分子克隆实验指南(原书第四版)(精装上下册)思维导图
5第五讲分子克隆载体
黏粒载体(cosmid vector)
基本特征： 1 是质粒的衍生物，是带有cos位点的质粒。 2 其组成有质粒的复制起点(ColE1)、抗性基
因、cos位点、MCS。 3 大小为5～7kb 4 能克隆的外源DNA片段最大达40kb。
黏粒载体的特点：
（1）具有λ 噬菌体的特性（但因不含λ 噬菌 体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周 期，无法形成子代噬菌体颗粒）；
质粒的存在形式：
一般以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA) 的形式存在。
也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分 子(L-DNA)的形式存在。
质粒DNA的大小
质粒
宿主
pPbs
蓝藻
CoLE1
大肠杆菌
PV21
三叶草根瘤菌
多数在10kb左右
大小（kb） 1.5 6.4 700
质粒的基本性质： 1 复制
利用染色体的复制功能来驱动外源DNA片段 复制的载体。
1 酵母人工染色体载体(YAC) 2 细菌人工染色体载体(BAC)
酵母人工染色体载体(YAC)
利用酿酒酵母染色体的复制元件构建的载体。 复制的必须元件：
作为克隆载体的DNA分子具备的条件：
1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源 基因进入宿主细胞；
2 能在宿主细胞中自主复制，一限制酶识别位点组成的多克隆 位点(MCS）；
4 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记 基因；
5 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体 细胞有害的基因，并且不会任意转入除受 体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人 的细胞。
MCS
lacZ`
Ampr Ori
含四个部分：
（1）来自pBR322的质粒 复制起点（ori）；
植物生物技术研931-分子克隆PPT课件
质粒小、转化率高 质粒大、拷贝数低 ﹥15kb 转化率成为限制因素
分子大小4363bp，容易纯化;
含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记;
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在 蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以 产生大量的重组pBR322分子。
component in such a way as to preserve the reading frame and functional expression. However,
cloning of an insert into the multiple cloning site (MCS) will cause insertional inactivation, and
.
28
Some of the λ gene products lyse the host cell, allowing the virions to escape and infect new cells.
Figure 4.13. In vitro DNA packaging in a phage λ protein coat can be performed using a mixed lysate of
pGEM-3Z 和 pGEM4Z 的差别在于二者 互换了两个启动子 的位置。
作用：体外转录
.
19
质粒的制备
实验室常采用碱法制备质粒
碱裂解法 将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中加溶菌酶裂解细菌细胞壁
加NaOH与SDS的混合溶液，去膜、释放内含物
加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分 蛋白质
分子克隆技术讲解课件
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
高中生物思维导图 细胞的物质输入和输出 Word版含解析
