷冻切片sop操作流程SOP（Standard Operating Procedure，标准操作规程）是一份详细说明操作步骤的文件，有助于确保在特定任务或过程中的一致性和可重复性。
以下是冷冻切片的一般SOP操作流程，具体操作可能因实验室设备和需求而有所不同：1. **准备样本：**- 确保样本已经被适当地冷冻，并且处于适当的保存温度。
准备好冷冻切片所需的样本。
2. **设备准备：**- 检查和准备切片机或微切机。
确保刀片是锋利的，并进行必要的清洁和消毒。
3. **切片机设置：**- 设置切片机的参数，包括切片的厚度、速度和刀片的温度等。
确保所有设置符合实验需求。
4. **刀片安装：**- 安装刀片到切片机上，并进行校准。
确保刀片的位置和角度是正确的。
5. **样本固定：**- 使用合适的固定剂或嵌入剂，将样本固定在切片机的支架上。
确保样本被均匀地固定。
6. **切片过程：**- 启动切片机，开始切割样本。
根据需要，可以选择手动或自动模式。
确保切片的质量和厚度符合实验要求。
7. **切片收集：**- 收集切片并放置在适当的载玻片或其他支持材料上。
确保切片的顺序和标记是清晰可辨认的。
8. **切片处理：**- 根据实验需要，可能需要对切片进行后续处理，如染色、包埋等。
确保处理步骤符合实验要求。
9. **数据记录：**- 记录切片的相关信息，包括切片序号、厚度、样本来源等。
这有助于后续数据分析和实验结果的追溯。
10. **清理和维护：**- 清理切片机和工作区域，确保所有工具和设备得到适当的维护。
这有助于保持切片机的性能和延长使用寿命。
11. **文档归档：**- 将整个操作流程和相关数据归档，以备将来的查阅和验证。
这个流程是一般性的冷冻切片的SOP操作流程，具体实验室可能有特殊要求，需要根据具体情况进行调整。
冰冻切片实验步骤
全部实验步骤1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时2 30%蔗糖脱水48小时以上3 -250C包埋（冰冻切片机内）4冰冻切片冰冻切片步骤1.冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min，浸入4°C预冷的丙酮固定10min，2.PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换）3.用30%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。
4.PBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致边缘效应。
5.5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。
6.甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。
7.配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:100），悬空加入一抗工作液50-100ul，枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。
8.放入湿盒内，置于4°C冰箱过夜（最长不可超过48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。
9.第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min，10.滴加1:100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。
11.滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温1h，后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。
冰冻切片实验步骤
全部实验步骤1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时2 30%蔗糖脱水48小时以上3 -250C包埋（冰冻切片机内）4冰冻切片冰冻切片步骤1.冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min，浸入4°C预冷的丙酮固定10min，2.PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换）3.用30%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。
4.PBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致边缘效应。
5.5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。
6.甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。
