谷氨酸生产菌的选育汇总.

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谷氨酸发酵中菌种选育与改良课件

总结词
通过基因工程技术，对谷氨酸发酵菌种进行遗传改良，提高菌种的发酵性能和产量。
详细描述
基因工程技术通过基因克隆、基因突变、基因转化等技术手段，对谷氨酸发酵菌种的基因进行修饰和改造，以提高菌种的发酵性能和产量。例如，通过基因工程技术对谷氨酸棒状杆菌进行遗传改良，实现了谷氨酸的高产和高转化率。
案例二：代谢工程技术应用案例
能的突变菌种。
代谢工程技术在菌种改良中的应用
代谢流分析
通过代谢流分析技术，了解菌种在发酵过程中的代谢变化，为菌种改良提供理论依据。
酶活性调节
通过调节酶的活性，优化菌种的代谢途径，提高菌种的发酵效率。
细胞代谢工程
通过细胞代谢工程手段，对菌种细胞进行整体调控，实现菌种的高效表达。
诱变育种在菌种改良中的应用
初筛
根据菌种的形态、生长特性等初步筛选出具有潜在优良性状的菌株。
复筛
对初筛得到的菌株进行发酵性能测定，选择性能优良的菌株。
菌种性能评估
1 2
发酵产酸能力
评估菌种在发酵过程中的产酸能力，包括谷氨酸产酸量、发酵周期等。
耐温、耐盐性能
评估菌种在不同温度和盐浓度下的生长和代谢能力。
3
抗杂菌能力
总结词
通过物理、化学或生物诱变方法，对谷氨酸发酵菌种进行突变处理，筛选具有优良性能的突变株。
VS
详细描述
诱变育种通过物理、化学或生物诱变方法，如紫外线、化学诱变剂、转座子等，对谷氨酸发酵菌种进行处理，诱发基因突变，筛选具有优良性能的突变株。例如，通过化学诱变剂处理谷氨酸棒状杆菌，筛选出高产谷氨酸的突变株。
总结词
通过代谢工程技术，对谷氨酸发酵菌种的代谢途径进行调控，优化菌种的代谢效率和产物产量。

谷氨酸生产菌培养条件的优化

谷氨酸生产菌培养基条件的优化综述前言谷氨酸的发现为氨基酸的发展与应用奠定了基础。

以谷氨酸为基础生产的各种下游产品广泛的应用于食品、化工、医药等行业，其中味精是第一代食品调味品，其产量以及需求量正逐年递增。

由于微生物学及生物工程技术、基因工程技术的发展，使现如今谷氨酸发酵工业从粗放的、以传统经验为指导的生产正向着以了解发酵代谢机理为指导的新型工业生产发展，这为谷氨酸发酵工业带来了更大的发展空间。

谷氨酸生产工业与先进的生产技术相结合，对谷氨酸生产菌种的育种、代谢控制发酵和下游产品的开发具有一定的促进作用。

1.2 谷氨酸谷氨酸（Glutamic acid）作为一种酸性氨基酸，由里索逊于1856 年发现。

谷氨酸大量存在于谷类蛋白质及动物脑中，在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，并参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应，是构成蛋白质的20 种常见α-氨基酸之一，与我们的生活息息相关。