4.细胞的物质输入和输出4.1物质跨膜运输的实例一、渗透实验1．扩散现象：分子不停地做无规则的运动——布朗运动2．渗透现象（1）漏斗实验（2）条件①半透膜：小分子可以通过，大分子不能通过的多孔性薄膜；无活性，即无选择透过性，所有小分子可过1）如玻璃纸（赛璐玢），膀胱膜、肠衣、羊皮纹、胶棉薄膜、鸡蛋的卵壳膜等2）物质能否通过取决于物质分子的直径与半透膜空隙的大小：知识联想：滤膜法微生物计数3）半透膜的面积越大，渗透越快4）实验验证：换成纱布后，漏斗内液面不上升②半透膜两侧的溶液存在浓度差1）差值越大，吸/失水多且快2）浓度指物质的量浓度（c=n/V=m/MV），即渗透压3）备注a．如质量分数为10%的葡萄糖、蔗糖溶液b．质量分数为10%的葡萄糖（相对分子质量M小）溶液的渗透压大c．∴水可通过半透膜由蔗糖溶液向葡萄糖溶液移动4）实验验证：a．漏斗内为蔗糖、烧杯内为清水：漏斗液面上升b．漏斗、烧杯为相同浓度的蔗糖：漏斗液面不变c．漏斗内为清水、烧杯内为蔗糖：漏斗液面下降d．漏斗内为蔗糖、烧杯内为清水，平衡后再加入蔗糖酶：漏斗液面先上升；加入酶、以及酶水解蔗糖为葡萄糖后，漏斗内浓度变大，继续上升一段；当葡萄糖透过膜，漏斗内浓度变小，液面下降；最后漏斗内保留酶，保持一定的高度（3）渗透作用①水分子(或其它溶剂分子)透过半透膜②从低浓度（物质的量浓度）溶液向高浓度溶液；从相对含量多的地方向相对含量少的地方③扩散的现象（4）结果①微观：水分子通过半透膜，双向扩散②宏观：水从低浓度向高浓度流动，至动态平衡③平衡后：半透膜两侧存在液面差；两侧溶液浓度不相等，漏斗里的浓度更大；液面差的高低取决于半透膜两侧溶液起始浓度差的大小3．异同（1）运动对象不同：扩散是溶质/物质运动；渗透是水/溶剂运动（2）运动方向不同：扩散是高浓度到低浓度；渗透是低到高（从相对含量高到低）（3）是否需要介质：扩散不需要膜；渗透需要半透膜（4）扩散是溶质从高浓度到低浓度运动，至动态平衡（5）渗透是特殊扩散：是溶剂从相对含量高到低的运动，即顺相对含量的梯度跨膜运输；至动态平衡4．应用：反渗透膜，制纯水，海水淡化二、探究实验1．步骤：提出问题→作出假设→设计实验→结果预测→进行实验→记录结果→分析结果→得出结论→表达和交流→进一步探究2．变量（1）定义：也称因子，指实验过程中所被操作的特定因素或条件（2）分类：①自变量：也称实验变量，指实验中由实验者所操纵的因素或条件②因变量：也称反应变量，指实验中由于实验变量而引起的变化和结果③无关变量：也称控制变量，指实验中除实验变量以外的影响实验现象或结果的因素或条件；描述语：等量且适量的X溶液，生长状况相似的生物，适宜的环境中（包括温度、光照、pH、营养物质等），处理相同时间④额外变量：也称干扰变量，指实验中由于无关变量所引起的变化和结果（3）实验关键：控制、减少无关变量，以减少误差；单一变量原则，是处理实验中的复杂关系的准则之一三、细胞的吸水和失水1．动物细胞（1）取材：哺乳动物成熟红细胞，结构特殊易对比（2）方法：引流法（吸水纸）；高倍镜观察（3）半透膜：细胞膜（4）浓度差：细胞质和外界溶液具有浓度差，差值越大：渗透速度越快；渗透程度越大①外界溶液浓度>细胞质浓度：失水皱缩；细胞质量减少，体积变小，浓度增加；失水结束后，无浓度差②外界溶液浓度<细胞质浓度：吸水膨胀至胀破；细胞质量增加，体积变大，浓度减少；吸水结束后，无浓度差③外界溶液浓度=细胞质浓度：动态平衡；正常状态2．植物细胞：质壁分离实验（1）取材：①要求：1）植物（有细胞壁，若用细菌，质壁分离不明显；动物无细胞壁，不能发生）2）成熟（有中央大液泡，原生质层有叶绿体∴不用染色）3）活细胞（活的才会质壁分离）②紫色洋葱鳞片叶外表皮细胞：液泡紫色，原生质层绿色；若用内表皮或液泡不含色素的细胞，可在蔗糖溶液中加入红墨水，观察原生质层与细胞壁之间是否进入有色的蔗糖溶液（2）方法：引流法（吸水纸）；在低倍镜观察下进行操作（3）试剂：质量浓度为0.3g/mL的蔗糖溶液，清水（4）半透膜：原生质层，细胞膜、液泡膜，及两层膜之间的细胞质；不包括细胞核、液泡内的细胞液、细胞壁；仅存在于成熟的植物细胞中；原生质层的伸缩性大于细胞壁的伸缩性，且有选择透过性；放在不同浓度的溶液中，植物细胞的质壁分离，证明原生质层有伸缩性，且大于细胞壁；植物个体或器官的变大/变小，证明细胞壁有伸缩性。
高清版新课标高中生物思维导图
过程
光反应 暗反应
场所，条件 物质变化 能量变化
实质、意义
影响光合作用 的因素及应用
内部因素 外界因素
叶面积指数 叶龄 光照强度 温度 二氧化碳浓度 必需矿质元素
水
ATP的主要来源
概念
有氧呼吸
方式
比较
无氧呼吸
实质
意义
影响呼吸作用 的因素及应用
内部因素 环境因素
遗传因素 温度 氧气浓度 CO2浓度
含水量
DNA
分类 RNA
功能
糖类
元素 种类及作用
脂质
元素 种类及作用
有氧呼吸主要场所 光合作用的场所
线粒体 叶绿体
双层膜 细胞器
对来自内质网的蛋白质 进行加工、分类和包装
高尔基体
增大膜面积，与蛋白质、脂质 和糖类的合成有关，蛋白质 的运输通道
维持渗透压，使细胞膨胀
内质网 液泡
单层膜 细胞器
含有多种水解酶，可 分解细胞器和病毒
染色质
结构 功能
