辅酶I(NAD)抑制心肌成纤维化

第 51 卷 第 3 期 Vol． 51 No． 3
山 东 大 学 学 报 （ 医 学 版） JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY（ HEALTH SCIENCES）
文章编号： 1671 － 7554（ 2013） 03 － 0001 － 05
DOI： 10． 6040 / j． issn． 1671-7554． 2013． 03． 001
组，FAM 组，Sirt1-siRNA + AngII ( 1 μmol / L ) 组，Sirt1-siRNA 组，Sirt1-siRNA + NAD ( 250 μmol / L ) 组，Sirt1-
siRNA + Ang II( 1 mol / L) + NAD ( 250 μmol / L ) 组。刺激 24 h 后，提取总 RNA，Real time RT-PCR 法分别检测
mRNA 表达的作用。方法 提取新生 Wistar 大乳鼠原代心肌成纤维细胞，传代培养，采用 2 ～ 4 代细胞。实验分
为空白对照组，AngII ( 0． 01、0． 1、1 μmol / L) 组，NAD( 250 μmol / L) 组，AngII( 1 μmol / L) + NAD ( 250 μmol / L )
1 材料与方法
1． 1 材料 1． 1． 1 实验动物 新生 2 ～ 3 d Wistar 大乳鼠，每 次 10 只，购自山东大学医学院实验动物中心。 1． 1． 2 主要试剂与仪器 DMEM 培养 基 （ 南 美 Gibco 公司） ，胎牛血清（ 南美 Gibco 公司） ，Ang II （ 美国 Sigma 公司） ，NAD（ 美国 Sigma 公司） ，胰蛋 白酶（ 南美 Gibco 公司） ，DAPI（ 上海朝瑞生物科技 有限公司 ） ，引物由上海博尚生物技术有限公司合 成，TaKaRa 逆转录试剂盒（ 大连宝生物工程有限公 司） ，SYBR Green （ 大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 ） 。 IX 70-142 荧光倒置显微镜（ 日本 Olympus 公司） ， LSM 710 型激光共聚焦显微镜（ 德国 ZEISS 公司） ， 普通显微镜（ 日本 Olympus 公司） ，M YIQ Real-time PCR 仪（ 美国 Bio-RAD 公司） ，离心机（ 德国 Eppendorf 公司） ，生物安全柜（ 上海赛默生物科技发展有 限公司） ，Nano Drop 2000 可见分光光度计（ 上海赛 默生物科技发展有限公司 ） ，CO2 细胞培养箱（ 上海 赛默生物科技发展有限公司） 等。 1． 2 方法 1． 2． 1 新生大鼠心肌成纤维细胞的提取纯化和培 养 无菌条件下开胸取 Wistar 大乳鼠心室，放在盛 有 DM EM 的玻璃皿中，PBS 漂洗 2 次，剪成碎泥样， 转移到 15 mL 离心管中，加入 0． 25% 胰蛋白酶在 37 ℃ 水浴箱中消化，每次 10 min。将沉淀转移到另
0． 01) 。相对于 FAM 组，Sirt1-siRNA 转染后各组 SIRT1 mRNA 的表达减少( P ＜ 0． 05) ，而心肌成纤维细胞 I 型胶
原 mRNA 表达增多( P ＜ 0． 05) 。结论 NAD 可以抑制心肌成纤维细胞 I 型胶原 mRNA 的表达，SIRT1 影响 I 型
胶原 mRNA 的表达，它们对 Ang II 诱导的心肌纤维化有保护作用。
关键词： 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸; I 型胶原; 血管紧张素 II; 纤维化; 心肌重构; SIRT1
中图分类号： R542． 2
文献标志码Байду номын сангаас A
Effects of NAD on the mRNA expression of collagen type I induced by Angiotensin II in cardiac fibroblasts
SIRT1 和 I 型胶原 mRNA 的表达。结果 心肌成纤维细胞 I 型胶原 mRNA 的表达随着 AngⅡ浓度升高明显增加
( P ＜ 0． 05) ，呈浓度依赖性。与空白对照组比较，NAD ( 250 μmol / L ) 组 SIRT1 mRNA 表达增高( P ＜ 0． 05) 。与
AngⅡ( 1 μmol / L) 组比较，AngII ( 1 μmol / L ) + NAD ( 250 μmol / L ) 组 I 型胶原 mRNA 的表达明显减少( P ＜
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山 东 大 学 学 报 （ 医 学 版）
51 卷 3 期
肾 素 － 血 管 紧 张 素 系 统 （ renin-angiotensin system，RAS） 激活是高血压和心肌缺血等疾病的 重要特征，RAS 激活后合成和释 放 血 管 紧 张 素 II （ angiotensin II，AngII） 能够诱发一系列生理病理过 程，最终导致心衰［1-2］。AngII 通过提高 NAD （ P） H 氧化酶的产生促进细胞内 ROS 产生，诱导心肌肥厚 和调节心脏成纤维细胞的增殖及胶原代谢，引起心 肌重构［3-5］。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （ nicotinamide adenine dinucleotide，NAD ） 是生物催 化 反 应 必 不 可少的 辅 酶，在 转 录 过 程 中 发 挥 重 要 的 调 节 作 用［6］。NAD 依赖的去乙酰化酶 SIRT1 在 NAD 的 参与下调节组蛋白的乙酰化状态，对增强心脏耐受 氧化应激反应、调节心肌能量代谢及抗衰老等起着 重要作用［7-8］。本研究在体外培养原代心肌成纤维 细胞，以 Ang II 刺激原代心肌成纤维细胞模拟心肌 纤维化，探讨 NAD 和 SIRT1 在 Ang II 诱导的心肌 成纤维细胞 I 型胶原 mRNA 表达中的作用，期望为 心肌纤维化治疗提供一定思路。
