分子克隆分接转筛(讲课复习)
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介1.分子克隆技术的定义2.分子克隆技术的发展历程二、分子克隆技术的原理1.基本原理2.克隆过程详解三、分子克隆技术的应用1.基因工程2.生物制药3.基因诊断4.转基因技术四、分子克隆技术的操作步骤1.设计引物2.PCR扩增3.酶切鉴定4.连接转化5.筛选重组子6.鉴定克隆子五、分子克隆技术的注意事项1.实验操作规范2.试剂选择与储存3.防止污染4.优化实验条件六、分子克隆技术的发展趋势1.高效自动化设备2.单细胞克隆技术3.基因编辑技术4.个性化医疗正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，主要用于复制特定DNA序列。
该技术在我国科研领域得到了广泛的应用，为基因研究、生物制药、转基因技术等领域提供了重要的技术支持。
自20世纪70年代以来，分子克隆技术不断发展，为生命科学研究带来了革命性的变革。
二、分子克隆技术的原理分子克隆技术的基本原理是将目标DNA片段通过PCR扩增，然后利用限制性内切酶切割得到特定片段，将这些片段连接到载体DNA上，最后将连接产物转化到受体细胞中。
在转化过程中，载体DNA与受体细胞的染色体DNA 结合，实现目标基因的复制和表达。
克隆过程详解：首先，设计一对特异性引物，使目标DNA片段在PCR扩增过程中产生特定的扩增子。
接下来，通过PCR扩增得到目的基因。
然后，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到具有粘性末端的目的基因片段。
将目的基因片段与载体DNA连接，形成重组载体。
最后，将重组载体转化到受体细胞中，实现基因的克隆。
三、分子克隆技术的应用1.基因工程：分子克隆技术为基因工程提供了重要的技术支持，使得科学家可以对基因进行改造、编辑，进而创造新的生物品种和药物。
2.生物制药：分子克隆技术在生物制药领域具有广泛应用，如制备抗体、细胞因子、酶等生物制品。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以快速、准确地检测特定基因序列，为遗传病诊断提供依据。
分子克隆及DNA重组分子的转化和筛选
分子克隆及DNA重组分子的转化和筛选摘要：利用限制性内切酶切割DNA及利用DNA连接酶构建重组体DNA。
通过酶切图谱比较判别重组体DNA和载体DNA。
利用氯化钙法制备大肠杆菌受态细胞和外源重组体DNA 转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体细胞技术，从而达到DNA分子重组以及重组分子的转化和筛选效果。
关键词：DNA、RNA、重组体、酶切、转化、筛选分子克隆是指分离一个已知DNA序列，并以in vivo（活体内）方式获得许多复制品的过程。
这一复制过程经常被用于增加并获取DNA片段中的基因，但也可用来增加某些任意的DNA序列，如启动子、非编码序列、化学合成的寡核苷酸或是随机的DNA片断。
体外连接的重组DNA分子导入合适的受体细胞才能进行大量复制，增殖和表达，其首要目的是获得大量的克隆基因。
虽然PCR技术，体外转录及翻译系统能部分达到大量扩增的目的，但毕竟受到体外操作的许多限制。
重组质粒导入宿主细胞最常用的方法之一就是转化（transformation）。
转化这一概念来源于遗传学：细菌细胞的生物学由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。
很多细菌如杆菌，链霉菌属能自然发生转化，其它菌属包括大肠杆菌自然状态下无法发生转化，但可以通过人工诱导使其处在易于接受外源DNA分子的状态即感受态（competence），从而使转化得以高效率地进行。
大肠杆菌的转化简便易行，它在分子克隆中占据极为重要的地位。
重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内，这项技术始于Mandel 和Higa 1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2 溶液处理短暂热休克后，容易被噬菌体感染，随后Cohn 于1972年进一步证明质粒DNA用同样的方法也能进入细菌。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘付于细胞表面，经42℃短时间的热激处理，促进细胞吸收复合物。
植物生物技术研931-分子克隆PPT课件
质粒小、转化率高 质粒大、拷贝数低 ﹥15kb 转化率成为限制因素
分子大小4363bp，容易纯化;
含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记;
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在 蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以 产生大量的重组pBR322分子。
component in such a way as to preserve the reading frame and functional expression. However,
cloning of an insert into the multiple cloning site (MCS) will cause insertional inactivation, and
.
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Some of the λ gene products lyse the host cell, allowing the virions to escape and infect new cells.
Figure 4.13. In vitro DNA packaging in a phage λ protein coat can be performed using a mixed lysate of
pGEM-3Z 和 pGEM4Z 的差别在于二者 互换了两个启动子 的位置。
作用：体外转录
.