遗传物质的载体
是遗传信息库，是细胞代谢和遗传的控制中心
细胞膜 细胞壁
细胞的基 本结构
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细胞骨架
组成 蛋白质纤维组成的网状结构
作用
在真核中维持细胞形态； 保持细胞内部结构的有序性
细胞质基质
成分
水、无机盐、脂质、糖类、 氨基酸、核苷酸和多种酶
状态 呈不断流动的胶质状
作用 活细胞代谢的主要场所
保护、物质交换、能量转换、 信息传递等；提供酶的附着位点； 使细胞内区域化
功能
生物膜系统
研究意义 实验：体验制备细胞膜的方法
纤维素和果胶 成分
保护和支持作用 功能
分子克隆实验指南
做了快一年的分子克隆，犯了很多错误，经历了很多坎坷，也学到了很多东西。
分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤上很久。
经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，在这里跟大家分享一下我的经验，以供和我一样陷入困境及刚开始做克隆的同学参考。
关于连接的提问多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。
但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。
有很多环节影响连接的成败，如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。
以下我详细说明。
1，PCR引物的设计。
通俗的不说，需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。
做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种：dam甲基化和dcm甲基化。
常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。
dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲基化酶识别CCWGG 位点（W是A或T）并甲基化。
如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。
容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（A TC/GAT）如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多。
这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意，避免引入甲基化位点。
如果真是避免不了或者后来才发现问题，那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化，可以切了。
甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。
2，PCR产物。
两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下切连接。
我个人强烈建议第二种，连T载体。
因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp，带形没啥变化。
新人教版高中生物必修一-分子与细胞知识点思维导图
第二章：组成细胞的分子细胞中元素和化合物组成细胞的元素：C、H、O、N、P、S、K、Ca、Mg（大量元素）；Fe、M、Cu、Mo、Zn、B等（微量元素）；基本元素C；活（干）细胞中含量最多的四种元素依次为：O、C、H、N（C、O、N、H组成细胞的化合物：无机物一水（活细胞中含量最多）无机盐有机物一蛋白质（干细胞中含量最多）核酸、糖类和脂质检测蛋白质、还原性糖和脂肪：双缩脲试剂-蛋白质→紫色反应斐林试剂+还原性糖（葡萄糖、果糖和麦芽糖）→砖红色沉淀苏丹Ⅲ染液+脂肪→橘黄色苏丹Ⅳ染液+脂肪→红色生命活动的主要主要承担者-蛋白质含量：占细胞鲜重的7%~10%，干重的50%以上，是细胞含量最多的有机物。
组成元素：主要由C、H、O、N等元素组成，有些含有S、Fe等相对分子质量：几千~100万以上，属于大分子化合物基本单位：氨基酸，大约有20多种结构通式结构特点是至少含有一个氨基（NH2和一个羧基（COOH），并且都有一个有一个氨基（NH2和一个羧基（COOH）连接在同一个碳原子上，将氨基酸区别为不同的 种类的依据是R基（侧链基团）。
