糖尿病心肌病心肌纤维化病理变化的研究

糖尿病心肌病心肌纤维化病理变化的研究
【摘要】目的研究糖尿病大鼠不同病程心肌纤维化及其相关病理的变化。

方法①制造糖尿病大鼠心肌模型随机分组；②氯胺T法测定羟脯氨酸含量，代表心肌胶原总含量。

心肌免疫组织化学染色测定心肌胶原蛋白(Collagen I、Collagen III)和心肌型α肌动蛋白(α-actin)及转化生长因子β1平均积分光密度；
③心肌病理改变的光镜和透射电镜观察。

结果糖尿病病程6个月组心肌胶原总含量明显高于病程3个月以内组(P＜0．01)。

病程3个月之后Collagen I表达伴随TGF-β1的表达开始较健康鼠明显增加(P＜0．01)。

α-actin 蛋白表达较健康鼠明显减少(P＜0．01)。

病程3个月后α-actin 蛋白表达明显减少，有糖原沉积现象。

结论Collagen I呈现持续性增加是糖尿病鼠心肌纤维化的主要原因。

TGF-β1参与了心肌纤维化发生的早期过程。

糖原沉积和心肌型actin表达减少是糖尿病心肌病病理基础。

【关键词】糖尿病心肌病变；免疫组织化学；透射电镜；胶原蛋白；心肌型α肌动蛋白转化生长因子β1
细胞学病变和心肌细胞间质纤维沉积及纤维化是临床上引起心肌舒张功能受损及糖尿病心肌病的一种重要因素。

间质性胶原基质围绕在心肌细胞的周围，以支持心肌细胞的正常结构及冠脉的微循环结构与功能的完整性。

除此之外，间质性胶原还决定着心室舒张功能及心室体积的大小，协调由心肌细胞产生的收缩力向心室腔中的传导[1]。

因此，心脏中的间质性胶原基质蛋白成分的降解或胶原成分过度的产生，都将破坏心肌的力学性质、心室的结构与功能。

研究资料表明[2]，心肌病变时心肌细胞骨架蛋白发生了异常表达。

但糖尿病心肌病细胞骨架蛋白病理性表达尚有不同的观点。

1 材料和方法
1．1 动物体质量250~300 g大鼠36只，其中18只健康大鼠，18只为糖尿病大鼠。

随机分为6组：糖尿病大鼠1个月组(DM 1)、3个月组(DM 3)、6个月组(DM 6)和健康大鼠1个月组(C 1)、3个月组(C 3)、6个月组(C 6)。

每组大鼠各6只随机筛选入实验。

各组分别于1个月、3个月和6个月切取左心室4 mm厚组织2块，将一份标本立即放入冻存管中，放入液氮中保存，待测心肌羟氨酸含量；一份标本于4℃的10%福尔马林溶液中固定24 h，石蜡包埋，待测心肌细胞内胶原蛋白和转化生长因子β1及肌动蛋白含量。

1．2 方法
1．2．1 测定心肌胶原总含量称取冰冻左心室心肌组织100 mg，网搓匀浆后将组织粉末置于6M的HCL液2 ml中125℃酸解5 h，用6 ml的NaOH液滴定至pH为7，然后2 000 r/min离心10 min，取上清液1 ml加柠檬酸缓冲液0．5 ml、0．05 M氯胺T 1 ml，混匀氧化6 min；加3．15 ml的过氯酸1 ml，混匀放置5 min，再加10%对二氨苯甲醛1 ml，80℃水浴中放置6 min，取出后冰水浴
中放置30 min，UV-1206型分光光度计560 nm处比色测定。

同时用1~10 μg的羟脯氨酸标准品按上述相同步骤制作标准曲线。

对照标准曲线，求得羟脯氨酸含量，然后换算成每克心肌组织中羟脯氨酸含量，再乘以7．46即得心肌胶原总含量。

1．2．2 心肌免疫组织化学染色采用石蜡切片①载玻片防脱片剂处理；②切片常规脱蜡至水；③蒸馏水新鲜配置3%H2O2；④热修复抗原；⑤滴加正常羊血清封闭液；⑥滴加1∶100稀释一抗；⑦滴加生物素化兔抗小鼠IgG；
⑧滴加试剂SABC；⑨DAB显色；⑩苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。

1．2．3 采用显微图像分析仪进行Collagen I、Collagen III、TGF-β1和心肌型α-actin 蛋白积分光密度分析，计算平均积分光密度。

1．2．4 光镜标本的制备石蜡包埋心肌标本切片，切片厚 4 μm，做心肌胶原MASSON染色。

1．2．5 透射电镜标本的制备:心肌标本用锇酸固定，PBS洗5 min×4，酒精梯度脱水，丙酮梯度脱水，氧树脂浸透包埋，温箱聚合，超薄切片(70 nm)。

1．3 统计学处理所有测试数据以均值±标准差(x±s)表示。

经SPSS 11．0计算机数理系统软件，进行单因素方差分析。

以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果
2．1 实验性糖尿病大鼠心肌胶原总含量健康大鼠合并为c组,发病1个月后心肌胶原总含量明显增加,与健康大鼠组比较差异有统计学意义(P＜0．05)。

