第八章 植物细胞培养与次生代谢产物生产
植物组织细胞培养技术生产此生代谢产物
植物组织细胞培养技术生产次生代谢产物的应用摘要：植物组织细胞培养是现代生物技术应用最重要的一个方面，它是一个应用广泛和快速发展的技术。
植物组织细胞培养技术已应用于植物次生代谢产物的生产，并取得很大成效。
本文讲述组织细胞培养技术在药物、食品、化妆品等方面的次生代谢产物生产的一些应用，以及总结了现在主要植物组织培养技术、植物组织培养技术在实践中的应用。
关键词：次生代谢产物细胞培养代谢产物植物的次生代谢产生的活性物质成分已被人类广泛应用，主要集中在研究制药(如如抗癌药物紫杉醇、疗伤药物紫草宁、保健药物人参皂甙等)、食品添加剂(如生姜、香子兰等)、调味剂(如胡椒、留兰香等)、食用色素(如花青素等)、油料(如如豆寇油、春黄菊油等)、饮料(如咖啡、可可等)、树胶(如阿拉伯胶等)、化妆品、生物杀虫剂和农用化学品等方面。
尽管有些植物次生代谢物质并不是很多，但它们与人类健康密切相关，已成为当前生物领域研究关注的重点。
因此许多植物代谢产物以组织细胞培养技术的方法开发利用，进行大规模生产，使植物次生代谢物质产量和活性提高。
1 植物组织培养技术在实践中的应用[1]21世纪是生物技术迅速发展的世纪，而植物组织培养技术是生物技术中的重要内容，可以用于：植物育种已被越来越广泛的用于扦插难生根植物、引种材料少的植物。
除常规的用器官进行培养，也可以用花药进行花粉单倍体植株育种，这种方法技术简单，对一些植物种来说易于诱导未成熟花粉的分裂，可以进行大群体研究，可以迅速而大量的产生单倍体，具有迅速纯合、选择效率高、排除杂种优势干扰、突变体筛选、消除致死基因等优点。
用于脱毒和离体快繁获得脱除病毒的材料和用于植物材料快速繁殖这方面是目前植物细胞组织培养应用最多最有效的一方面. 世界上受病毒危害的植物很多，而园艺植物受病毒危害更为严重，当植物被病毒侵染后，常常造成生长迟缓、品质变劣、产量大幅度降低等危害，目前，已经在马铃薯、甘薯、草莓、大蒜、苹果、香蕉等多种作物上大规模应用;离体培养的优点就是快速，而且材料来源单一，遗传背景一致，不受季节和地区的限制，重复性好，所以离体快速繁殖已经广泛应用于果树，中药材等的栽培。
植物细胞培养生产次级代谢产物的影响因素与对策
植物细胞培养生产次级代谢产物的影响因素与对策植物细胞培养技术是将植物体的某一部分经过无菌处理，置于人工培养基上使其细胞增殖，进而按需要进行培养的技术。
利用植物细胞培养技术生产有用代谢产物，已成为继微生物技术以后当代生物技术重要的发展领域。
据不完全统计，我国已对400多种植物建立了组织和细胞培养体系，并从中分离出600多种代谢产物。
1外植体的影响同一植株不同部位的组织进行培养时，其产物或产物积累量不同。
银杏叶来源的愈伤组织黄酮含量为1.5%，茎段来源的愈伤组织为1.0%，而子叶来源的愈伤组织仅为0.3%。
Mischenko等[3]在茜草愈伤组织培养过程中发现，来源于叶柄和茎的愈伤组织蒽醌累积量比来源于茎尖和叶的愈伤组织高。
徐咏梅等对杜仲乔林与叶林2种栽培模式下树皮中次生代谢物的含量差异研究发现，乔林树皮中杜仲醇、总黄酮和杜仲胶的含量均比叶林树皮中的高，而叶林树皮中绿原酸、京尼平甙酸和桃叶珊瑚甙比乔林树皮中的高。
因此，利用植物细胞培养生产次生代谢物时，选择能诱导出疏松易碎、生长快速且具有较高次生代谢物合成能力的愈伤组织的外植体非常重要。
2培养基的影响2.1培养基种类在细胞培养中，愈伤组织生长和次生代谢物产生的最佳培养基一般是不一致的。
钟青平等研究不同培养条件下的栀子愈伤组织生长和栀子黄色素的产生时发现，B5、MG-5基本培养基有利于愈伤组织生长；M-9基本培养基有利于黄色素合成。
甘烦远等认为MC培养基对红花愈伤组织生长和生育酚的形成最有效。
因此在组织培养时可以采用二步培养法，根据生长及代谢的需要，调整基本培养基。
2.2培养基组分2.2.1碳源不同的培养细胞适合生长和次生代谢物积累的碳源种类不同。
郑穗平等，在研究玫瑰茄细胞生长和花青素生成时发现，蔗糖作为碳源，细胞的生长量高，葡萄糖作为碳源，细胞花青素的含量高。
赵德修等研究发现，5%蔗糖+1%葡萄糖组合对雪莲愈伤组织生长不仅有利，而且细胞中总黄酮的含量也最高。
次生代谢产物 PPT
大家好
1
植物次生代谢产物的概述 研究现状 植物细胞大规模培养生产次生代谢
产物的基本程序 提高次生代谢物生产效率的途径与
方法 应用实例 前景展望
大家好
2