Abstract： Objective To explore the effect of NAD on the mRNA expression of collagen type I induced by angiotensin II in cardiac fibroblasts in vitro． Methods Neonatal rat cardiac fibroblasts w ere isolated from w istar rats and then cultured． The generation 2-4 w ere used for the experiment and treated as follow s： control group，Ang II （ 0． 01，0． 1， 1 μmol / L） group，NAD （ 250 μmol / L ） group，Ang II （ 1 μmol / L） + NAD （ 250 μmol / L ） group，FAM group，Sirt1siRNA + AngII （ 1 μmol / L） group，Sirt1-siRNA group，Sirt1-siRNA + NAD （ 250 μmol / L） group and Sirt1-siRNA + Ang II （ 1 μmol / L） + NAD（ 250 μmol / L） group． 24 hours later，the mRNA expressions of SIRT1 and collagen I w ere measured by real time reverse transcription-polymerase chain reaction（ Real time RT-PCR） ． Results After treatment w ith Ang II for 24 hours，the mRNA expression of collagen I w as enhanced in a Ang II dose-dependent manner（ P ＜ 0． 05） ． In contrast w ith control group，the mRNA expression of SIRT1 w as enhanced after being treated w ith NAD （ 250 μmol / L） （ P ＜ 0． 05） and the mRNA expression of collagen I in AngII （ 1 μmol / L） + NAD （ 250 μmol / L） group w as attenuated compared w ith Ang II （ 1 μmol / L ） group （ P ＜ 0． 01） ． Compared w ith FAM group，SIRT1 mRNA expression w as attenuated（ P ＜ 0． 05） and collagen I mRNA expression w as increased （ P ＜ 0． 05） in the other groups． Conclusion The results suggest that NAD and SIRT1 may be beneficial to cardiac fibrosis by attenuating the mRNA expression of collagen type I induced by Ang II in cardiac fibroblatsts． Key words： Nicotinamide adenine dinucleotide； Collagen I； Angiotensin II； Fibrosis； Cardiac remodeling； SIRT1
一离心管中加入胰酶继续消化，剩余消化产物用等 体积的含 10% 小牛血清的 DM EM 终止消化，重复 上述 步 骤，直 到 沉 淀 基 本 消 化 干 净 为 止。4 ℃ ， 1 000 r / min离心 10 min，弃上清，所得细胞用含 10% 小牛血清的 DMEM 培养基溶解后转移到培 养 瓶 中，37 ℃ ，5% CO2 培养箱内差速贴壁 1． 5 h，弃培养 基，去除心 肌 细 胞，加 入 新 鲜 培 养 基 继 续 培 养，每 2 天换 1 次液，细胞长满培养瓶后按 1 ∶ 3 的比例传 代，实验采用 2 ～ 4 代细胞。 1． 2． 2 心肌成纤维细胞的鉴定 原代细胞培养至 接近融合，胰 酶 消 化，接 种 到 铺 有 载 玻 片 的 培 养 皿 中，培养至细胞接近融合状态，吸去培养液，PBS 洗 2 次，每次5 min，4% 的 甲 醛 固 定 20 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min，0． 5% TritonX-100 孵育 5 min，共 2 次，3% H2 O2 处理标本 15 min，于羊血清工作液中封 闭 30 min，加特异性成纤维细胞蛋白-1 的一抗4 ℃ 过夜。过夜后 37 ℃ 复温 15 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min，加二抗孵育 30 min，PBS 洗 3 次，每次5 min， 在载玻片上滴加含 DAPI 的封片剂，激光共聚焦显 微镜下观察并照相。 1． 2． 3 AngII 诱导大鼠心肌成纤维细胞纤维化模 型构建以及 NAD 干预 细胞在六孔板中生长至 70% 时，换含 1% 小牛血清的 DM EM 培养基，37 ℃ 继续孵育 24 h，使细胞进入生长静止期，随机分为 4 组： ①空白对照组； ②AngII（ 1 μmol / L ） 组； ③NAD （ 250 μmol / L ） 组； ④ NAD （ 250 μmol / L ） + AngII （ 1 μmol / L） 组。各组干预平行进行，NAD 预先干 预 30 min 后，加 AngII 作用 24 h，不加药物时加溶解 药物的溶剂。 1． 2． 4 Sirt1-siRNA 转染心肌成纤维细胞细胞转染 序列的筛 选 及 转 染 分 组 按 照 说 明 书 配 制 Lipofectamine2000 和 Sirt1-siRNA 转染试剂混合物。抑 制序 列 FAM Sense ： 5'-UU CUCCGAAC GUGUCACG UTT-3'； Anti-sense ： 5'-ACGUGACACGUUCGGA GAA TT-3'； Sirt1-rat-2106（ 序列 1） ： 5'-GGGAUC AAGAGGCAGUUAATT-3'，5'-UUAA CUGCCUCUUGAUCC CTT-3'； Sirt1-rat-1389 （ 序列 2） ： 5'-GAGACUGCGAUGU CAU AAUTT-3'，5'-AUUAU GACAUCGCAGUCU CTT-3'； Sirt1-rat-585 （ 序 列 3） ： 5'-CAC CUGAGUGGAUGAU AATT-3'，5'AUAUCAUCCAACUCAGGUGTT-3'，24 h 内荧光显 微镜下 观 察 Sirt1-siRNA 转 染 效 率，提 取 总 RNA， Real time RT-PCR 检测 3 条序列对 SIRT1 的抑制效 率。用抑制效率最高的序列转染细胞，将混合物按 以下分组加入到细胞中： ①FAM 组； ②FAM + Ang II