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质粒的制备
实验室常采用碱法制备质粒
碱裂解法 将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌细胞壁
加NaOH与SDS的混合溶液，去膜、释放内含物
加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分 蛋白质
分子克隆技术讲解课件
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
分子克隆课件
分子克隆目录（一）.基本概念 (2)1.分子克隆： (2)2. Dalton，bp，nt (2)3.保护碱基 (2)4.T-A克隆： (2)5.RNA酶H活性： (2)6.载体： (2)7.质粒(plasmid) (2)8. F因子 (3)9. 位点偏爱（Site preference） (3)10.星星活性： (3)（二）分子克隆的基本过程 (3)1.概述 (3)2.分子克隆中常用工具酶 (3)3.基因克隆常用载体 (7)4.目的基因的分离与制备 (11)5.目的基因的体外重组 (11)6.重组子导入宿主细胞 (12)7.阳性重组子的筛选和鉴定 (13)（三）.单链丝状噬菌体 (14)1.M13 噬菌体的生物学 (14)2. M13 噬菌体载体 (17)3. M13 噬菌体载体的宿主菌 (18)4.丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题 (17)5. 噬菌粒 (11)6. M13KO7 辅助噬菌体 (12)（一）.基本概念1.分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。
2. Dalton，bp，nt道尔顿（Dalton，Dal，Da，D）：分子量的单位，蛋白质是大分子，所以常用kDa（千道尔顿）来表示。
碱基对（bp）＝base pair，1 kb就是1000个碱基对；nt＝核苷酸nucleotide 。
3.保护碱基在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
4.T-A克隆：利用Taq酶在PCR产物3‘末端有加上一个A的特性，使得Taq酶的PCR 产物或经过Taq酶加A的PCR产物，和一个人工加上一个3’末端具有1个T的载体进行连接，由于突出末端可以互补，这样可以大大提高目的基因和载体的连接效率。
基因工程：第二章 分子克隆(总)(1)
抑制蛋白质 Cop
起始因子 Rep
Pcop
cop
P/Orep
rep
ori
根据质粒复制调控的严密程度，质粒可分为两大复制类型：
严紧型复制控制的质粒： 1 - 3 拷贝，如pSC101 松弛型复制控制的质粒： 10 - 60 拷贝，如 ColE1 氯霉素扩增：在宿主菌生长的中后期，通过添加氯霉素 抑制蛋白质合成、关闭主要代谢途径，以使松弛型质粒 迅速大量扩增（可达上千拷贝）的操作。
3、载体类型
2）按传代特性分：
自主复制型载体 含复制子，可独立于宿主染色体外复制与传代。 穿梭载体 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆 整合型载体 不含复制子，需借助同源重组机制整合于宿主 基因组。
3、载体类型 3）按来源分：
质粒（Plasmid) 噬菌体（bacteriophage)/病毒(virus) 考斯质粒（cosmid） 噬菌粒（phagemid） 人工染色体（YAC，BAC）
3、载体类型 1）按功能分：
克隆载体（cloning vector）
主要用于在大肠杆菌细胞中克隆目的基因 vector)
除含基因克隆所需元件外，还有供外源基因表达用的启 动子、终止子等顺式元件，用于在特定的宿主中表达目 的基因。
2、质粒的不相容性
质粒的不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒 ，不能同时存在于一个细胞中的现象。不相容性的质粒组成 不相容性群 以大肠杆菌的质粒为例：
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
即cccDNA（covalently closed circular DNA) *质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb
分子克隆技术课程教学大纲
分子克隆技术课程教学大纲课程名称：分子克隆技术（Molecular Cloning Technology）课程编号：1313080216课程类别：专业课总学时数：30 课内实验时数：30学分：1开课单位：生命科学学院生物技术教研室适用专业：生物技术适用对象：本科（四年）一、课程的性质、类型、目的和任务分子克隆技术是生物技术专业的专业必修课，是在分子生物学和基因操作原理等理论课的基础上开设的一门以实验为主的课程，它的任务是全面训练学生掌握分子克隆的常用技术。
本课程要求学生在掌握相关原理的基础上，通过利用质粒载体克隆拟南芥DNA片段、转化及PCR鉴定等综合性实验，学习、训练分子克隆技术的基本操作方法及操作技巧，掌握DNA重组及重组子的筛选和鉴定技术、RNA的操作、Southern杂交技术等，培养学生设计实验、观察实验现象、分析问题和解决问题的能力。
二、本课程与其它课程的联系与分工生物化学、分子生物学、基因工程原理是其先修课程。
三、课程内容及教学基本要求[1]表示“了解”；[2]表示“理解”或“熟悉”；[3]表示“掌握”实验一PCR产物的T载体克隆一、PCR引物设计二、基因克隆三、PCR产物回收四、PCR产物与载体连接五、蓝白斑筛选PCR引物设计原则[3]；T载体的特点[3]；T载体克隆PCR产物的方法[3]；PCR产物的回收[2]；蓝白斑筛选原理[3]实验二植物目的基因的转化一、农杆菌单菌落的分离与保存二、农杆菌的活化三、Forial Dipl法转化拟南芥农杆菌单菌落的分离与保存[3]；根瘤农杆菌的生物学特性[2]；Forial Dipl法转化拟南芥原理与方法[3]实验三转基因植物的检测技术一、植物基因组DNA提取二、转基因植物在含抗生素筛选培养基中的筛选三、转基因植物的PCR检测植物基因组DNA提取原理与方法[3]；引物的设计与合成[2]；反应体系[3]；循环参数[3]；扩增产物的检测[3]四、实验方式与要求1．实验前学生必须进行预习后，方可进入实验室进行实验。
三四章分子克隆载体---题目_完_
第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors）一、名词解析二、填空题1.基因工程中有三种主要类型的载体、和。
2.就克隆一个基因来说，最简单的质粒载体也必须包括三个部分和、。
另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子质量。
3.如果两个质粒不能稳定的存在已同一个宿主细胞中，则属于群，这是因为他们的所致。
4.pBR 322是一种改造型质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来源于，它的氨苄青霉素抗性基因来源于。
5.Puc18质粒是目前使用较为广泛的载体。
pUC系列的载体是通过和两种质粒改造而来。
它的复制子来源于，Amp抗性基因则是来源于。
6.当λ噬菌体DNA进入宿主细胞以后是靠宿主细胞的和形成封闭的环状的DNA分子的。
7.λ噬菌体是感染大肠杆菌的噬菌体。
8.α-互补是指 lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的阴性的突变体之间实现互补。
9.溶源化的频率和与有关。
10.噬菌体DNA通过其上唯一的整合位点与宿主染色体DNA上的唯一整合位点发生重组，从而整合到染色体中。
11.通过分析大量缺陷型λ噬菌体的 DNA ，发现 J 基因与 Cro 基因之间的 DNA 被或替换后，不影响λ噬菌体裂解生长。
12.对野生型大肠杆菌来说，向溶源和裂解方向的转变是由和决定的。
13.代表性λ噬菌体载体有和14.粘粒的组成包括________，________，________。