植物次生代谢产物是指植物中一大类并 非植物生长发育所必需的小分子有机化 合物，其产生和分布通常有种属、器官 组织和生长发育期的特异性。
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pH：培养基的pH值与细胞生长繁殖以及次生 代谢产物的生产关系密切，与培养温度相似， 细胞的生长繁殖与次生代谢产物合成时所需 的pH值通常并不一致，需要在不同的阶段控 制不同的pH值。
电场：膜周电泳学说认为对细胞施加稳定的 电场能够导致膜中带电物质的重新分配，最 终导致原生质体生长和分化效应。
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合适的培养条件
物理因素：
温度：植物细胞培养的最适温度一般为 25℃，但不同的植物种类略有差异，而 且植物细胞生长和次生代谢产物的合成 所需的温度并不一致，因此选择合理的 培养温度并进行相应的调控对于细胞生 长以及产物合成十分关键。
光照：光强、光质和光照时间对细胞的 生长和次生代谢产物的合成都具有一定 的影响。不同的光照情况要根据不同的 植物细胞来设定。
大家好
16
因此充分利用基因工程的手段，筛选高 产细胞系，深入研究特定代谢产物的生 物合成途径，对培养条件进行优化，研 究和开发适合植物细胞培养的生物反应 器是解决这些问题的根本途径。
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提高次生代谢产物生产效 率的途径和方法：
选择合适的外植体 筛选得到高产细胞系（株） 寻求合适的培养条件和培养技术
大家好
10
植物次生代谢产品的市场潜能
大家好
次生代谢产物
1～2
植物细胞培养
3周
14
Examples of enhancement in natural product yield in selected cell lines compare with parent plant material. (After Fowler, 1983)
Chemical product plant Cell yield (% DW) Whole Ratio cell plant yield / yield (% DW) whole plant 0.1 2.1 2.2 3.0 0.3 0.5 2.0 10 2 8 9 7 3 2
外植体的选择
不同外植体的愈伤组织诱导能力和诱导 的愈伤组织合成次级代谢产物能力均不 同 ,所以 ,在利用植物细胞悬浮培养生 产次生代谢产物时 ,选择能诱导出疏松 易碎 ,生长快速且具有较高次生代谢产 物合成能力的愈伤组织的外植体是非常 重要的。 如在茜草愈伤组织培养过程中 ,来源于 叶柄和茎的愈伤组织蒽醌累积量比来源 于茎尖和叶的愈伤组织高。
然而
随着人们对植物资源尤其是药用植物的利 用度日益增加，使不少植物资源处于濒危 状态。面对着植物有限的蕴藏量，如何进 行合理有效地开发利用是我们亟待解决的 问题。 自从20世纪50年代提出用植物细胞大量培 养作为工业化生产植物次生代谢产物的一 条途径以来，实践表明，采用植物细胞培 养技术生产次生代谢产物是解决资源问题 的较为有效的途径。
Glutathione Nicotine Anthraquinones Rosmarinic acid Ajmalicine SErpentine Diosgenin
N. tabacum N. tabacum M.citrifolia C. blumei C.roseus C. roseus D.deltoidea
植物细胞培养生产次生代谢产物的研究进展
植物细胞培养生产次生代谢产物的研究进展植物细胞培养生产次生代谢产物的研究进展08生物科学081003011 余芸摘要：利用植物细胞培养生产代谢产物具有十分广阔的前景。
对利用植物细胞培养技术生产次生代谢产物的条件控制、生产方法和在制药工业上的应用进行了综述,并对该技术的发展趋势进行了展望。
关键字：植物细胞培养次生代谢产物工业应用植物细胞培养始于本世纪初，并不可争议地具有工业化潜力。
目前植物细胞培养生产的化合物很多，包括糖类、酚类、脂类、蛋白质、核酸以及帖类和生物碱等初生和次生代谢产物，植物细胞培养的应用主要包括以下3个方面：有用物质（次生代谢产物）的生产；植物无性系的快速繁殖和遗传突变体的筛选；植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的深入研究。