7.配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:100），悬空加入一抗工作液50-100ul，枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。
8.放入湿盒内，置于4°C冰箱过夜（最长不可超过48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。
9.第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min，10.滴加1:100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。
11.滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温1h，后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。
冷冻切片操作指南
冷冻切片操作指南在医学、生物学和食品科学等领域中，冷冻切片是一种重要的技术，用于将样品冷冻固化后，切割成薄片以供进一步观察和研究。
本文将为读者提供一份冷冻切片操作指南，介绍冷冻切片的基本原理、实验室操作步骤和注意事项。
一、冷冻切片的基本原理冷冻切片是将样品通过快速冷冻技术使其迅速固化，然后使用切片机或显微切片机将固化的样品切割成薄片。
冷冻切片的目的是保留样品的形态和结构，避免切片过程中的伤害和变形。
冷冻切片一般适用于需要保留细胞和组织结构的实验。
二、实验室操作步骤1. 样品准备：将待切割的样品准备好，可以是细胞、组织或食物等。
样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性。
2. 冷冻固化：将样品放置在冷冻剂中，例如液氮或冷冻盒中的冰水混合物中，进行快速冷冻固化。
冷冻时间需要根据不同样品的特性进行优化，一般在几分钟至数小时之间。
3. 选用切片仪器：根据实验需求，选择合适的切片仪器，可以是手动的切片机或半自动/全自动的显微切片机。
4. 切片调整：根据实验需求，调整切片仪器的切割参数，例如切片厚度和速度等。
通常，薄片的厚度在几微米至数十微米之间。
5. 切片过程：将冷冻固化的样品放置在切片仪器的切片台上，固定好，并且调整好切割参数。
使用手动或电动操作切片仪器，将样品切割成所需的薄片。
6. 切片收集：将切割好的薄片收集起来，可以使用切片刷或显微镊子等工具进行操作。
注意保持薄片的完整性和干燥，避免受到污染和损坏。
7. 切片处理：根据实验需求，进行切片的进一步处理，例如染色、免疫组化等。
三、注意事项1. 样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性，避免样品受到损伤和变性。
在样品处理过程中，可以使用缓冲液或甘油等物质进行保护。
2. 冷冻固化的时间和温度需要根据不同样品的特性进行优化。
过长或过短的冷冻时间都可能导致样品质量下降。
3. 在选择切片仪器时，需要根据实验需求和预算等因素进行权衡。
手动切片机相对便宜，但操作较为繁琐；半自动/全自动的显微切片机操作更为方便，但价格较高。
冷冻切片技术实验及冷冻切片机的基本操作
冷冻切片技术实验及冷冻切片机的基本操作冷冻切片技术是一种常用的生物学实验技术，通过将生物组织或细胞样本在非常低的温度下快速冷冻并切割成薄片，以保持样本的原始结构和化学组成，从而观察细胞或组织的形态结构和功能。
冷冻切片技术广泛应用于组织学、细胞学、免疫学等领域的研究和临床诊断。
冷冻切片机是冷冻切片技术的关键设备，用于将冷冻后的样本切割成薄片。
下面将介绍冷冻切片技术实验的步骤及冷冻切片机的基本操作。
1.样本处理：将待切割的生物组织或细胞样本进行处理，如固定、染色等。
这些步骤可以根据实验需求进行选择，以保持样本的形态和结构。
2.冷冻固化：将处理好的样本通过冷冻剂（如液氮或液氮混合物）迅速冷冻固化。
冷冻速度越快，冰晶越小，样本的结构损伤越小。
3.取样本：将固化好的样本从冷冻剂中取出。
在取样本之前，需注意将取样本的器具和工作台等一同冷冻至与样本相同的温度，以避免样本融化。
4.进样盒固定：将样本放置在迅速冻结剂（如液氮）预冷的进样盒内，并用冷冻剂浸泡样本。
进样盒的固定有助于保持样本的形状和组织结构。
5.冷冻切片：将装有样本的进样盒置于冷冻切片机的切片台上，调节刀片与样本的切割厚度。
通常，切割厚度可根据需要调节，一般在5-100微米之间。
6.切片收集：将切割好的样本切片收集到载玻片中，通常使用水平移动的玻片支托架来收集切片。
收集时需保持切片的顺序，并用特定的液体介质（如生理盐水）浸润切片，以防止切片变形或干燥。
7.染色和显微观察：将切片进行染色处理，如组织染色、免疫染色等，以显示出组织的细胞结构和化学成分。
然后，可以使用显微镜观察和拍摄切片的形态结构和细胞组织分类。
冷冻切片机的基本操作如下：1.准备：打开冷冻切片机电源，确保刀片已经安装，并根据需要调整切割厚度。
检查是否有足够的液氮或其他冷冻剂供应。
2.进样：将待切割的样本放置在切片台上的进样盒中，使用夹具或夹具系统将其固定在进样盒上。
确保样本与刀片的切割平面垂直，并浸泡在冷冻剂中。
冰冻切片实验步骤