谷氨酸谷氨酸（Glutamic acid）作为一种酸性氨基酸，由里索逊于1856 年发现。

一、谷氨酸的应用1. 应用于食品行业谷氨酸是人类应用的第一个氨基酸，也是世界上应用广，产量及销量最大的一种氨基酸，主要用于食品行业中味精的生产。

L-谷氨酸是制造味精的前体，与适量碱反应可生成谷氨酸钠，即味精。

这是家喻户晓的一种风味增强剂，是重要的鲜味剂，不仅具有增强食品风味的功能，而且对动物性食品还具有保鲜作用，最重要的是这种风味添加剂食用安全，应用性较广。

在食品中浓度为0.2 % ~ 0.5 %，每人每天允许摄入量（ADl）为0 ~ 120 μg/ kg（以谷氨酸计）。

2. 应用于医药行业谷氨酸还可用于医药，虽然它并非人体必需氨基酸，但它可作为碳氮营养参与机体代谢，有较高的营养价值。

谷氨酸发酵诱变育种

材料及方法
培养基 1.斜面活化培养基：葡萄糖59／L，氯化钠 59／L，蛋白胨lOg／L，牛肉膏59／[．，琼腊189／L，pH 7。2． 2.牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏59／L，蛋白胨10 g／L，氯化钠5 g／L，pH 7．4． 3.种子培养基：柠檬酸10 g／L，谷氨酸10 g／L，氯化铵6 g／L，磷酸氢二钾1 g／L，MgS04·7Hz0 0．5 g／L， FeCl，·6H，0 0．02 g／L，CaCI z 0．2 g／L，MnSO一·也0 0．05 g／L
计算方法
活菌计数：采用稀释平板计数法活菌计数致死率=（1-诱变后活菌数/诱变前活致死率菌数）×100%
菌密度测定：吸取试样菌液，用蒸馏水稀菌密度测定释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照。
谷氨酸菌的诱变选育
众所周知，传统诱变育种包括诱变和筛选两部分，是获
得优良突变体的有效途径之一。诱变部分包括出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择以及合理的使用方法。筛选部分包括初筛和复筛，选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥此变株特性的最佳培养基及培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效的产物。
硫酸二乙酯诱变
吸取50％的硫酸二乙酯-乙醇溶液0.2mL，0.2mol/L pH 7.2的磷酸缓冲液5mL，菌悬液5mL于空消过的250mL的三角瓶中，于37℃分别震荡处理10、20、30、40、50min，处理完毕后加入1mL25％的硫代硫酸钠溶液终止反应，适当稀释后分别涂布平板分离培养基上37℃恒温培养24h, 并设立对照，最后进行活菌计数，计算致死率，绘制死亡曲线。从死亡曲线中找出致死率为85％～90％的诱变剂量，并以该剂量正式处理出发菌的菌悬液，然后涂布平板，挑取生长出来的单菌落进行初筛和复筛。

3谷氨酸产生菌的特征育种和扩大培养.

选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株；
选育强化能量代谢的突变株；选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株；
3.5 应用生物工程新技术选育谷氨酸产生菌
3.5.1 应用原生质体融合技术选育谷氨酸产生菌

原生质体(protoplast)是指动植物和微生物细胞去
除细胞壁以后的一种细胞结构，Brenner等1958年

(3) 耐高糖、高谷氨酸突变株选育在含20%葡萄糖和含15%味精平板上生长良好的突变株。
3.4.3 选育不分解利用谷氨酸的突变株
选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不能生长或生长微
弱的突变株。

平板法选育不能生长或生长微弱的菌株。摇瓶法选育OD值净增极小的菌株。
3.4.4 选育细胞膜渗透性好的突变株
乙醛酸
⑤
↓ 琥珀酸透过细胞膜 ←
柠檬酸 ↓ 顺乌头酸 ↓ 异柠檬酸
⑥
α-酮戊二酸
⑦
L-谷氨酸
↓ L-谷氨酸
NH4
+
②
③ 图3-3 由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径
3.4.2 选育耐高渗透压的菌株

(1) 耐高糖突变株
选育在含20~30%葡萄糖平板上生长良好的突变株。

Hale Waihona Puke (2) 耐高谷氨酸突变株选育在含15~20%味精平板上生长良好的突变株。

（3）选育抗核苷酸类抗生素突变株，如抗德夸菌素突变株。
谷氨酸产生菌的代谢控制育种小结：

选育耐高渗透压的菌株；

选育不分解利用谷氨酸的突变株；
选育细胞膜渗透性好的突变株；选育强化CO2固定反应的突变株；选育减弱乙醛酸循环的突变株；选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到α-酮戊二酸代谢的突变株；

第三章谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养

第七节、菌种保藏技术保藏原理：挑选优良品种，抑制微生物的代谢活性，创造休眠环境。保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便。
保藏后使用前需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)。
保藏方法
(1) 低温冷冻保藏； (2) 转接培养或斜面传代保藏； (3) 矿物油保藏； (4) 土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。
（2）传代保藏
斜面培养基，平行传代，普通冰箱，三个月以下保存，供试验用。
（3）矿物油保藏
将琼脂斜面培养物直立浸入矿物油中于4~6℃下保藏，简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别用于难以冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌。保存时间1~2年。
（4）载体保藏麦壳，砂土灭菌后可用作载体,培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液,注入灭菌的沙土管中混合均匀，或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中，使微生物细胞或孢子吸附在沙土载体上，将管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于4～6℃或室温进行保存的一种菌种保藏方法。多用于产抗生素菌种。 •保藏时间2~10年。
4.节杆菌属(Arthrobacterium)
二、现有谷氨酸生产菌的主要特征
细胞形态短杆形、棒形；革兰氏阳性菌，无鞭毛，无芽孢，不能运动；需氧型微生物；生物素缺陷型；脲酶强阳性；不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白、明胶等；
发酵中菌体发生明显形态变化，同时细胞膜渗透性改变；二氧化碳固定反应酶系强；异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循环弱； α-酮戊二酸氧化能力微弱；柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶活性强；具有向环境泄露谷氨酸的能力；不分解利用谷氨酸，并能耐高谷氨酸，产谷氨酸8%以上；