但是由于植物细胞大规模培养技术的局限性使得植物细胞仍难以实现大规模工业化生产，迫切需要进一步研究和发展细胞培养条件的优化控制及其工艺。
1 植物细胞培养技术生产次生代谢产物的研究历史及现状植物次生代谢的概念是在1891年南KOSS—ZEL首先明确提出的[1]。
植物细胞培养技术源于德国著名植物学家HABERLANDT(1902)提出的细胞全能性学说。
植物细胞具备生物合成的全能性，即每个培养细胞保留着完整的遗传信息，能生产所有母体植物中合成的化学物质。
1．1植物细胞培养技术特点与其它的方法相比，应用植物细胞培养技术生产次生代谢产物爨有以下优点：(1)能够保证产物在一个限定的生产系统中连续、均匀生产，不受病虫害、地理和季节等各种环境因素的影响；(2)可以在生物反应器中进行大规模培养，并通过控制环境条件得到超过整株植物产量的代谢产物；(3)所获得的产物可从培养体系内直接提取，并快速、高效的回收与利用，简化了分离与纯化的步骤；(4)有利于细胞筛选、生物转化，合成新的有效成分[2]。
；(5)有利于研究植物的代谢途径，还可以利用某些基因工程手段探索与创造薪的合成路线，得到价值更高的产品；(6)节省大量用于种植原料的农田，以便进行粮食作物的生产。
第八章——植物细胞培养
4、PH和二氧化碳浓度
在悬浮培养时，PH变动相当大。加入EDTA使铁和其他金属离 子长期处于可利用状态。硝态氮和铵态氮之间进行调整可作 为稳定PH的一种方法。
二氧化碳对细胞培养没有太大影响，但在低密度细胞培养中， 二氧化碳对于诱导细胞分裂可能有重要作用。
植物细胞生长和活力的测定
一、悬浮培养中细胞生长的测定 1、细胞计数：把1份培养液加入到2份8%三氯化铬溶液中，在 70℃下加热2-15分钟，然后将混合物冷却，用力震荡10分钟，用 血球计数板进行细胞计数。 2、细胞总体积：将已知体积的均匀分散的悬浮液放入1个15ml刻 度离心管中，在2000g下离心5min，得到细胞沉积的体积。 细胞密实体积（PCV）：以每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。
第八章-植物细胞培养
植物细胞培养简介
• 概念： 在培养基中培养彼此分离的细胞、使之生长、 增殖或分化。 包括固体培养和液体培养2种形式。
固体培养(solid culture)
• 在固体培养基中培养细胞=静止培养。细胞被固定、 不能移动；单细胞分裂后形成细胞团。
优缺点: 1）所得到的各个细胞团均为单细胞形成，遗传成分和 生理特性具有一致性； 2）细胞生长速度较慢； 3）不能长期、连续、大规模培养细胞。
烟草细胞接种密度和植板率
影响植板率的因素
(4) 培养基成分：用营养成分丰富的培养基或条 件化培养基，植板率高。 (5) 培养方式：采用看护培养（nurse culture） 是可以提高植板率。 平板培养是分离、筛选单细胞无性系的有效方法
看护培养（nurse culture）
植物细胞大规模培养生产次生代谢物质
如某个或某种类型的植物细胞是怎样生长、分裂和分化 的？化学物质（激素等）或者物理因素（重力、压力）等是 怎样影响这些过程的？
植物细胞培养(Plant cell culture)
四、悬浮培养细胞的同步化
低温处理 提高培养体系中细胞同步化的程度
第二节 单细胞培养
细胞平板培养(cell 细胞平板培养(cell plating culture) 植板率: 植板率:能长出细胞团的单细胞在接种单 细胞中所占的比例. 细胞中所占的比例.
看护培养(nurse 看护培养(nurse culture)
四、悬浮培养细胞的同步化
分选法 通过细胞体积大小分级, 通过细胞体积大小分级,直接将处 于相同周期的细胞进行分选, 于相同周期的细胞进行分选,然后将同 一状态的细胞继代培养于同一培养体系 中. 梯度离心法 流式细胞仪
四、悬浮培养细胞的同步化
饥饿法 饥饿导致细胞分裂受阻, 饥饿导致细胞分裂受阻,使细胞不能合成 DNA,即不能进入S DNA,即不能进入S期;或细胞分裂不能进 行,即不能进入M期. 即不能进入M 抑制剂法(5-氟脱氧尿苷,羟基尿) 抑制剂法(5-氟脱氧尿苷,羟基尿) 通过一些DNA合成抑制剂处理细胞, 通过一些DNA合成抑制剂处理细胞,使 细胞滞留在DNA合成前期, 细胞滞留在DNA合成前期,当解除抑制 后,即可获得处于同一细胞周期---G1期的 即可获得处于同一细胞周期---G 同步化细胞. 同步化细胞.