冰冻切片实验步骤1.准备实验所需材料和设备：包括有机溶剂（如乙醇、氯仿、甲醇等）、30%的蔗糖溶液、液氮、切片刀、显微镜玻片、显微镜载玻片、切片盒等。
2.收集和处理样品：可以选择动植物的组织或细胞作为实验样品。
收集样品后，可以用生理盐水或缓冲液进行清洗和去除杂质。
如果是动物组织，可以选择将其冷冻在液氮中，以保持其完整性。
3.组织固定：将收集到的样品转移到含有组织固定剂的试管中。
常见的组织固定剂包括缓冲液、乙醛或霍乱毒素。
根据所需的实验目的和需要，可以选择适当的组织固定剂。
4.组织固定处理：组织固定的时间因组织类型和目的有所不同，一般在数小时至数天之间。
在固定过程中可以加入一些缓冲液，以维持组织的pH值和渗透压。
5.甘油渗透：将固定的组织置于甘油溶液中。
甘油的作用是提高组织的柔软度和切片的质量。
一般可选择10%左右的甘油溶液。
6.冰冻：将处理好的组织置于液氮中，直到其完全冰冻。
冰冻的温度通常为－20℃。
在冰冻过程中，可以使用冷冻托盘和冷冻盒等设备加快组织的冻结速度。
7.切片：使用预先冷却的切片刀，将冰冻的组织切成所需的薄片。
切片的厚度一般为10-100微米。
为了保证切片的质量，可以在切片过程中使用切片保护剂，如30%蔗糖溶液。
8.华里士染色：将切好的组织切片转移到显微镜载玻片上，使用华里士染色液进行染色。
华里士染色是一种常用的组织染色方法，可以染色细胞核和细胞浆。
9.覆盖玻片：将染色后的切片盖在显微镜玻片上，并使用透明胶片或封口剂固定切片。
10.显微观察：将制备好的切片置于显微镜下，观察和记录感兴趣的细胞或组织结构。
可以使用不同放大倍数的镜头进行观察和分析。
11.结果分析：对观察到的细胞或组织结构进行分析和解释。
可以使用图像处理软件进行图像的分析和处理。
12.结论和讨论：根据实验结果，得出相应的结论并进行讨论。
可以与已有的研究结果进行对比，验证实验的准确性和可靠性。
组织冰冻切片步骤
组织冰冻切片步骤冰冻切片是一种常见的实验技术，用于获取生物样品的细胞或组织的薄片，以便进行进一步的研究和分析。
下面将介绍组织冰冻切片的步骤。
1. 材料准备首先，准备好所需的材料，包括冷冻剂（如液氮或干冰）、组织样品、切片刀、切片刀床、切片刀片、切片缓冲液（如磷酸盐缓冲液）和载玻片。
2. 固定组织样品将待切割的组织样品用适当的方法进行固定，比如使用福尔马林或其他适合的固定剂。
固定的目的是保持组织的形态结构和细胞的染色质形态。
3. 冷冻组织样品将固定后的组织样品置于冷冻剂中，使其迅速冷冻。
常见的冷冻剂包括液氮和干冰，其温度低于零下80摄氏度。
冷冻过程应尽量迅速，以避免组织样品的结构和细胞的形态发生变化。
4. 制备切片刀床和刀片在切片刀床上放置适当大小的切片刀片，确保刀片干净锋利。
切片刀片的角度和刀片的锋利度会影响切片的质量，因此需要定期检查和更换刀片。
5. 切割组织样品将冷冻的组织样品取出，迅速放置在切片刀床上，并用切片刀沿着组织的纵向或横向切割，制备薄片。
切割时要保持手的稳定和力度的均匀，以获得均匀且薄的切片。
6. 收集切片使用切片刀片或刷子将切割好的组织切片收集到切片缓冲液中。
切片缓冲液可以保持组织切片的湿润和形态结构。
7. 制备载玻片在载玻片上涂抹一层适当的胶水或明胶溶液，将收集好的组织切片均匀地放置在载玻片上。
确保组织切片的平整和分布均匀。
8. 干燥和固定切片将载玻片放置在室温下或烘箱中，使其干燥。
干燥后，可以使用染色剂或其他化学试剂对切片进行染色或固定，以便后续的显微镜观察和分析。
9. 显微镜观察和分析将制备好的组织切片放置在显微镜下，观察和分析组织的形态结构、细胞的类型和分布等信息。
可以使用不同的显微镜技术，如光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜，以获得更详细和精确的数据。
10. 结果记录和分析根据显微镜观察和分析的结果，记录和分析组织切片的特征和变化。
可以使用统计学方法对数据进行处理和分析，以得出科学结论和研究结果。
冷冻切片方法及注意事项
一、试验前预备清理试验台及仪器。
开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度〔- 15~-20 ℃*〕。
预备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。
二、取材解剖之后快速取出所需的颖组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材〔24×24×2mm*〕,以防形成冰晶造成切片中形成外形不一的空泡,使细胞内构造移位。
〔注：取材中目的标本既要明确也要确保其构造的完整性，应避开不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。
甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。
〕三、冷冻切片1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片〔1~3 分种〕。
2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
3、调好欲切的厚度，依据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10μm 间。