6个月组心肌胶原总含量明显高于病程3个月以内组(P＜0．01)。

见表1。

2．2 胶原蛋白和和转化生长因子及心肌型肌动蛋白表达糖尿病程1个月后
III型胶原蛋白表达明显增加，3个月达到高峰。

3个月之后I型胶原蛋白表达伴随TGF-β1的表达明显增加。

6个月后TGF-β1的表达减少略下降，病程1个月内心肌细胞心肌型α-actin 蛋白表达减少,但同健康鼠比较,差异无统计学意义(P ＞0．05)。

3~6个月后心肌细胞心肌型α-actin 蛋白表达明显减少。

病程1个月、3个月和6个月之间心肌细胞心肌型α-actin 蛋白表达差异均有统计学意义(P＜0．05)，见表2。

2．3 光镜(400倍)下观察免疫组织化学染色光镜下观察。

6个月糖尿病大鼠I型胶原蛋白表达在细胞浆呈大量弥漫性分布。

3个月糖尿病大鼠I型胶原蛋白表达在细胞浆分布明显少于6个月糖尿病大鼠。

1个月糖尿病大鼠I型胶原蛋白表达和对照组看不出区别。

健康大鼠心肌细胞心肌型α-actin 蛋白均匀分布于心肌细胞质内、呈深褐色。

糖尿病大鼠心肌细胞心肌型α-actin蛋白分布不均匀，呈浅黄色，主要分布于心肌肌膜处。

2．4 透射电镜观察健康大鼠心肌细胞心肌型α-actin 蛋白主要表达于心肌胞质线粒体周围，细胞核完整呈椭圆形，线粒体显示清楚，均匀排列、致密，闰盘连续。

1个月糖尿病大鼠α-actin 蛋白表达略减少，心肌线粒体显示清楚，均匀排列、致密，细胞核形态基本正常。

3个月大鼠心肌细胞核皱缩，线粒体肿胀、模糊，闰盘不连续，α-actin 蛋白表达明显减少，有糖原沉积现象。

6个月糖尿病大鼠α-actin 蛋白仅散在表达，心肌线粒体显示不清楚，排列无序，闰盘扭曲、短裂，缝隙加大，细胞核畸形，有糖原大量沉积现象。

3 讨论
糖尿病心肌病起重要作用的因素之一是心肌间质的纤维化，胶原大量沉积，增加了心室壁的僵硬度，降低了心室顺应性，致心室收缩及舒张功能不全。

本实验中，糖尿病3个月组和6个月组心肌胶原含量均显著高于健康组,表明自糖尿病发生后较早期就开始出现胶原的增生，特别是糖尿病鼠I型胶原蛋白表达在心肌细胞浆的广泛性、弥漫性表达随病程逐渐增多。

III型胶原蛋白表达先有增加，6个月后表达开始减少，这种变化与TGF-β1在心肌细胞浆表达消长相一致，推测III型胶原蛋白的表达可能受TGF-β1信号通道所调控。

本研究结果表明，糖尿病心肌纤维化的发展呈渐进性的过程。

病理结果显示糖尿病鼠3个月后心肌纤维化的表现开始明显。

细胞内胶原数量明显增多，心肌间质纤维增多，分布紊乱。

本文研究发现，主要是心肌Ⅰ型胶原表达出现明显增多，使糖尿病鼠心肌纤维增粗，心肌僵硬度增加。

因此，对糖尿病早期进行干预性治疗，将有利于推迟心肌纤维化的发生和心功能改变。

笔者主要研究的是心肌
细胞actin，特别是糖尿病鼠心肌细胞内心肌型actin的研究少有报道。

本文研究表明，糖尿病大鼠心肌细胞心肌型α-actin 蛋白表达减少发生于患病3个月以后，6个月心肌型α-actin 蛋白表达更加减少。

Depre等[3]认为糖尿病鼠心脏型α-actin mRNA表达减少,异常表达发生于糖尿病的慢性阶段。

糖尿病α-actin 减少可能改变了心脏能量的基础代谢和基因表达，是糖尿病心肌病的发生机制之一。

参考文献
1 Weber KT.The lonely failing heart:a case for ECM genes.Cardiovasular Research,2002,30(6):835.
2 Zhou X,Hurst RD,Templeton D,et al.High glucose alters action assembly in glomerular mesangial and epithelial b Invest,2001,73(3):327-383.
3 Depre C,Young ME,Ying J,et al.Streptozotocin-induced changes in cardiac gene expression in the absence of severe contrctile dysfunction.J Mol Cell Cardiol,2000,32(6):985-996.。