三、悬浮细胞的生长动态
生长呈S 生长呈S形生长曲线 起始密度(x 起始密度(x0):0.5x105-2.5x105 生长速率(p) 生长速率(p) p=(lnxp=(lnx-lnx0)/t 单位体积细胞重量 鲜重:按一定体积取样, 鲜重:按一定体积取样,经真空过滤后称重 干重:真空过滤后, 80℃条件下烘干细 干重:真空过滤后,在80℃条件下烘干细 胞至恒重
植物细胞规模化培养体系的建立
半连续培养(semi半连续培养(semi-continuous culture) 两步培养法 生长培养基 合成培养基
植物细胞培养和次生产物制备PPT讲稿
1、愈伤组织诱导
要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一 般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。
适于悬浮培养
适于再生植株
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如何获得符合要求的愈伤组织？
1、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶
是最常用的外植体，特别是幼胚。
➢ 发根农杆菌感染双子夜植物，RI质粒诱导产生毛状根。 ➢ 形态方面：Ri质粒诱导快速生长的、非定向性、高分支的
毛状根的形成
➢代谢方面：Ri质粒转化根能合成与原植物相同或相
似的次生代谢物，并且发根合成次生代谢物具有遗 传稳定性。
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➢ 毛状根生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从
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成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件： 1、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一
般在 30～50个细胞以下，在实际培养中 很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系 。
2、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相
同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养 基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡 黄色。 3、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般 2～3天甚至更短时间便可增加1倍。
稳定期：细胞数稳定。细胞高液泡化，极度脆弱，高
度分化及有机化合物的高浓度。
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➢ （1）植物细胞有独特的培养时间及特征：重量的增加在
对数期，次生代谢产物在稳定期积累
➢ （2）植物细胞很少单一细胞生长，对数生长后期分泌量
蛋白和粘多糖，以非均相集合的细胞团悬浮生长。
➢ （3）植物细胞好气，培养过程中需供气及搅拌，但
植物细胞培养与次级代谢产物制备
（3）液体浅层静置培养
将一定密度的悬浮细胞接种在三角瓶中封口静 置培养。
细胞工程 Chapter 5
（4）细胞同步化培养
①体积选择法：用大、小孔径筛网过滤、收集单 细胞。 ②冷处理法：4℃低温下处理几天使细胞同步化 后，再添加新的培养液培养。 ③饥饿法：控制营养液浓度，通过饥饿使细胞达 到同步化，再添加营养液培养。 ④抑制法：使用抑制剂如尿苷、5-氟脱氧尿苷、 秋水仙素等使细胞达到同步化。
细胞工程 Chapter 5
§5.2 植物细胞培养技术
1、植物细胞培养基
无机盐（大量、微量） 碳源（蔗糖） 有机氮源（水解酪蛋白） 有机酸、维生素 植物生长激素等
细胞工程 Chapter 5 Copyright © 2011 Wang Weidong, All rights reserved.
（3）人工诱变筛选细胞株
在前面筛选的基础上，用诱变剂筛选，系统包括：
①悬浮培养系统： 诱变剂处理后，根据悬浮培养系统中细胞生长较 快、细胞群体比较均匀的特点进行筛选。 ②愈伤组织系统：
对愈伤组织诱变处理后，再通过选择压进行筛选。
③原生质体系统： 裸露的原生体容易进行诱变和筛选。
3.2 细胞株保存
细胞工程 Chapter 5
由愈伤组织分离单细胞步骤
3）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物
优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。
悬浮振荡培养
4）振动或酶解处理，获得单细胞。
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植物次生代谢产物生产
优势:
投资小, 成本低; 使用安全, 植物细胞的培养条件简单, 易于成活; 便于进行遗传操作; 经转化后的目的细胞系易于储藏, 方便生产。
主要方法:
土壤农杆菌介导转化法; 重组病毒感染植株; 基因枪转化法; 花粉管通道转化法。
反义技术
• 反义技术：利用现代分子生物学技术, 将人工合成的反义
RNA 导入到植物基因组内, 与要抑制的代谢途径的关键酶基 因RNA 结合形成双链RNA 来阻断基因的正常表达, 进而促 进目的基因的表达。
次生代谢产物(secondary metabolites)是指植物体内的一大
类细胞生命活动或植物生长发育正常运行非必需的小分子 有机化合物，其产生和分布通常具有种属、器官、组织和 生长发育期的特异性，次生产物在植物中的合成与分解过 程称为次生代谢(secondary metabolism) 。
细胞培养核心理论依据：
提高植物细胞培养中次生代谢 产物产量的方法
前言
初生代谢(primary metabolism)是指能使营养物质转换成细
胞结构物质、维持细胞正常的生命活动或能量的代谢，初 生代谢的产物称为初生代谢产物(primary metabolites)， 如糖、蛋白质、脂类、核酸等。它们是维持细胞生命活动 所必需的。