4、调好防卷板。
制作冰冻切片，关键在于防卷板的调整上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。
切片时，以切出完整、平滑的切片为准。
切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向略微用力轻轻一带,可避开组织摊片过程中皱折,保证组织构造的完整及切片的美观。
注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。
常用的有三种包埋剂OCT 剂、B 超藕合剂以及一般胶水。
B 超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,一般胶水或OCT 剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。
〔OCT 包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。
〕②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30 秒钟左右待胶凝固时将小组织放上, 组织四周再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。
实验五 冰冻切片法
四、实验结果
观察小鼠肝脏细胞的形态
五、作业
实验完毕，每人交制好的玻片标本1片，在
标签纸写上玻片名称及自己的姓名和日期；
实验报告（姓名和日期）。
注意事项
速冻是冰冻切片的关键，冷冻的速度可有效的减少冰晶的出现， 软组织以及细胞丰富的组织如肝、脾、淋巴结等2-4min；
冰冻切片的温度要适宜，温度过低、过高会导致组织过硬或硬度 不够，从而影响切片质量，产生搓板状、梯田状、厚薄不均，破 碎或粉末状现象。根据器官组织形态结构和组成成分的不同，冰 冻组织切片的温度亦不同。推荐：乳腺、卵巢、子宫等：-20~25℃ 胃肠：-18~-20℃-甲状腺、肝，肾、脾等：-15℃左 右· 脂肪组织一般在-35℃以下； 封片时要做到无气泡，无溢液、标签清楚端正，保证切片的整洁。
冰冻切片的种类
冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法、二 氧化碳冰冻切片法、甲醇循环制冷冰冻切片法、半导 体冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技 的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也 逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切 片法，正在受到青睐。
半导体冰冻切片机构造
半导体制冷器
冷台 冷刀
制冷调节器
切片机
一、实验目的
了解半导体冰冻切片机的基本构造；
练习半导体冰冻切片法制片。
二、实验材料及用品
实验材料：小鼠肝脏
实验用具：载、盖玻片药品：甘油明胶液。
三、实验步骤
取材：引颈致死法杀死小鼠，取其肝脏，将新鲜肝脏组织切成1~1.5cm×1~1.5cm X 0.3~0.5cm 大小。组织块可不加任何处理，直接进行冰冻切片。另一种方法是组织先经10％中性福马林或 钙福马林固定，再水洗后冰冻切片。若组织用酒精固定，则固定后须用流水彻底除去组织内的 酒精，否则因酒精冰点低，不易冰冻。 切片机连接：半导体冰冻切片机的水路和电路按使用说明书要求接好。水流的次序为：自来水 龙头→冷台进水→冷台出水→冷刀进水→冷刀出水→下水。致冷器工作时，应始终保持水流畅 通，要牢牢记住，先通水，后通电；先关电源，后关水，否则将烧坏机器。必须保证一定的流 水量：>400ml/min 将新鲜材料置于冷台上冰冻组织，组织块冻结的硬度与切片的成败有密切关系，如切削后在刀 片上出现白色而脆的飞散碎片，即组织块冻结太硬；若为软弱的粥状则太软，只有适当硬度切 出的切片才能平展成形。这要根据工作经验，控制适当的致冷温度。 切片：切片厚度一般为10-15um。切下来的切片用湿毛笔从刀上挑起，置于清水中使其展开， 或直接粘于破片上。 封片：由于切片染色后不再经过脱水、透明等步骤，因此必须使用水溶性的封片剂，如甘油明 胶液，
冰冻切片技术
冰冻切片技术1：实验原理：利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻产生一定的硬度进行切片，与石蜡切片相比，冷冻切片不需要脱水处理。
因此制片速度快，是术中进行快速病理争端的良好方法。
2：实验步骤：①取材：从新鲜的小鼠中剖取肝、肺、心、胰腺、肾等组织器官至载玻片上②冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻住头温度和箱内温度调至-20--15℃，将组织器官移到涂了一层耦合剂的组织支承器冻面上，用镊子压平，再挤上一层耦合剂覆盖标本。
放至冰冻机中降温处理③标本冷冻后将组织支承器固定在切片机的机头上，调整机头的位置使其正好位于切片刀的后方。
④以粗修的方式粗修到暴露标本的最大平面，用毛笔清除机头、组织支承器及刀片上的组织碎屑。