一株产谷氨酸菌株的复合诱变选育及突变株的生物学特性

ｔｖｌｔｍｉｃｄｙｉｌｒｉｅｏ１ｉｅｇｕａｃａｉｅｄａｒｖｄｔ０６．０ｇ１／Ｌ，ｔｅｐｒｅｔｇｆ２７ｉｈｅｐｐｏｉｔｌｈｎｔｅｃｒｅｐｎｎｉｌｆｈｅｃｎａｅｏ５．４ｈｇｒａｒｘｍａｅｙｔａｈｏｒｓｏｄｉｇｙｅｄｏ
下，始菌株的谷氨酸产量为８．８ｇＬ．原４３／）对该突变株的产谷氨酸代谢特性进行研究，果表明：结其最适初始ｐＨ值
为７２最佳培养温度为３．，０℃ ，以葡萄糖为最佳碳源，其谷氨酸产量最高时相应的葡萄糖浓度为１００ｇＬ其某些５．／，
第２８卷
第１期
天
津
理
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ห้องสมุดไป่ตู้
大
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学
报
Ｖｏ＿．１ｌ２８ＮｏＦｅ２２ｂ．０ｌ
２１０２年２月
ＪｏＵＲＮＡＬＩｏＦＴＡＮＪＮＩＵＮⅣ ＥＲＳＴＹＩｏＦＴＥＣＨＮｏＬｏＧＹ
文章编号：６３０５２１０－０３０１７ —９Ｘ（０２）１０８ — ６
ｔｅｏｇａｓａｎ（ｎｅｔａｅｃｌｒｇｃｎｉｏｓｓｔｅｔｎｄａｏｅｔｅａｕａｎｙａｏｔ４３／）ｎｈｒｉｌｔｉＵｄｒｈｓｍｕｕｉｏｄｔｎｅｍｎｏｅｂｖ，ｈｌｅｗｓｌｂｕ８．８ｇＬ．Ｏｉｎｒｅｔｎｉａｈｉｖｏ
ｉｈｒｅｔｔｅｍｅｉｍ，ｉｉａＨ２～７６，ｎｕａｉｇｔｍｐｒｔｒ０ａｄｏｅｃｌｒｇｐｒｄｏ４，ｉｕｌ— ｎｔｅｆｍｎａｉｄｕｅｖｎｔｌｐ７．ｉ．ｉｃｂｔｅｅａｕｅ３ ℃ ｎｎｕｔｉｅｉｆ８ｈｔｅｍｕａｎｕｎｏｓ

N+注入超亚适量谷氨酸高产酸菌种选育

发酵科技通讯第42卷N +注入超亚适量谷氨酸高产酸菌种选育王华南吕辉刘云艳任远(河南莲花味精股份有限公司项城466200)摘要：摘要：采用N +离子注入技术对亚适量生产菌株L H 03—186进行诱变处理，经多次离子注入诱变，筛选乙醛酸和琥珀酰CoA 营养缺陷型菌株，选育出生物素超亚适量突变菌株L H l 2—279，能够在超亚适量工艺条件下保持较稳定的O D ，使谷氨酸发酵产酸和转化率指标分别提高了21．6％和8．5％。

关键词：N +离子注入超亚适量谷氨酸菌种诱变选育离子束生物技术是新型的通过将低能离子注入生物体内研究生物学效应和作用机理、广泛的应用于遗传育种和基因工程等方面的一种综合技术，离子束诱变育种具有损伤轻、突变率高、突变谱宽、突变性状稳定等突出的优点。

在生物素超亚适量谷氨酸发酵我公司生产使用菌种L H 03-183，但该菌种为生物素亚适量工艺下诱变出的菌种，在引入超亚适量工艺后，已不能达到生物素超亚适量工艺的要求，具体表现在发酵中后期通风比增大后，发酵O D 降幅明显，菌体容易老化，造成发酵产酸偏低。