发根培养
发根(hairy root)：是整体植物或其某一器官、组织(包括
愈伤组织)、单个细胞甚至原生质体受发根农杆菌感染所产 生的一种病理现象，它起源于单个细胞，形成多分支、生 长迅速的不定根。
优势：具有生长迅速且无需添加外源激素、拥有亲本植株的
特征次生代谢途径和遗传稳定性、处于分化状态等特点， 尤其是它的生长迅速和稳定性的特点是工业化生产梦寐以 求的，也是细胞培养和一般器官培养所不能兼备的。
植物细胞培养生产次生代谢产物中的影响因素
植物细胞培养生产次生代谢产物中的影响因素论文导读：植物细胞培养是获得植物有用代谢产物的来源。
但由于许多次生代谢产物储存于液泡里。
并诱导植物细胞次生代谢产物的释放。
关键词：植物细胞培养，次生代谢产物，诱导，两相培养法天然药物是药物的一个重要的组成成分，它来自于植物、动物、矿物和微生物，但以种类繁多的植物为主。
天然药物之所以能防病治病，其物质基础是其中所含有的有效成分，包括一系列的植物细胞次生代谢产物[1] 。
而目前由于环境恶化的影响，一些天然的药用植物近乎灭绝，还有一些由于生境特异，生长缓慢，人工栽培困难，加上长期以来的粗放型和掠夺性的开采，其资源已严重匮乏，自然资源已难以满足日夜增长的临床需要。
因此，应用现代生物技术进行天然药用植物细胞大规模培养提取获得医疗、化妆等所需的活性成分来满足日益增长的市场需求，已在实践中得到了应用。
植物细胞培养是获得植物有用代谢产物的来源。
目前植物细胞培养难以工业放大的一个关键问题是生产技术成本过高，虽然实现了植物细胞的连续使用，减少由于接种量过高而产生的附加成本，缩短培养周期。
但由于许多次生代谢产物储存于液泡里，释放量很少或根本不释放，限制了植物细胞培养技术在工业上的应用，同时也增加了后期分离产物的操作难度，为此如何在适当的条件下优化植物细胞的培养，并诱导植物细胞次生代谢产物的释放，就显得尤为重要。
本文就此从以下方面进行综述。
1.培养条件的调控1.1PH值的影响培养基的酸度对植物细胞代谢产物的分泌很重要，一些次级代谢产物是与H+通过对运方式跨膜传递的。
由于细胞膜两侧的PH值差控制对运的方向，因此当培养基中的PH值降低时，即培养基中的H+离子浓度升高时，就会促使次生代谢产物向胞外运输，而H+会向胞内运输。
如降低培养基的PH值，可有效提高大麦细胞释放七叶氰；高山红景天细胞红景天氰的释放实验也得到同样的效果[2] 。
因此，在植物细胞培养过程中，通常PH作为一个重要的参数被控制在一定的范围内，植物细胞培养的适宜PH值一般为5-6。
植物细胞培养生产次生代谢产物的影响
植物细胞培养生产次生代谢产物的影响植物细胞培养条件温度：培养温度对植物细胞生长及二次代谢产物生成有重要影响。
通常，植物细胞培养采用25℃。
搅拌：在摇瓶实验中，通常摇床的转速取90―120r／min。
pH值：通过细胞膜进行的H+离子传递对细胞的生育环境、生理活性来说无疑是重要的。
在培养过程中，通常pH作为一个重要参数被控制在一定范围内。
植物细胞培养的适宜pH值一般为5―6。
通气：通气是细胞液体深层培养重要的物理化学因子。
好气培养系统的通气与混合及搅拌是相互关联的。
对摇瓶试验，通常500m1的三角瓶内装80―200m1的植物细胞培养液较适宜。
当然，气液传质还与瓶塞的材料有关。
试验表明，从溶氧速率考虑，以棉花塞最好，微孔硅橡胶塞次之，铝箔塞最差。
光：光对植物有着特殊的作用。
光照射条件不仅通过光照周期、光的质量(即种类、波长)而且通过光照量(光强度)的调节来影响植物细胞的生理特性和培养特性。
研究表明，光调节着细胞中的关键酶的活性，有时光能大大促进代谢产物的生成，有时却起着阻害作用。
细胞龄：在培养过程的不同时期，细胞的生理状况、生长与物质生产能力差异显著。
而且，使用不同细胞龄的种细胞，其后代的生长与物质生产状况也会大不一样。
通常，使用处于对数生长期后期或稳定期前期的细胞作为接种细胞较合适。
接种量：在植物细胞培养中，接种量也是一个影响因素。
在再次培养中，往往取前次培养液的5―20％作为种液，也以接种细胞湿重为基准，其接种浓度为15―50g(湿细胞)／L。
由于接种量对细胞产率及二次代谢物质的生产有一定影响，故应根据不同的培养对象通过试验，确定其最大接种量。
影响植物细胞培养的因素植物细胞生长和产物合成动力学也可分为三种类型：①生长偶联型，产物的合成与细胞的生长呈正比；②中间型，产物仅在细胞生长一段时间后才能合成，但细胞生长停止时，产物合成也停止；③非生长偶联型，产物只有在细胞生长停止时才能合成。
事实上，由于细胞培养过程较复杂，细胞生长和次级代谢物的合成很少符合以上模式，特别是在较大的细胞群体中，由于各细胞所处的生理阶段不同，细胞生长和产物合成也许是群体中部分细胞代谢的结果。
植物细胞培养生产次生代谢产物及其应用前景
植物细胞培养的基本过程
植物细胞培养技术的特点
• 与其它的方法相比，应用植物细胞培养技术生产次生代谢 产物爨有以下优点：(1)能够保证产物在一个限定的生产系 统中连续、均匀生产，不受病虫害、地理和季节等各种环 境因素的影响；(2)可以在生物反应器中进行大规模培养， 并通过控制环境条件得到超过整株植物产量的代谢产物； (3)所获得的产物可从培养体系内直接提取，并快速、高效 的回收与利用，简化了分离与纯化的步骤；(4)有利于细胞 筛选、生物转化，合成新的有效成分[2]。；(5)有利于研 究植物的代谢途径，还可以利用某些基因工程手段探索与 创造薪的合成路线，得到价值更高的产品；(6)节省大量用 于种植原料的农田，以便进行粮食作物的生产。
什么是植物组织培养 植物细胞培养是将离体的植物器官、组织或细 胞，在培养了一段时间后，会通过细胞分裂， 形成愈伤组织。由高度分化的植物器官、组织 或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的 脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤 组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽 等器官，这个过程叫做再分化。再分化形成的 试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物 体。依据的原理是植物细胞的全能性 .
