第三章 谷氨酸生产菌的特征、育种及扩大培养1

T613
pH3.0-4.2 接近谷 氨酸结晶等电点
前 期 32-34℃ 中 后 期 36-38℃ 前 期 30-32℃ 中 后 期 34-35℃
B9
大
伸长 膨大
不在该 pH 范围
草黄 色
低
T613感染 噬菌体时， 不能换用 B9，调换 7338.
第三节 谷氨酸生产菌在发 酵过程中的形态变化
一、 种子的菌体形态
第六节 菌种的扩大培养和种子 的质量要求
一、菌种扩大培养的目的


接种量的需要
菌种的驯化

缩短发酵时间、保证生产水平
二、菌种扩大培养的过程
1、斜面菌种的培养
培养基：葡萄糖0.1%，蛋白胨 1%，牛肉膏1%， 氯化钠 0.25% ，酵母膏0.5%，琼脂 2%， pH 7.0-7.2 培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细。 生长斜面要求： 32℃，生长18-24小时，生长良好， 所使用斜面连续传代 不超过3次
基因工程育种（重组DNA技术）
目前应用发酵法生产L-乳酸 常用的微生物仅有两大类:一 类为细菌,多采用乳酸菌,另 一类为根霉。根霉可以直接 利用淀粉质原料生产L-乳酸, 但是产酸量低,副产物多,转 化率低。Sauer等构建了包含 乳杆菌L-乳酸脱氢酶基因的 毕氏酵母,它利用木糖发酵, 初始浓度为100g/L，生产L乳酸达到58g/L，比利用葡萄 糖产生乳酸的水平高。
斜面和一、二级种子在不同培养条件下，细胞形 态基本相似。斜面培养的菌体较细小 , 一、二级种子 比斜面菌体大而粗壮 , 革兰氏染色深。多为短杆至棒 杆状,有的微呈弯曲状 ,两端钝圆,无分枝;细胞排列呈 单个、成对及“V”字形,有栅状或不规则聚块 ;分裂的 细胞大小为0.7～0.9*1.0～3.4um。由于生物素充足, 繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。
三、现有谷氨酸生成菌的主要特征
（1）细胞形态球形、棒状以及短杆状。 （2）G+，无芽孢、无鞭毛，不能运动。 （3）需氧型、生物素缺陷型微生物。 （4）脲酶强阳性 （5）不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白 以及明胶。 （6）发酵中菌体发生明显的形态变化，同 时发生细胞膜渗透性的变化。 （7）CO2固定反应酶系活力强。
一级种子培养的质量要求：
3.
二级种子培养(种子罐)
培养基：水解糖液3%，尿素0.4%， Na2HPO4 0.3%， 玉米浆 2.5%，KCl 0.14%，消泡剂0.5-1kg，PH7.0
培养条件：在种子罐中培养 （容积为发酵罐的1%）， 32℃培养7-10个小时
二 级 种 子 培 养 操 作 流 程
三、天津短杆菌(T613)的形态和生理特征
1、形态特征
典型的短杆状，有时微弯曲，两端稍 钝圆，不分枝。单个、成对及“V”字 形排列。折断分裂。 G+。不运动。无芽孢。
2、培养特征
★ 普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，浅 黄色， 表面湿润、光滑，隆起来自百度文库边缘 整齐，较薄，半透明，无黏性，不产生 水溶性色素。
第二节 国内谷氨酸生产菌及其比较
一、 北京棒杆菌(AS1299)的形态和生理特征
1、形态特征
短杆至小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不 分枝，呈多种形态。
单个、成对及“V”字形排列。 G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。
2、培养特征
普通肉汁琼脂平板：菌落圆形， 24h白 色，48h淡黄色，中央隆起，表面湿润、 光滑，有光泽，边缘整齐且呈半透明状， 无黏性，不产生水溶性色素。
耐谷氨酸、谷氨酸结构类似物、谷氨酰胺抗性突变株
九、选育强化能量代谢的突变株
第五节 利用生物工程新技术选 育谷氨酸生产菌
一、应用原生质体融合技术
钝齿棒杆菌B9
(细胞个体大、易于提取； 产酸率低)
天津短杆菌TG-866
(产酸率高)
融合子F263(细胞个体大、产酸率高)
三、应用转导法
四、应用重组DNA技术
一、现有谷氨酸生产菌的分类
现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、 小杆菌属及节杆菌属中的细菌。 1. 棒状杆菌属(Corynebacterium) 直到微弯的杆菌，一 端膨大呈棒状，折断 分裂形成“八”字形 或栅状排列。葡萄糖 发酵产酸，G+