形成过程（1）脱水缩合过程图解（2）肽链两（三）个氨基酸缩合的化合物叫二（三）肽，含有一（二）个肽键，脱掉一（二）个水分子，多个氨基酸缩合而的含多个肽键的化合物叫做多肽，若n个氨基酸形成一 条肽链，则可形成n-1个肽键，失去n-1个水分子；若n个氨基酸形成m条肽链，则形 成n-m个肽键，失去n-m个水分子，则由这m条肽链组成的蛋白质的分子量为：nxa （n-m）×18（a为氨基酸的平均分子量、18为水分子量）（3）空间结构一条或几条肽链通过一定的化学键互相链接在一起，形成具有复杂空间结构的蛋白质。
高温、强酸强碱和重金属都会破坏蛋白质的空间结构。
结构的多样性：组成蛋白质的氨基酸数目不同、氨基酸的种类不同、氨基酸排列顺序不同、多肽链的盘曲、折叠方式及其形成的空间结构千变万化功能的多样性：构成细胞和生物体的重要物质；酶有催化作用，绝大多数的酶都是蛋白质；有传递信息（或调节生命活动）的作用，如胰岛素、生长激素等；有运输载体的作用，如血红蛋白、细胞膜载体等；有免 疫作用，如抗体。
衡水中学2020高考思维导图(公益赠送5000套)
肌肉组织 主要由肌细胞构成，能够收缩，产生运动，如心肌
神经组织 主要由神经元构成，能够感受刺激，产生和传导兴奋
(
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分子生物学(朱玉贤第四版)复习提纲思维导图 2.染色质与DNA
H1 蛋白质 组蛋白 H2A H2B H3 H4 基因组 概念： C值 C值矛盾 不重复序列 结构基因 rRNA DNA片段重复 染色质（间期）染色体（分裂期） 高度重复序列 结构简练 DNA 原核 转录单元 中度重复序列 tRNA 组蛋白基因 卫星DNA 各2个，八聚体组蛋白核心+H1+200bpDNA 核小体 螺线管 超螺旋 染色单体
一条DNA来自亲本，另一条链新合成 前导链
Ⅰ
DNA聚合酶 Ⅱ Ⅲ 多复制起点，ARS S期 真核生物复制特点
5'→3'聚合酶、3'→5'外切、5'→3'外切
5'→3'聚合酶、3'→5'外切 5'→3'聚合酶、3'→5'外切
复制叉移动速度50bp/s,慢 聚合酶15种以上，αβγδε
端粒酶、端粒
dNTP、Mg2+、模板链、引物、方向5'→3'
重叠基因
断裂基因 端粒 基因组特点：
DNA多态性
真核 多种顺式作用元件 单顺反子 基因组大 重复序列
少量RNA
一级结构
A,T,G,C排列顺序
3',5'-磷酸二酯键
右手螺旋 双螺旋 二级结构 DNA的结构 氢键 左手螺旋 断裂-DNA变性
A-DNA
B-DNA
Z-DNA 增色效应 减色效应 Tm
重新生成-DNA复性 正超 超螺旋 高级结构 拓扑异构酶 负超
复制子 复制叉 复制起点ori 原核：单起点双方向 复制方向 真核：多起点双方向 复制概念 复制速度 θ型 环形DNA 复制方式 D型 线性DNA 半保留复制 复制特点 半不连续复制 后随链 冈琦片段 ori DNA的复制 起始 解旋 引发 复制过程 延伸 原核生物复制特点 终止 Tus蛋白 5'→3' dNTP DNA聚合酶Ⅲ、滑动夹、RNA酶、DNA聚合酶Ⅰ、DNA连接酶 Ter 245bp A、T DNA解旋酶、拓扑异构酶、SSB 引发酶 RNA引物 端粒、端粒酶 滚环
蛋白质纯化技术Lite
第十三页，当前共13页八，共十81一页，星页期一。。
• 超速离心
➢离心（centrifugation）：利用机械的快速旋转所 产生的离心力，将不同密度的物质分离开来 的方法。
➢超速离心法 (ultracentrifugation)：~60万 g ， 6
蛋白质工程中进行蛋白质纯化的必要性
• 首先，需要单一的蛋白质作为实验材料，研究其结 构与功能；
• 其次，对蛋白质进行修饰改造时需要单一的蛋白 质作为原材料；
• 最后，为了生产性能更优良的蛋白质，需要对设 计改造过的蛋白质进行大量纯化，从而开发出相
关产品。
当前第3三页页，共，8共1页八，十星一期页一。。
4.1.2 离子交换层析（ Ion exchange ）
• 种类
▫ 阳离子交换柱：凝胶带负电荷，蛋白质带正电荷
▫ 阴离子交换柱：凝胶带正电荷，蛋白质带负电荷 • 介质
▫ 惰性支持物：琼脂糖，葡聚糖…
▫ 带电基团：羧甲基—带负电；二乙基氨基—带正电
▫ 平衡离子： 负电基团：H+或Na+
正电基团：OH-或Cl-
分子生物学圣经—分子克隆实验指南
当前第1一页页，共，8共1页八，十星一期页一。。
为什么要纯化蛋白质？
蛋白质是生命功能的执行者
• 理论意义：深入研究某种蛋白质的功能以及 作用机制，如信号通路中的蛋白质…
• 应用价值---蛋白质工程
医药、工业、科研… 作为药物靶点…
第二页，当共前2八页，十共81一页，页星期。一。
子并可逆结合，生物分子间的这种结合能力称为亲和
力。
• 方法
▫ 将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上， 利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行 分离纯化。