• 20世纪70年代以后，该技术有所发展，利用植物细胞工程技术生产一 些药用有效成分在工业上获得成功，据20世纪80年代末期的统计，当 时全世界有40多种植物的细胞培养工程研究获得成功，部分悬浮细胞 培养体系中次生物质的产量达到或超过整体植株的产量，有些药用植 物的研究达到中试水平，其中利用紫草悬浮细胞培养生产紫草宁的成 功令人瞩目[5]。1984年日本的Mitsui公司利用紫草生产紫草宁规模达 到750 L，产物最终浓度达到1400 mg／L。
植物细胞培养技术生产此生代谢产 物的发展
植物细胞培养与次生代谢产物再工业生产方面的前景
植物细胞培养与次生代谢产物在工业生产方面的前景【摘要】许多植物次生代谢产物是常用的药物制品、优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。
本文主要讲述了植物细胞培养产生的次生代谢产物在工业各方面的重要作用、开发以及大规模生产应用。
【关键词】植物组织细胞培养次生产物工业生产【正文】植物细胞培养始于本世纪初，并不可争议地具有工业化潜力。
目前植物细胞培养生产的化合物很多，包括糖类、酚类、脂类、蛋白质、核酸以及帖类和生物碱等初生和次生代谢产物，而植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。
李时珍（1593）在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来自植物。
其药物的有效成分均为次生产物。
这些次生代谢活性物质成分已被人类广泛应用，主要集中在研究制药、食品添加剂、调味剂、食用色素、油料、饮料、树胶、化妆品、生物杀虫剂和农用化学品等方面。
尽管有些植物次生代谢物质并不是很多，但它们与人类健康密切相关，已成为当前生物领域研究关注的重点。
因此许多植物代谢产物以组织细胞培养技术的方法开发利用，进行大规模生产，使植物次生代谢物质产量和活性提高。
一、在制药工业方面的应用药用植物次生代谢物种类繁多，化学结构迥异。
这些次生代谢产物可分为苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、类萜、甾体及其甙、生物碱七大类。
还有人根据次生产物的生源途径分为酚类化合物、类萜类化合物、含氮化合物(如生物碱)等三大类，据报道每一大类的已知化合物都有数千种甚至数万种以上。
在次生代谢产物的生产中, 药用植物细胞培养技术是通过给予体外生长的植物细胞一定的营养条件, 使其生长, 并根据植物或植物不同组织的细胞调节生长条件来获取所需的次生代谢产物的生物技术。
由于植物体内的任何一个细胞都包含有整体植物全部的遗传信息, 在一定条件下具有发育成一个完整植株的能力, 所以通过细胞培养技术可得到药用植物的次生代谢产物。
药用植物细胞培养的最初目的是为了研究植物的生理和生化代谢。
植物细胞培养及次生产物代谢生产
细胞固定化培养技术按照其支持物不 同可以分为两大类：
包埋式固定化培养系统：支持物多采 用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等 ；
附着式固定化培养系统：支持物采用 尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。
（四）、利用细胞培养生产有用物质
第四章
植物细胞培养及次生产物代谢生产
一、悬浮培养
二、单细胞培养 三、植物细胞的规模化培养及有
用物质生产
一、悬浮培养（cell suspension culture）
悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个 游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖 的技术。
1、愈伤组织诱导
要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外 观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状， 松散易碎。
Circulation through an external loop
旋转式培养系统 一般用于产品中试或某些必需裂解细
胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制 精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。