⑤确认切片的厚度，一般为4到5vm不等，根据组织的不同可适当调整切片的厚薄。
⑥放下放卷板使其位置恰好与刀片的刀刃完全平行并略突出刀刃⑦以转动大轮推进的方式进行切片，良好的切片将在放卷板的下方形成一张完整平坦无褶的薄片，若切片略有弯曲，可用毛笔轻轻展平。
⑧打开放卷板，将标记好的载玻片平稳的轻压组织，使其平整的吸附到载玻片上。
⑨将切好的标本薄片迅速放入95％的乙醇固定液中进行3min的固定，再经过1min的流水冲洗，进入染色程序⑩按照：苏木素（1min）→流水冲洗（3min）→伊红染液（30s）→流水冲洗（1s）→85％乙醇→95%乙醇（10s）→无水乙醇①（30s）→无水乙醇②（1min）→二甲苯①（1min）→二甲苯②（1min）①将染色完成的标本使用树胶与盖玻片进行封片操作②将标本放到显微镜下，观察拍照记录10×、40×的镜下观3：实验结果：在镜下可观察到小鼠的肝细胞，细胞核被染成蓝色，胞质及细胞间隙被染成淡红色，同时可见大多数细胞中脂肪将细胞核挤到细胞一侧。
4：结果分析及讨论：①切片前先预调好厚度，提前准备好要使用的工具。
②切片时，观察窗不可打开过大，预防温度升高影响切片③在每一次切片之后都应该要注意清理碎屑，以防污染④严格把握染色时间，避免因染色时间太短或太长而影响实验观察5：思考题：①什么时候做冰冻切片：1：在手术:进行中，突然发现病人的病变原及诊断，判断病变是否为肿瘤2：判断肿瘤的良恶性2：了解淋巴结是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其他的治疗措施。
冰冻切片制备的主要步骤
冰冻切片制备的主要步骤冰冻切片制备是一种常用的生物学和医学实验技术，用于在冷冻状态下快速切割组织样本，并进行随后的病理学诊断或研究。
以下是冰冻切片制备的主要步骤：一、准备样本在进行冰冻切片制备之前，需要准备好待检测的组织样本。
这些样本可以来自各种来源，如手术切除、活检、尸检等。
样本应该尽快放入适当的冷冻介质中，如OCT包埋剂，以保持其冷冻状态。
二、冷冻将准备好的样本放入冷冻切片机中，通常是一个恒温的金属块。
这个金属块被冷却到低于-20℃的低温，确保样本快速冷冻。
在这个过程中，需要特别注意不要让冷冻过度或不足，因为这会影响切片的品质。
三、切片使用冷冻切片机将冷冻好的样本切成薄片。
切片的厚度通常在5-10微米之间，以确保切片能够清楚地显示组织的结构和特征。
这个过程需要熟练的技术员操作，以保证切片的完整性和均匀性。
四、固定刚切好的切片非常容易受到热和湿气的影响，因此需要迅速固定。
通常使用甲醇或乙醇作为固定剂，将切片固定在载玻片上。
这一步可以防止切片在接下来的步骤中滑落或移动。
五、染色固定好的切片需要进行染色以更好地显示其结构和特征。
最常用的染色方法是hematoxylin and eosin (H&E)染色。
这一步可以在染色机中完成，也可以手工操作。
染色完成后，切片会被冲洗干净并彻底干燥。
六、观察和诊断最后一步是将制备好的切片放在显微镜下观察，并进行病理学诊断。
此时，病理学家可以根据切片的特征对疾病进行分类和分级，或者对手术切缘进行评估。
以上就是冰冻切片制备的主要步骤。
需要注意的是，每个步骤都需要严格的操作规程和技术要求，以保证制备出的切片能够准确地反映组织的结构和特征。
冰冻切片实验步骤
冰冻切片实验步骤冰冻切片是一种常用的实验技术，用于研究生物样品的结构和功能。
在冰冻切片实验中，样品必须被快速冻结并制成非常薄的切片，以保持样品的原始结构和形态。
以下是一个冰冻切片实验的一般步骤，供参考。
1.准备工作：-准备所需的实验材料和设备，包括动物或细胞样品、细胞培养基、PBS缓冲液、冷冻剂（如液氮或干冰）、冷冻切片机、切片刀片、切片贴片和载玻片等。
-充分冷却冷冻切片机，并确保切片刀片处于锋利和清洁状态。
-确保实验环境卫生干净，并且操作台面上没有其他杂物和细菌。
2.过度冷冻：-在离心管或培养皿中收集样品，如组织块或细胞团。
-将样品迅速置于冷冻剂中，以快速冷冻样品。
在制备过程中，样品冷冻的速度非常重要，可以使用冰浴或液氮使样品迅速冷冻。
3.制备冷冻样品：-将冷冻固态样品放入冷冻切片机的样品夹内，确保样品与夹具接触良好。
-调整切片刀片的角度和位置，以确保薄片的切割。
-使用冷冻切片机制备冷冻样品，比如用于大脑切片的考尔密斯键切片机。
4.切片过程：-打开冷冻切片机的刀片和样品夹，以容纳载玻片。
-将切片刀片横跨切片机的切片口，并确保刀刃与样品夹接触。
-使用微调装置，轻轻地将切片刀片向下移动，以制备样品切片。
可以根据需要调整切片的厚度。
5.取样和处理：-将切制好的样品轻轻地使用毛刷或细针取下，并将其浸泡在PBS缓冲液或其他处理液中进行进一步处理。
-根据实验需求，可以进行染色、免疫标记和显微镜检查等处理。
6.制备切片贴片和载玻片：-取出切片贴片并将其浸泡在PBS缓冲液中，让其变湿。
-使用镊子或其他工具将处理好的样品放在切片贴片上，然后轻轻地将切片贴片放在载玻片上。
确保样品均匀分布在切片贴片上，并避免形成气泡。
7.干燥和封装：-将切片贴片从PBS缓冲液中取出，用纸巾或吸水纸轻轻地吸去多余的液体。
-将载玻片置于干燥盒中，确保切片在常温下彻底干燥。
-使用合适的密封胶将载玻片封装，以防止切片的氧化和损坏。