2
短杆菌属(Brevibacterium)
短的不分枝直杆菌。 多数从葡萄糖发酵产酸， 不发酵乳糖。 G+
3、生理特征
★ 对氧的要求：好氧及兼性厌氧。 ★ 与温度的关系：菌株26~37 ℃ 培养生长 良好，75 ℃ 处理10min不再生长。 ★ pH的影响： pH6~10生长良好， pH5生长 微弱， pH4和pH11已不能生长。 ★ 还原硝酸盐：反映强烈。 ★ 不水解淀粉，不分解纤维素。 ★ 对尿素的耐力，5%以上生长受抑制。 ★ 脲酶试验：强阳性反应。 ★ 产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、 蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵 ★ 生长因素试验：生物素是必需生长因子。 硫胺素是促生长作用。
第三章
谷氨酸生产菌的特征、育种 及扩大培养
1 谷氨酸生产菌的主要特征● 2
国内谷氨酸生产菌及其比较● 目录 contents
3 谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化●
4 谷氨酸发酵的代谢控制育种策略●
5 利用生物工程技术选育谷氨酸生产菌●
6 菌种的扩大培养及种子的质量要求 ●
第一节. 谷氨酸生产菌的主要特征
三、谷氨酸发酵感染噬菌体后 的菌体形态
发酵前期感染噬菌体后, 菌体细胞明显减少,细胞 不规则,发圆、发胖,缺乏 "Ｖ"字形排列,有明显的 细胞碎片,严重时出现拉 丝、拉网,互相堆在一起, 几乎找不到完整的菌体细 胞,类似蛛网或鱼翅状。
在发酵中、后期感染噬菌体后,菌体细胞形 态不规则,边缘不整齐,有的边缘似乎有许多 毛刺状的东西,有细胞碎片 。
3、生理特征
★ 对氧的要求：好氧及兼性厌氧。 ★ 与温度的关系：菌株26~37 ℃ 培养生长良好， 不耐高温，41 ℃ 生长较弱。 ★ pH的影响： Ph5~10均能生长，最适 pH6~7.5。 ★ 还原硝酸盐：反映强烈。 ★ 石蕊牛奶培养：7d后微产碱。 ★ 不水解淀粉，不分解纤维素。 ★ 对尿素的耐力，2.6%以上生长受抑制。 ★ 脲酶试验：强阳性反应。 ★ 产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦 芽糖迅速产酸。 ★ 生长因素试验：生物素是必需生长因素。硫胺 素明显促生长。
三、 选育不分解利用谷氨酸的突变株
选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不长或生 长微弱的突变株。
四、选育细胞膜渗透性好的突变株
吐温-60 生物素 亚适量 青霉素
温度敏感株
五、 选育强化CO2固定反应的突变株 六、选育减弱乙醛酸循环的突变株 七、选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到 α -酮戊二酸代谢的突变株 八、选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反 馈调节的突变株
产酸型细胞：发酵16-20h后。细胞为含磷脂不足的异 常状态，呈伸长、膨大、不规则状，缺乏V字形排列。 发酵后期，细胞较长，呈有明显的横隔的多节细胞， 产酸高。
过量生物素，不同阶段的细胞形态则基本上没有 明显的变化。菌体较粗壮，类似于长菌型细胞。 典型的异常发酵，长菌体、耗糖快、耗尿素快、 发酵周期短、低酸或不产酸。
种子罐配料
空消
0.2MPa，130℃,50min
打料 培养基加至罐体积60-75%
实消
0.1 MPa，118℃,5min
接种
二级种子培养的质量要求：
三、影响种子质量的主要因素
培养基 种龄 温度
接种量 溶解氧
pH值
一、简述现有谷氨酸生成菌的主要特征。
二、简述谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态。
三、谷氨酸发酵日常菌种工作有哪些？ 四、简述菌种扩大培养的一般过程。 五、简述二级种子培养操作流程。
二、钝齿棒杆菌(AS1542)的形态和生理特征
1、 形态特征 短杆至棒状，有时微弯曲，两端钝 圆，不分枝。单个、成对及“V”字形排 列。 折断分裂。 G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。