15.柯斯质粒(Cosmid)载体：一种由________和_______cos尾巴构建的复合载体。
16.pcos1 EMBL 是设计用于筛选体内重组的重组粘粒文库，通过同源重组过程达到筛选目标克隆的目的。
该载体的复制起点来源于__________质粒，含_________和_________抗性基因。
17.酵母人工染色体由酵母染色体的__________、__________和__________等功能性DNA序列组成。
《分子克隆》PPT课件
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第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅰ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 但切割位置远离识别位置 ➢ 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割
DNA分子 ➢ 在基因工程中没有什么用途
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第二节 分子克隆常用的工具酶
Ⅲ型限制酶
➢ 有特定的识别序列 ➢ 切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型
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第三节 分子克隆常用的载体
载体应具备的条件
能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换
片段的两侧各有一个内切酶位点） 克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子 载体上要有报告基因或选择标记基因 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点 具有较高的外源DNA装载能力。
质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格 改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到处都是。
分子生物学分子克隆技术详解演示文稿
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分子克隆技术
又称为重组DNA技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外 进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意 愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
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➢ 重组DNA操作一般步骤：
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灭 菌 器
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加IPTG和X-GAL
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倒平板
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α
互 补
利用α互补原理筛选重组体pUC18 63 第63页，共80页。
筛选结果
蓝菌落代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的α LacZ序列编码的功能性 的 α 片段。
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用氯化钙化学转化
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用氯化钙化学转化
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电激转化
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一个电激转化程序
加 50-200ng DNA 到 40ul 电激感受态细菌中 将混合物放入一个预冷的电激杯中 施以脉冲电处理，脉冲长度预期值为 8 to 12ms 立即加1ml LB 培养液，在室温下振荡 2-4 小时。
（1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA
分子； （3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受
体细胞中复制和遗传；
（4）对转化子筛选和鉴定；
（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养 ，获得所需的遗传性状或表达出所需要的 产物。
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分子克隆的主要步骤
分子克隆的主要步骤嘿，咱今儿个就来唠唠分子克隆的那些主要步骤呀！你想想，分子克隆就像是搭积木，得一步步来，还得搭得稳稳当当的。
第一步呢，就是要选好咱要克隆的那个“宝贝”基因。
这就好比是挑一件合心意的衣服，得看准了，可不能瞎选哟！然后呢，得把这个基因从原来的基因组里给“揪”出来，这可不是个容易事儿，得小心翼翼的，就像从一大团线里找出那根关键的线头。
接下来，得给这个基因找个“家”呀，这就是载体啦。
载体就像是个小车子，能带着基因到处跑呢。
把基因和载体连接起来，这可得有点技术含量，得严丝合缝的，不能有一点马虎。
弄好了这些，就该把它们送进细胞里啦。
细胞就像是个大工厂，基因在里面就能开始工作啦。
这一步就好像是把种子撒进地里，等着它生根发芽。
之后呢，就得等着细胞们繁殖啦，让带有基因的细胞越来越多。
这就像看着自己养的花儿一点点长大、开花。
然后呀，还得筛选出那些成功克隆了基因的细胞，这可不容易呢，就像在一群孩子里找出那个最聪明的。
再往后，就是培养这些细胞，让它们茁壮成长啦。
这就像是照顾小宠物，得细心呵护着。
最后呢，就是收获啦，得到我们想要的克隆产物。
哇，这一路走来，可不简单呢！分子克隆啊，就像是一场奇妙的冒险，每一步都充满了挑战和惊喜。
要是哪一步出了差错，可能就前功尽弃啦。
所以啊，做这个可得打起十二分的精神呢！你说，这分子克隆是不是很神奇呀？它能让我们实现好多以前想都不敢想的事情呢！它就像是一把神奇的钥匙，能打开好多未知的大门。
咱可得好好研究研究它，让它为我们的生活带来更多的好处呀！你说是不是这个理儿？。
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重组DNA的筛选与鉴定方法 平板筛选（插入失活、蓝白筛选）
1 2
3 PCR筛选重组体 4 原位杂交技术
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2.分子克隆中常用工具酶：
（1）. 使核酸降解的核酸酶类： 核酸内切酶、核酸外切酶。
（2）.催化核酸合成的酶类： DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶。
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3.基因克隆常用载体
目前用于基因克隆的载体种类繁多， 包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌 体载体、酵母菌质粒载体以及动、植 物病毒载体等
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质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
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ＲＴ－ＰＣＲ
