谷氨酸生产菌的选育汇总.

谷氨酸菌诱变选育操作步骤
（1）菌悬液的制备 将出发菌株AS1.299斜 面菌接入一级种子培养集中，32摄氏度振 荡培养8h，离心去清夜，加入7.0缓冲液稀 释菌体泥制菌悬液。 （2）硫酸二乙酯诱变 在菌悬液中加入硫 酸二乙酯，使硫酸二乙酯浓度为1%（体积 分数），在电磁搅拌下处理20—30分钟， 处理后加入硫代硫酸钠终止反应。
酶解前的菌落数— 霉解后的菌落数 酶解前的菌落数


(7)原生质体的紫外线诱变 取5ml原生质体悬液 放入已灭菌的9cm的培养皿中，采用15W，波长 为253.7nm左右的紫外线灯进行照射，照射距离 为30cm，照射时间为20-40h。照射过程采用电 磁搅拌以使照射均匀。 (8)原生质体再生 紫外线诱变后，用高渗稳定液 对原生质体悬液进行适当稀释，吸取0.1ml涂布 于下层固定体再生培养基上，再加入上层固体 再生培养基，轻微摇匀，双层平板法于28摄氏 度培养72h。取1ml原生质体悬液，用高渗稳定 液稀释后涂布于下层固体再生培养基上恒温28 摄氏度培养72h。更具在平板上形成的菌落数计 算原生质体再生率，原生质体再生率=

（5）摇瓶筛选 将突变株接入摇瓶发酵培 养集中，进行摇瓶发酵，比较菌株的谷氨 酸产量，选出谷氨酸高产菌株。

(6)原生质体制备 将DES突变株的斜面菌接入一级种 子培养集中，32摄氏度振荡培养5h，加入青霉素G， 使青霉素G的浓度为0.6U/ml，继续培养3h，离心弃去 上清液，用高渗稳定液洗涤2次，将菌体与高渗稳定液 混合，于装有玻璃珠的无菌三角瓶充分振荡，制成菌 体的高渗悬液，调节菌体浓度为（1-3）× 个/ml。然 后，加入溶菌酶，使其浓度为200-800U/ml，恒温32 摄氏度振荡处理，镜检观察原生质体的形成情况，当 95%以上的细胞变为原生质体时，离心弃去上清液， 用高渗稳定液洗涤2次，最后制成原生质体的高渗悬液。 取1ml原生质体悬液，用无菌水稀释后涂布于完全培养 基上恒温28摄氏度培养72h，以霉检前的菌悬液为对照， 根据在平板上形成的菌落数计算原生质体形成率，计 算公式如下：原生质体形成率=



（3）单氟乙酸平板筛选 将诱变的菌悬液涂布在 含0.5%单氟乙酸的平板上，在32摄氏度的条件下 避光培养36—48h,挑取生长良好的菌落。 （4）高糖平板筛选与高谷氨酸平板筛选 将抗单 氟乙酸的菌株涂在含25%葡萄糖的平板上，培养 48h后，挑取生长良好的菌落，可得到耐高糖菌 株。然后，将耐高糖菌株涂在含20%谷氨酸的平 板上，培养48h后，挑取生长良好的菌株，即得 到耐高谷氨酸菌株。
首先，以合适的诱变剂处理大量而均 匀分散的微生物细胞悬浮液，在引起 绝大多数细胞致死的同时，使存活个 体中DNA结构用适宜的方法淘汰负效 应变异株，选出极少数性能优良的正 变异株，以达到培育优良菌株的目的。
诱变育种的基本流程
合适的出发菌株→制备待处理
的菌悬液→诱变处理→筛选→ 保藏和扩大试验
谷氨酸生产菌的诱变育种流程
以菌株ASL299为出发菌株，采
用复合诱变剂进行诱变
在诱变育种实践中，为了获得协同效
应，常常采取诱变剂进行复合处理， 可以是两种或多种诱变剂的先后使用， 或是同一种诱变剂的重复使用，或是 两种或多种诱变剂的同时使用。
出发菌株ASL299→菌悬液制备→
硫酸二乙酯诱变→单氟乙酸平板筛 选→高糖平板筛选→高谷氨酸平板 筛选→摇瓶筛选→DES突变株→原 生质体制备→紫外线诱变→原生质 体再生→香豆素和氯化锂平板筛选 →谷氨酸为唯一碳源平板筛选→摇 瓶筛选→UV突变株→稳定性试验 →生产条件试验
谷氨酸生产菌的选育
生化121 22号
谷氨酸生产菌的选育方法，主要是
采用常规的诱变育种及遗传工程技 术构建工程菌株。
诱变育种
利用各种诱变剂处理微生物细胞，
提高基因的随即突变频率，扩大变 异幅度，通过一定的筛选方法，获 取所需要优良菌株的过程，称为诱 变育种。
诱变育种包括诱变和筛选两个部分：

（11）摇瓶筛选与稳定性试验
经谷氨 酸为唯一碳源平板筛选后，再对所选 菌株进行筛选，选出谷氨酸产量最高 的菌株。然后，将其连续进行斜面传 代10次，对每代菌种都进行摇瓶试验， 比较各代菌种的谷氨酸生产能力。如 果谷氨酸生产稳定，则该菌株可用于 生产条件试验。
再生的菌落数— 酶解后的菌落数 100% 酶解前的菌落数— 酶解后的菌落数
源自文库
（9）香豆素和氯化锂平板筛选 挑取再生菌 落涂在0.15%香豆素和0.5氯化锂的平板上， 在32摄氏度的条件下培养48h后，挑取生长 良好的菌落。 （10）谷氨酸唯一碳源平板筛选 用牙签法 将抗维生素P类衍生物菌株接到以谷氨酸为 唯一碳源平板上，在32摄氏度的条件下培养 48h后，挑取省长微弱或不声张的菌株，即 为不利用谷氨酸的菌落。