②固定化培养系统
这一技术的优点在于： 可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研
究特定的代谢途径，并便于调节； 细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所
平板培养中细胞密度和培养基成分是培养成功的关键，而细胞密度 和培养基成分互相依赖（负相关）。
2、看护培养
看护培养（nurse culture）：是由Muir1954年设计的。
操作方法： 在固体培养基上置入一块 活跃生长的愈组织，再在愈 伤组织上放一小片滤纸，待 滤纸湿润后将细胞接种于滤 纸上。当培养细胞长出微小 细胞团以后，将其直接转至 琼脂培养基上让其 迅速生长
第8章 植物细胞培养及次生代谢物质生产
植物细胞培养过程中的氧传递
氧对植物细胞的生长来说是很重要的，但是CO2的含量水平对 细胞的生长同样相当重要。研究发现，植物细胞能非光合地固 定一定浓度的 CO2 ，如在空气中混以 2%-4%的 CO2能够消除 高通气速率对长春花细胞生长和次级代谢物产率的影响。因此， 对植物细胞培养来说，在要求培养液充分混合的同时， CO2 和氧气的浓度只有达到某一平衡时，才会很好地生长，所以植 物细胞培养有时间需要通入一定量的CO2等气体。四、植物单细胞培养方法植物细胞培养的特性有：
1植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁．细胞 耐拉不耐扭，抵抗剪切力差； 2培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素 ； 3细胞生长的中期及对数期．易凝聚为直径达350JJm一400 Pm的团块，悬浮培养较难； 4培养时需供氧，培养液粘度大，能耐受湿力通风搅拌： 5具有群体效应、无锚地依赖性及接触抑制性；
8.1 植物的单细胞培养
一、外植体的选择 （一）用于直接分离细胞的外植体的选择 • 选择细胞之间粘结程度较少的植物组织、器官。 • 叶片组织是直接分离单细胞的最好材料。 • 1965年Ball首次从花生成熟叶片中分离了离体细胞。
二、外植体的预处理
（一）消毒处理 （二）外植体的其它处理 1、预培养 • 可以减轻醌类物质等其他有害物质对培养物的毒害作用。 • 天刺黑莓茎尖培养，接种后1-2后转入新培养基，褐变现象基 本不发生。 • 正常培养几种生长的草莓试管苗幼叶，酶解仅能产生少量原生 质体，如果在分离前将试管苗转入降低了蔗糖浓度的培养基中 预培养2～3周，则原生质产量和活力均大大提高。
平板培养法：
将含有游离细胞和细胞团的悬浮培养物过滤，除去组织块和大的 细胞团，保留游离细胞和小细胞团。将液体培养基加入0.6%~1% 的琼脂，使其融化，冷却到35℃时，将培养基与上述细胞悬浮培 养液等量混合，迅速注入并使之铺展在培养皿（约1mm厚）。在 35 ℃温度下，培养基能保持液体状态，也不会杀死细胞。用封 口膜封严培养皿，置于25°C黑暗中培养。该方法培养细胞可以 定期镜检观察细胞的生长。
第8章 植物细胞悬浮培养与次生代谢物质生产
气动式反应器
外循环气升式
机械搅拌式
内循环气升式
外循环气升式
例：分批培养
I 建立愈伤组织：获得均一、松 散的愈伤组织
II 建立悬浮系：培养方法 增殖规律
III 悬浮系增殖：细胞批量增殖 获得次生产物
细胞生长曲线
培 养 细 胞 数 目
5 4 3
1
2
培养时间
1 2 3 4 5
滞后期 对数生长期 直线生长期 缓慢期 静止期
3 高产细胞系的筛选
3.1 整体思路 外植体
愈伤组织外植体的筛选
悬浮培养细胞
高产细胞系筛选
3.2 高产系的稳定性及保存方法 尽量减少继代次数，用矿物油包埋法，低温保 存法（-20℃），超低温保存法（-196 ℃）保 存。
同时从高产系中不断克隆形成新的高产细胞 系。
4 植物细胞悬浮培养的方法
悬浮培养：将游离的细胞或者细胞团按一定密度，悬浮在液 体培养基中，不断搅拌或者振荡培养，使细胞快速、大量 增殖。 技术难点： 通气、剪切力的适应性；细胞同步化控制。 ①培养：培养基：基本培养基+CTK/AUX 培养条件：温度、氧气、PH、转速 ②同步化控制 ③细胞增殖的监测，适时测定细胞的数量，掌握放罐时机。
红苋菜
含有甜菜红素的愈伤
甜菜素基本合成途径
目的基因
--- Strack et al. 2003, Plant Cell Physiol, 46: 666-670.