本文采用低能N +离子注入技术对L H 03—183进行了诱变选育，筛选乙醛酸和琥珀酰C oA 营养缺陷型菌株，得到了适合生物素超亚适量生产工艺的突变菌株L H l 2—279，产酸和转化率较出发菌有明显的提高。

1材料与方法1．1菌种莲花味精生物素亚适量谷氨酸发酵生产菌株LH 03—186，黄色短杆菌，生物素营养缺陷型菌株，在添加生物素的基本培养基上能够生长，超亚适量工艺发酵生产平均产酸11．59／dL ，转化率60．2％。

1．2所用设备、仪器及药品、试剂1．2．1实验所需设备、仪器■●离子束注入机、超净工作台、干热灭菌箱、蒸汽灭菌锅、离心机、紫外分光光度计、恒温摇床、分析天平、涡旋混合仪、显微镜、台式水浴恒温振荡器、恒温无菌培养间，三角瓶、容量瓶、培养皿、试管等常用仪器。

1．2．2所需药品、试剂牛物素、乙醛酸、琥珀酰C oA 、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、N aC l 、硫酸铵、琼脂、K H ：P04、K 2H P043H 20、M gS047H 200．05、FeS047H 20、M nSO 。

谷氨酸生产菌的选育

•
生化121
•
22号
谷氨酸生产菌的选育方法，主要是
采用常规的诱变育种及遗传工程技术构建工程菌株。
诱变育种
利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随即突变频率，扩大变异幅度，通过一定的筛选方法，获取所需要优良菌株的过程，称为诱变育种。
诱变育种包括诱变和筛选两个部分：首先，以合适的诱变剂处理大量而均匀分
（5）摇瓶筛选将突变株接入摇瓶发酵培养集中，进行摇瓶发酵，比较菌株的谷氨酸产量，选出谷氨酸高产菌株。
(6)原生质体制备将DES突变株的斜面菌接入一级种子培养集中，32摄氏度振荡培养5h，加入青霉素G，使青霉素G的浓度为0.6U/ml，继续培养3h，离心弃去上清液，用高渗稳定液洗涤2次，将菌体与高渗稳定液混合，于装有玻璃珠的无菌三角瓶充分振荡，制成菌体的高渗悬液，调节菌体浓度为（1-3）× 个/ml。然后，加入溶菌酶，使其浓度为200-800U/ml，恒温32摄氏度振荡处理，镜检观察原生质体的形成情况，当95%以上的细胞变为原生质体时，离心弃去上清液，用高渗稳定液洗涤2次，最后制成原生质体的高渗悬液。取1ml原生质体悬液，用无菌水稀释后涂布于完全培养基上恒温28摄氏度培养72h，以霉检前的菌悬液为对照，根据在平板上形成的菌落数计算原生质体形成率，计算公式如下：原生质体形成率=
体再生→香豆素和氯化锂平板筛选
→谷氨酸为唯一碳源平板筛选→摇瓶筛选→UV突变株→稳定性试验 →生产条件试验
谷氨酸菌诱变选育操作步骤
（1）菌悬液的制备将出发菌株AS1.299斜面菌接入一级种子培养集中，32摄氏度振荡培养8h，离心去清夜，加入7.0缓冲液稀释菌体泥制菌悬液。
（2）硫酸二乙酯诱变在菌悬液中加入硫酸二乙酯，使硫酸二乙酯浓度为1%（体积分数），在电磁搅拌下处理20—30分钟，处理后加入硫代硫酸钠终止反应。

谷氨酸发酵生产菌的研究与开发

谷氨酸发酵生产菌的研究与开发谷氨酸发酵生产菌的研究与开发L一谷氨酸微生物工业化发酵生产已有50余年历史，回顾国内各味精厂曾使用过的菌种，主要是1．天津短杆菌；2．钝齿棒杆菌；3．北京棒杆菌及它们的突变株。

目前厂家用葡萄糖发酵所使用的菌种主要为天津短杆菌T613的突变株，有FM820；FM84—415；FM一1至0 FM一20；S9114等，上述生产菌种，主要是通过诱变为主的微生物育种，它的产酸能力伴随着谷氨酸发酵生产发展获得了很大的提高。