反转录 逆转录酶 AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶
cDNA
PCR扩增
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➢转化：以质粒作载体构建的重组体 导入受体细胞的过程
类 ➢转染：以病毒作载体构建的重组体 型 导入受体细胞的过程
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
thermus aquaticus
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此酶具有以下特点： ①耐高温， ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加 新酶。 ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增 长度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。 在 1989 年，Science 将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子 (Molecule of the year)
④底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、 dGTP) ⑤ Mg2+： DNA聚合酶的激活剂
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⑸ 2535个循
环
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性）
⑵94℃
30’’
变性
⑶50-60℃ 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火）
⑷72℃
n’(按1’扩增1kb计算）延伸
⑹72℃
3-7’
总的延伸（使产物延伸完整）
⑺4-10℃ 保存
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3.与反转录相关的PCR扩增
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR， 可对基因的表达和序列多态性分析。
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2.PCR反应过程：
1个PCR
20-40个 PCR循循环环
①94℃变性 ② 50-65℃退火 ③72℃延伸
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引物
5’
3’
3’
5’
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
PCR扩增原理 上课复习
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①模板：单链或双链DNA
②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 3.PCR基本要素 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶
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氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß—内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
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DNA限制性内切酶
DNA连接酶 100μl
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4.目的基因的分离与制备
⑴、人工合成基因 ⑵、应用聚合酶链反应获取目的基因
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是由细菌自己产生的一种能识别双链 DNA中的特定序列，并以内切方式水解
核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌 体内，这种内切酶可以分解外源性的 DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的 DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基 化所保护。
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TaqDNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)中， 能以DNA为模板，从结合在模板上的引物 出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式， 从5’-3’方向合成新的DNA链。TaqDNA 聚合酶在70～75℃时具有最佳的生物活
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5.目的基因的体外重组
DNA分子的体外重组:是DNA分 子之间的连接过程。这是一个DNA 连接酶催化的生物化学反应 。
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6.重组子导入宿主细胞
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2
分子克隆的路线
载体DNA （vector）
目的DNA DNA 重组 （target fragment）
重组DNA （recombinant DNA ）
转化
宿主（host）
筛选、扩增
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克隆（clone）
3
分—获取目的基因和载体 接—目的基因与载体的连接 转—重组DNA导入宿主细胞 筛—重组DNA的筛选与鉴定
分子克隆
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1
（一）基本概念:
• 克隆（Clone) 指的是通过无性繁殖过程所产生的 与亲代完全相同的子代群体。
• 分子克隆（Molecular Cloning) 是在体外对DNA分 子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分 子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和 繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获 得新得遗传特征的过程。
性，随着温度的降低，酶活性明显下降。 同时此酶缺乏3’-5’外切酶活性，因而无 校正功能。
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催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸 和3’羟基间磷酸二酯键形成的酶， 称为DNA连接酶(DNA ligase)。 DNA连接酶主要有两种：
T4噬菌体DNA连接酶
大肠杆菌DNA连接酶
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4
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
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5
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…