药效问题
– 紫杉醇水溶性很差 0.77mM/L – 使用增溶剂： 聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇
存在问题 稳定性和水溶性较差（7mm/L） 过敏反应 产生沉淀
次生代谢产物的应用：色素、香料、药物、添加剂、 工业原料等。
植物细胞培养与次生产物生产
第三节 植物细胞规模化培养
概述
规模化培养体系建立
生物反应器
规模化培养的技术问题
一、 概 述
在植物生物技术中，应用培养细胞系统合成有用的 天然产物，很可能发展成为一个广义的化学工业的 一个组成部分。长期以来，植物一直是许多化学品 的主要资源，特别在制药和食品加工业中更是不可 缺少。据不完全统计，至少有20％左右的药物是由 植物衍生而来的，而且每年都可发现许多植物来源 的新化合物。
大规模培养体系建立
种子细胞选择
外植体选择
高产细胞选择
植物类型：植物细胞的遗传基础是天然产物生产的基本 影响因素，不同植物产生的天然产物种类之所以不同， 从根本上来说是因为它们具有不同的遗传基础。在确定 生产某一种化合物以后，首先必须准确选择那些能够产 生目的化合物的植物种类及其品种或单株。
组织器官：由于天然产物一般为次生代谢产物，而植物 次生代谢产物的积累具有组织器官特异性，因此，在起 始细胞培养时应尽量选择自然状态下产生天然产物的器 官、组织为外植体。
悬浮培养与固体培养比较有三个优点：
一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养 供应；
二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物 质在局部积累而对细胞自身产生毒害；
三是振荡培养可以适当改善气体的交换。
愈伤组织诱导
悬浮系的建立与继代培养
悬浮细胞的生长动态 悬浮细胞同步化
一. 愈伤组织诱导
愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其 外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状， 疏松易碎。
单细胞的分离：通过过滤出去大的细胞团，小细胞团一般采用酶分离法，小细胞团不能 超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。
单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为
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16
六、植物细胞大规模培养与次生代谢 产物生产
（一）、概述 植物次生代谢产物是指植物中一大类并 非植物生长发育所必需的小分子有机化合物， 其产生和分布通常有种属、器官组织和生长 发育期的特异性。次生产物在植物中的合成 与分解过程称为次生代谢。 1． 植物产生代谢产物的类型 植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过2 万种），如酚类化合物、醌 类、生物碱、胺 类、有机酸等
3
细胞生长曲线
在整个培养过程中，细胞数目 不断发生变化，呈现出明显的由慢 到快，再到慢，最后增长停止的细 胞周期。细胞的生长呈S型曲线
4
培 养 细 胞 数 目
S形曲线
5
4
3 1
2
培养时间
5
细胞生长各个时期的特点：
细胞很少分裂，其长短与接种量大 滞后期（延迟期） 小和继代时原种细胞所处的生长期有关 对数生长期 细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长 速率保持不变 直线生长期 细胞生长和发育最明显的时期 缓慢期 静止期 生长逐渐缓慢：培养液消耗将尽， 有毒代谢物质增多，氧气减少 生长几乎处于停止状态，细胞数目增加 极少，甚至开始死亡。
11
2-2 特点 可以定点观察； 分离单细胞系比液体浅层培养容易； 培养细胞气体交换不畅。
12
3、看护培养法
3-1
看护培养的含义及用途
含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单
个细胞，并使其生长和增殖的方法。
用途；诱导形成单细胞系。
Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细胞株。 Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花粉培养， 诱导花粉形成单倍体细胞系。
13
3-4 特点： （1）效果好，易于成功。 （2）简便易行。 （3）不能在显微镜下直接观察细胞的生 长过程。
14
4、微室培养法
4-1 微室培养的含义及用途
含义：即将细胞培养在很少量的培养基
中。
用途：主要用来观察细胞生长、分裂、
形成细胞团的过程。
15
4-2 微室培养特点： 在培养过程中可以连续进行显微观察， 将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团 的全部过程记录下来。
思考题 1.细胞生长的各个时期及特点 2.单细胞培养的方法及特点 3.植物次生代谢产物的用途
第八章 植物细胞培养与 次生代谢产物生产
1
一、单细胞的分离
由完整的植物器官分离单细胞 由培养组织中分离单细胞
2
二、悬浮培养
特点 1. 细胞可以不断增殖，形成高密度的细 胞群体，适于大规模培养； 2. 能够提供大量较为均匀的细胞，为研 究细胞的生长、分化创造方法和条件。 悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
2．植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具 有重要意义。 李时珍（1593）在《本草纲目》中所开列的1892种 药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来 自植物。其药物的有效成分均为次生产物。 许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品 原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌， 而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。 3．规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径 ·保护生态环境 · 提高生产效率 · 发展新型生物技术产业
6
培 养 细 胞 数 目
4 3 1 2
5
1 滞后期
培养时间
2 3 4 5
对数生长期 直线生长期 缓慢期 静止期
7
三、单细胞培养
液体浅层培养法 固体平板培养法
看护培养法
微室培养法
8
1、液体浅层培养法
将悬浮在培养液中的细胞过滤，得到游离单细Βιβλιοθήκη 胞和小细胞团 培养在浅层液体培养基中
用途：主要用来增殖细胞。
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特点：
有利于有毒物质的扩散； 有利于气体交换； 不利于定点观察； 单细胞生长、分裂后，难以得到单细 胞系。
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2、固体平板培养法
2-1 含义及用途： 含义： 是将单个细胞与融化的琼脂培养 基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上 的培养方法。该方法是Bergmann(1960 年)首创。 用途：是为了分离单细胞无性系，研究 其生理、生化遗传上的差异而设计的一 种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、 原生质体及融合产物的培养。