但如果在现有产酸能力情况下，继续采用传统(经典)微生物育种技术(如诱变、细胞融合等手段)选育菌种，以期达到大幅度提高产酸率和糖酸转化率已变得相当困难。

因此，采用现代基因工程手段改造菌种，从而提高产酸率和糖酸转化率不失为目前最有效的方法。

但上述菌种在基础研究方面的工作并不十分深入，甚至是短杆菌还是棒杆菌在概念上也不十分清晰，这无疑给用基因工程手段改造菌种带来一定的困惑。

L一谷氨酸作为生产量最大的氨基酸之一，通过改造菌种以提高产酸率和糖酸转化率具有很大的经济意义。

国内在谷氨酸菌种基因改造方面的研究工作到目前为止基本上还属空白，国外在这方面的研究工作已取得了一定的科研成果，但报导不多，且菌种、生产工艺以及原料和国内技术有所差别。

根据国内现有生产菌种的特性，利用基因工程手段改造生产菌种，从而提高产酸率和糖酸转化率，虽还需要一段时间的深入研究，但这种趋势和研究结果显示，届以时日，谷氨酸的产酸率和糖酸转化率定会有较大的突破。

目前，在棒杆菌中的表达质粒和针对谷氨酸合成代谢途径中关键酶表达基因方面已做了一定的工作，如果进一步利用基因工程手段在现有谷氨酸生产菌种方面做更深入的研究就可达到提高菌种的产酸率和糖酸转化率目的，并且不必对目前的生产工艺和配方做过多的修改。

1 棒杆菌表达质粒的构建目前国内的生产菌种产酸水平已很高。

如果撇开目前使用的生产菌种，而重新构建在基因工程研究工作方面比较成熟的菌种，如大肠杆菌上进行产谷氨酸基因重组，那构建的新菌种则很难超越在谷氨酸代谢合成机理上已很有效的棒杆菌的产酸水平，生产工艺也要变化，所以没有实际应用价值。

第三章谷氨酸产生菌及其扩大培养

只耗底物不产产物。
4.1.3分离纯化步骤 4.1.3分离纯化步骤
• 平板稀释或划线分离，分离单菌落。 • 对分离的单菌落斜面进行小型发酵实验，筛选高
产菌株。
4.1.4 分离纯化的意义
• 保证稳产高产的措施。 • 进行生产育种，自然育种。
4.2 菌种的保藏
• 斜面，4℃冰箱保存，生产用菌，斜面，4
• ①分类：伯捷细菌分类手册 • 界（kingdom）；门（phylum）；纲（class）；目界（kingdom）；门（phylum）；纲（class）；目 • • • • • •
（order）；科（family）；属（germs）；种（species）； order）；科（family）；属（germs）；种（species）；株（strain）株（strain）植物界；细菌门；真细菌纲；真细菌目；短杆菌科（短杆菌属）；棒杆菌科（棒杆菌属）。 ②分类的依据形态特征生理特征和生化反应
• 菌种为什么要分离纯化？产生了退化。 • 4.1.1 退化的原因： • 自发突变率10-8 自发突变率10 • 诱变菌种会产生恢复突变。
4.1.2菌体变异现象 4.1.2菌体变异现象
• 显微镜检，菌体形态多样，大小不均匀。 • 菌体生长速度缓慢，发酵周期拉长。 • 底物消耗速度慢，目的产物产量低，或发酵后期，
• 2.1 国内生产中使用的谷氨酸发酵菌株 • 我国氨基酸发酵的历史已有40年，先后使用的菌我国氨基酸发酵的历史已有40年，先后使用的菌 • • •
株： As1299；7338； As1299；7338；D110 As1542；Hu7251； As1542；Hu7251；B9 T6-13；FM84-415；S9114 T6-13；FM84-415；

谷氨酸生产菌及扩大培养

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二，现有谷氨酸生产菌的菌学性质：
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三，现有谷氨酸生产菌的主要特征：
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三，现有谷氨酸生产菌的主要特征：
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三、现有谷氨酸生产菌的主要特征（总结）
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在发酵中、后期感染噬菌体后，菌体细胞
形态不规则，边缘不整齐，有的边缘似乎有许多毛刺状的东西，有细胞碎片。
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第三节谷氨酸生产菌的育种
1，日常菌种工作
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第三节谷氨酸生产菌的育种
育种思路
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第三节谷氨酸生产菌的育种
育种思路
1.切断或减弱支路代谢 2.解除自身的反馈抑制 3.增加前体物的合成 4.提高细胞膜的渗透性 5.强化能量代谢 6.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株
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二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态
从谷氨酸发酵中菌体形态的变化来看,大致可以分为长菌型细胞、转移期细胞和产酸型细胞3种不同时期的细胞形态。
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三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态
发酵前期感染噬菌体后，菌体细胞明显减少, 细胞不规则，发圆、发胖，缺乏“Ｖ”字形排列，有明显的细胞碎片，严重时出现拉丝、拉网，互相堆在一起，几乎找不到完整的菌体细胞,类似蛛网或鱼翅状。
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第四节利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌

2010怎么应用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌_

发酵科技通讯第39卷责》确定各岗位工资比例，并作为岗位工资的重要考核指标，对未履行职责造成损失的，视其程度将所占工资比例的全部或部分扣除。

4.5.2对质量问题实行奖惩制。

进厂物资、出厂产品以及各工序半成品，全部实行质量责任落实到个人，尽可能杜绝人为造成的质量事故。

对质量管理有突出贡献的应给予奖励，做到赏罚分明，奖惩过硬。

以增强员工的质量意识，提高优质生产的积极性、主动性。

综上所述，要保证产品质量，必须做到以下几点：（1）、保证原辅材料的供应质量。

（2）、保证设备运行质量。

（3）、严格控制各工序的半成品质量。

（4）、提高职工的思想素质，增强质量意识。

前两方面能保障正常的生产秩序，后两方面则会提高产品合格率，从而降低消耗。

都是提高质量、增加效益不可缺少的条件。

只有做到各个环节，各个方面相互协调，共同努力，才能够既保证产品的质量，又降低成本，从而提高生产效益，也只有这样，产品才能在激烈的市场竞争中立于不败之地。

参考文献:《质量专业理论与实务》中国人事出版社2001年6月出版!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"怎么应用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌？应用细胞融合、转导、转化、基因工程技术是今后定向育种的发展方向，近年来已有不少报道。

现分述如下：（1）细胞融合技术细胞融合技术是将两个性状不同的细胞（包括同种、不同种、不同属等）去掉细胞壁在聚乙二醇（PEC ）催化下，融合到一起后长出一个新的细胞（融合子），这个新细胞同时具有两个亲株的不同特性或互补。

在谷氨酸生产菌的选育中，应用细胞融合技术能够把发酵周期短的菌和产酸高的菌，耐高温的菌和产酸高的菌、抗噬菌体的菌和产酸高的菌、菌体大的菌和产酸高的菌等等融合到一块，选育新的优良菌种。

怎样选育一株谷氨酸高产苗

• 4.培养 • 将涂布好的平板用黑纸包好，倒置，于32。 C培养48h。
• 5.菌落计数、计算致死率以及绘制致死率曲线 • 将培养好的平板取出进行菌落计数。根据葡萄糖浓度为140g/L 的平板上的菌落数，计算出紫外线处理的致死率，计算公式如下： • 致死率= 对照每毫升菌液中活菌数 - 处理后每毫升菌液中活菌数 x100% 对照每毫升菌液中活菌数
• 7摇瓶产酸筛选包括初筛和复筛 • 1）初筛：对照斜面及上述挑取菌株的斜面培养后，分别用接种环取1环接于装有 50mL摇瓶发酵培养基德500mL三角瓶中，一个菌株接1瓶。置于振荡培养床，32。C、 96r/min培养36h。培养过程中，在无菌操作条件下，定时检测pH，当pH降低至 6.8~7.0时，加入适量无菌尿素溶液。应参照谷氨酸生产工艺，以筛少量多次为原则
• 将种子培养液接于装有47.5mL摇瓶发酵培养基的500mL三角瓶中，1个菌株接33瓶。培养过程中参照谷氨酸生产工艺，采用变速调温进行控制培养条件，并定时检查pH，当pH降至6.8~7.0时，加入适量无菌尿素溶液。发酵结束，检查发酵液中谷氨酸含量，筛选出产酸最高的1株菌株，作为生产的菌株。
• 进行添加尿素溶液。发酵结束，检测发酵液中谷氨酸含量（参照谷氨酸测定方法），确定产酸较高的5株菌株，做为复筛使用。 • 2）.复筛：取培养好的对照斜面及上述5株菌株的斜面，分别用接种环取1环接于装有 20mL摇瓶种子培养基的250mL三角瓶中，一个菌株接1瓶，置于振荡培养床，32。C、 96r/min培养10h。然后，以5%的接种量，
• (2)诱变处理 • 预热紫外灯、加菌悬液、紫外灯照射。 • 1）预热紫外灯：诱变箱的紫外灯为15W，照射距离为30cm,照射前紫外灯预热20min,使紫外线强度稳定。 • 2）加菌悬液：取5套装有磁力搅拌棒的无菌培养皿（ ɸ90mm),分别标记40s、60s、80s、100s、120s，并在每个培养皿中加入上述菌悬液 10mL。 • 3）.紫外线照射：将上述培养皿置于磁力搅拌器上，开启开关使菌悬液旋转，打开皿盖，分别照射40s、60s、80s、100s、120s。照射后，盖上皿盖，取出放在红灯下。