总结：冰冻切片实验是一种常用的技术，用于研究生物样品的结构和功能。
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全部实验步骤1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时2 30%蔗糖脱水48小时以上3 -250C包埋（冰冻切片机内）4冰冻切片冰冻切片步骤冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。
用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗，5分钟×2次。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。
(见我发的前面的帖子)你确定你是冰冻切片吗冰冻切片不能用热修复啊！！！以下是我的步骤：1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。
用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。
2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
3 PBS冲洗，5分钟×3次。
4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。
PBS冲洗，5分钟×3次。
5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
6 PBS冲洗，5分钟×3次。
7 显色剂显色（DAB）。
8 自来水充分冲洗，复染，封片。
冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。
此配方不易产生脱片。
配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。
冰冻切片免疫组化染色步骤冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。
用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2。
下接免疫组化染色操作步骤。
免疫组化染色步骤：（SP试剂盒为例)1 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。
用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2。
2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
3 PBS冲洗，5分钟×3次。
4 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
PBS冲洗，5分钟×3次。
5 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
6 PBS冲洗，5分钟×3次。
7 显色剂显色（DAB或AEC）。
8 自来水充分冲洗，复染，封片。
1.冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min，浸入4°C预冷的丙酮固定10min，2.PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换）3.用3%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。
4.PBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致边缘效应。
5.5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。
6.甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。
7.配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:100），悬空加入一抗工作液50-100ul，枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。
8.放入湿盒内，置于4°C冰箱过夜（最长不可超过48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。
9.第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min，10.滴加1:100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。
11.滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温1h，后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。