2、 培养特征
普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，近草黄色， 表面湿润、光滑，无光泽，边缘顿齿状，较 薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。
B9
大
短
后提取容 易，收率 较高，质 量较好
分泌色 素较多
2.5
菌种 细胞 大小 小
天津短杆菌(T613)与钝齿杆 菌(B9)的比较
细胞 形态 变化 更大 等电点 菌落 颜色 淡白 色 生物素 用量 较 B9 低 20-50% 5-8ug/L 糖酸 转化 率 高 发酵温度 噬 菌 体 类 型 交 叉 感染
3
小杆菌属(Microbacterium)
形态与棒状杆菌相似。 发酵葡萄糖产酸弱，主 要产乳酸。 G+
4
节杆菌属(Arthrobacterium)
培养过程中，细胞形态变化较大
球菌 球菌。
G+ G+
杆菌，杆菌
G- , G-
二、谷氨酸棒状杆菌基因组研究进展
谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032
GenBank NC004369
第四节、谷氨酸发酵的代谢控制育种
一、日常菌种工作
1、定期分纯
1-2个月分离纯化一次
2、小剂量诱变刺激
3、高产菌制作安瓿管
二、选育耐高渗透压菌种
耐高糖突变株 选育在含20-30%葡萄糖的平板上 生长好的突变株。 耐高谷氨酸突变株 选育在含15-20%味精的平板上生 长好的突变株。 耐高糖、高谷氨酸突变株 选育在含20%葡萄糖、15%味精的 平板上生长好的突变株。
2. 一级种子培养（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%，FeSO4 2mg/k , MnSO42mg/kg PH7.0 培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200250ml,32℃ 培养12小时。 培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料 已经基本接近于发酵培 养基.
3、生理特征
★ 对氧的要求：兼性厌氧。 ★ 与温度的关系：菌株20~37 ℃ 培养生长良 好，不耐高温，42 ℃ 不生长。 ★ pH的影响： pH6~9生长良好， pH10生长微 弱， pH4~5已不能生长。 ★ 还原硝酸盐：反映强烈。 ★ 石蕊牛奶培养：7d后微产碱。 ★ 水解淀粉，不分解纤维素。 ★ 对尿素的耐力，2.6%以上生长受抑制。 ★ 脲酶试验：强阳性反应。 ★ 产酸物质的测定： G、果糖、甘露糖、蔗 糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵等迅速产酸。 ★ 生长因素试验：生物素是必需生长因子。
四、北京棒杆菌(7338)与钝齿棒杆 菌(B9)的比较
菌种 7338 细 胞 细 胞 等电点 大小 形态 小 菌 落 生物素 生长因 颜色 用量 子 变 化 pH3.0-4.2 接近谷 乳 白 4-5ug/L 生物素 不大 氨酸结晶等电点 色 和硫胺 素 伸 长 不在该 pH 范围 草 黄 5-8ug/L 生物素 膨大 色 发酵 噬菌体 周期 类型 长 感染噬 菌体的 类型不 同， 不会 交叉感 染
二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态
长菌型细胞：发酵0-8h或0-10h。短杆至棒状， 有的微弯曲状，细胞单个、成对及 V字形排列。 转移期细胞：发酵 8-18h或10-20h。 细胞开始伸长、膨 大。在生物素贫乏 的条件下，从谷氨 酸非积累型转变成 谷氨酸积累型。转 移期有长菌型细胞， 也有产酸型细胞。
（8）异柠檬酸裂解酶活力弱，乙醛酸循环 弱。 （9）α -酮戊二酸氧化能力微弱。 （10）NADPH2进入呼吸链能力弱。 （11）柠檬酸合成酶、乌头酸梅、异柠檬 酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强。 （12）能利用醋酸，不能利用石蜡。 （13）具有向环境中泄露谷氨酸的能力。 （14）不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度 的谷氨酸，产谷氨酸5%以上。