谷氨酸生产菌的特征育种及扩大培养

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三、应用转导法
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四、应用重组DNA技术
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第六节菌种的扩大培养和种子的质量要求
一、菌种扩大培养的目的
接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间、保证生产水平
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二、菌种扩大培养的过程
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1、斜面菌种的培养
培养基：葡萄糖0.1%，蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.25% ，酵母膏0.5%，琼脂 2%， pH 7.0-7.2 培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细。生长斜面要求： 32℃，生长18-24小时，生长良好，
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三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态
发酵前期感染噬菌体后, 菌体细胞明显减少,细胞不规则,发圆、发胖,缺乏 "Ｖ"字形排列,有明显的细胞碎片,严重时出现拉丝、拉网,互相堆在一起, 几乎找不到完整的菌体细胞,类似蛛网或鱼翅状。
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在发酵中、后期感染噬菌体后,菌体细胞形态不规则,边缘不整齐,有的边缘似乎有许多毛刺状的东西,有细胞碎片。
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二
种子罐配料
级
种
空消
子
0.2MPa，130℃,50min
培
养
打料
操
培养基加至罐体积60-75%
作
实消
流
0.1 MPa，118℃,5min
程
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二级种子培养的质量要求：
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三、影响种子质量的主要因素
培养基
种龄
温度
接种量
pH值
溶解氧
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一、简述现有谷氨酸生成菌的主要特征。二、简述谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态。三、谷氨酸发酵日常菌种工作有哪些？四、简述菌种扩大培养的一般过程。五、简述二级种子培养操作流程。

第四章谷氨酸生产菌的主要特征、育种及其扩大培养

1.发酵前期感染噬菌体的菌体形态
细胞数量明显减少，细胞不规则，发圆，发胖，有明显的细胞碎片，严重时出现拉丝、拉网。
生产上表现为排气口二氧化碳迅速下降，OD 值下跌，耗糖缓慢等。
2.发酵中后期感染噬菌体的菌体形态
细胞形态不规则，边缘不整齐，有的边缘似乎有毛刺状的东西，有细胞碎片。
生产上的表现： OD值下降，泡沫多，黏度大，
胞
0～10h 多排列成单个、成对及V字形
转移期细 8～18h或细胞伸长、膨大，当生物素贫乏时，
胞
10～20h 向产酸型细胞转变
产酸型细 16～20h
胞
之后
细胞伸长、膨大、不规则状，缺乏 V字形，边缘颜色浅，稍模糊，有的甚至残缺不全，但菌体形态基本清楚。胞内出现横隔，花生状。
三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态
一、种子的菌体形态
形态斜面培养相似一级种子相似二级种子相似
大小细小
革兰氏染色
浅
大，粗壮深
大，粗壮深
菌体短杆或棒杆状，两端钝圆，无分枝，细胞单个、成对或V形，是谷氨酸非积累型细胞。
二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态
发酵时间细胞形态
长菌型细 0～8h或与二级种子相似，多短杆至棒状，
以上
残糖：
消耗 1%左右
噬菌体检查：无
镜检：
菌体生长旺盛，
排列整齐
革兰氏染色：阳性
三、影响种子质量的主要因素
1.培养基构成斜面培养基含糖低，二级种子培养基尽量接近发酵培养基。
2.温度种子培养要选择最适温度。因为幼龄菌对温度变化敏感。
3.pH 要比较稳定。
4.溶解氧不同时期需氧量不同，区别控制。

谷氨酸生产菌的筛选及保藏

项目名称项目四---谷氨酸生产菌的筛选及保藏一．项目背景“南化生物技术有限公司”目前准备进行谷氨酸的生产，现阶段存在的主要问题是没有现成的菌种，我们已经向中科院微生物研究所购买生产用菌，但是至少需要两个月的时间，在这段时间内，请各科研小组自己筛选谷氨酸生产菌用于实验室实验用。