12.DAB显色，显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止DAB反应，最好把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB，观察到阳性区和阴性区差异后终止，此时最好有计时，以便于今后重复试验控制显色时间（一般显色时间2s-10min，显色时间过长背景高，且可靠性低）13.终止DAB显色可将玻片置于染色缸内，用自来水流水稀释终止5min，后在显微镜下观察是否有DAB颗粒附着。
14.甩干水分，苏木素复染（如为加汞的苏木素，显色时间为6-10s，可不用酒精分化，直接用PBS返蓝，如为非加汞苏木素，需在盐酸酒精分化），苏木素终止亦可用自来水冲洗终止反应。
15.水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明（75%-85%-95%-100%-100%-二甲苯1-二甲苯2）个3min，滴加中性树胶封片，中性树胶浓度以不拉丝为宜16.封片后干燥1h(或者在通风橱吹风的情况下15min)，用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的树胶。
观察照相。
针对脱片问题，我做了如下处理。
但仍存在脱片现象，麻烦您给我提一些相关的建议。
自来水冲洗玻片，晾干后，多聚赖氨酸的涂胶以下两种方法我都试过1.单涂胶：往一张玻片上加0.01%的多聚赖氨酸80ul，用另一张玻片推片，然后叠加其上，停留5分钟，中间推动玻片数次，使液体涂抹均匀，分开两张玻片，滤纸吸干玻片下缘，置玻片架上600C烤干1h备用。
2.双涂胶：往一张玻片上加0.01%多聚赖氨酸80ul,单涂胶600C烤干,同样方法重复涂胶1次"600C烤干,备用。
我用过的尼氏染色的方法，效果不错。
1．溶液配制：(1) 溶液A：焦油固紫0.2g, 纯水500ml(2) 溶液B：0.1M冰醋酸冰醋酸3ml，纯水500ml(3) 溶液C：0.1M无水醋酸钠无水醋酸钠4.1g，纯水500ml(4) 溶液D：PH3.5~4.5醋酸缓冲液B液94ml＋C液6ml(5) 工作液：A液10ml＋D液90ml 过滤后使用，避光保存注：焦油固紫遇光分解，整个过程应避光操作，可以用黑色塑料袋罩着。
2．具体步骤：⑴如果为石蜡切片，先进行脱蜡处理，然后从步骤⑵开始；如果为冰冻切片，从步骤⑵开始。
⑵将凉干的切片放入纯水中3～5min。
⑶切片放入焦油固紫染色液中1～1.5h。
⑷切片放入纯水中洗去浮色。
⑸切片放入70％－80％－95％的酒精分色，各几秒钟，时间自己掌握，以不见掉色为好。
⑹切片放入特殊分色液中褪背底（1：1：1的无水乙醇，氯仿，乙醚）。
⑺切片放入100％乙醇，5min×3次；二甲苯5min×3次，透明封固。
整个过程要保证切片不能干掉。
3、结果尼氏小体：深蓝紫色；核、核仁：浅紫色；背底：洁白无色。
我个人觉得特殊分色液挺重要的Highman甲醇刚果红染色法（类淀粉染色）1、试剂配制：甲醇刚果红染液: 刚果红0.5 g 甲醇80 ml 甘油20 ml碱性乙醇分化液: 氢氧化钾0.2 g 80%乙醇100 ml2、染色步骤:（1）切片脱蜡至水（2）甲醇刚果红染液染10～20分钟（3）用碱性乙醇分化液分化数秒（4）水洗（5）苏木素复染2分钟（6）水洗（7）脱水,透明,封固3、结果：淀粉样物呈桔红色。
4、类淀粉染色的应用：确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色，冰冻切片脱脂问题：0.5盐酸乙醇分化液配置直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器λ磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4λ荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释λ缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制λ搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）λ有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）λ荧光显微镜λ玻片架λ滤纸λ 37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS 三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30min已足够。
染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。
低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。
3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
（1）标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
（2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。