二、项目目标及任务1、项目目标：（1）确定从自然界筛选谷氨酸生产菌的方案；（2）能筛选到谷氨酸生产菌；（3）能够对筛选到的谷氨酸生产菌进行选育；（4）能够将筛选到的生产菌进行保藏。

2、项目任务：能够从自然界中筛选出谷氨酸生产菌，并能够学会菌种的选育及保藏。

四、项目实施方案谷氨酸生产菌主要是棒杆菌、短杆菌、微杆菌和节杆菌的细菌。

故筛选这类菌时，可在分离培养基中加入抗真菌化合物排除真菌。

谷氨酸生产菌分纯后首先要挑选菌落形态正常、生长丰富的单个菌落，也要挑选大小、颜色、形态等不同的单个菌落，特别要挑选小而完整、表面光滑、淡黄色或乳白色的隆起高的菌落。

工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。

在实验工作中，为使筛选达到事半功倍的效果，总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选：（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。

（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。

（3）从一些发酵制品中分离目的菌株。

菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。

含微生物样品的采集：自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。

但总体来讲土壤样品的含菌量最多。

自然界中有目的微生物分离的原则土样的采取→预处理→培养→菌落的选择（一)采样一、从土壤中采样土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。

从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。

谷氨酸生产菌培养基最优配比设计

谷氨酸生产菌培养基最优配比设计摘要：采用均匀设计方法，优化工一答氨酸生产菌发酵培养基的组成，经回归分析和发酵试验，得出最佳配方．在此条件下，谷氨酸的发酵指数为2．57 g·(b-L) ，其转化率为51．4关键词谷氨酸，发酵培养基，均匀设计谷氨酸能参与人体氨的代谢，以及各种生理活动．尽管发酵法生产谷氨酸已有悠久的历史，但人们仍不断地致力于菌种和发酵条件的研究“，以期提高产酸率．国内谷氪酸的生产菌多数是生物索缺陷型菌株，培养基的营养条件对产酸率有很大的影响．发酵过程是一个与微生物生命活动相联系的复杂生物化学过程。

，影响因素较多，且因素之间互相影响．要利用为数不多的试验，获得有充分代表性的试验结果，试验的设计方法就显得十分重要．本研究利用均匀设计的方法，优化培养基的配方，增加目标产物工一谷氨酸的产量．1 材料与方法1．1 主要原材料(1)菌种为谷氨酸棒杆菌(Q一97)，由福建省泉州市中侨集团味精厂提供的菌种分纯而得．(2)口服葡萄糖，市售．糖蜜、玉米浆、尿素为工业用原料．其它试剂均为化学纯试剂．1．2 培养基(1)斜面培养基：牛肉膏蛋白胨培养基．(2)一级种子培养基：3O g口服葡萄糖，30 g玉米浆，1．5 g K2HPO ，6 g尿素，0．4 g MgSO4·7H2O，0．001 g FeSO ‘，0．001 g MnSO：，1．0 L水，pH值为6．7．(3)发酵培养基：160 g口服葡萄糖，6 g尿素，NaHPO。

，KCI，MgSO。

·7H O，玉米浆等糖蜜按比例加入，1．0 L水，pH值为7．0．1．3 培养条件(1)一级种子：培养温度34℃，培养时问根据pH值和OD值而定．AOD>10．45，pH值为7．0～7．2．(2)发酵培养：接种量为2．5 ，摇床转速为110 r·min_。

，培养温度：在O～12 h时为34～35℃，在12～28 h时为36~37'C，28 h至放罐时为38~39℃．培养过程中补加尿素，控制pH值．发酵终点控制为发酵液中残糖耗至0．5 以下，或谷氨酸不再增加，一般为32 h．1．4 分析方法(1)发酵液中残糖的测定：采用DNS法．(2)OD值的测定：稀释一定倍数后，在波长640llllI1处用721分光光度计测光密度，光程1 cm．(3)pH测定用精密pH 试纸测定．(4)谷氨酸含量测定：采用SAB一40系列生物传感器双功能分析仪测定，或采用华勃氏法测定．1．5 均匀设计采用均匀设计的方法“优化发酵培养基的配方，以发酵终点产酸作为衡量标准．用多元二次多项式逐步回归的方法，根据实验数据和预定数学模型，运用数理统计的方法进行参敷估计，建立回归方程．推断其可信性，由回归方程对发酵产酸进行预测．2 结果与讨论2．1 均匀设计方案厦实验结果发酵培养基中，葡萄糖谁度和初始尿素浓度为固定组成．主要考察NaHPO (x。