谷氨酸生产菌的筛选及保藏

项目名称项目四---谷氨酸生产菌的筛选及保藏

一．项目背景

“南化生物技术有限公司”目前准备进行谷氨酸的生产，现阶段存在的主要问题是没有现成的菌种，我们已经向中科院微生物研究所购买生产用菌，但是至少需要两个月的时间，在这段时间内，请各科研小组自己筛选谷氨酸生产菌用于实验室实验用。

二、项目目标及任务

1、项目目标：

（1）确定从自然界筛选谷氨酸生产菌的方案；

（2）能筛选到谷氨酸生产菌；

（3）能够对筛选到的谷氨酸生产菌进行选育；

（4）能够将筛选到的生产菌进行保藏。

2、项目任务：

能够从自然界中筛选出谷氨酸生产菌，并能够学会菌种的选育及保藏。

四、项目实施方案

谷氨酸生产菌主要是棒杆菌、短杆菌、微杆菌和节杆菌的细菌。故筛选这类菌时，可在分离培养基中加入抗真菌化合物排除真菌。

谷氨酸生产菌分纯后首先要挑选菌落形态正常、生长丰富的单个菌落，也要挑选大小、颜色、形态等不同的单个菌落，特别要挑选小而完整、表面光滑、淡黄色或乳白色的隆起高的菌落。

工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：

一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。

在实验工作中，为使筛选达到事半功倍的效果，总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选：

（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。

（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。

（3）从一些发酵制品中分离目的菌株。

菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。

含微生物样品的采集：自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多。

自然界中有目的微生物分离的原则

土样的采取→预处理→培养→菌落的选择

（一)采样

一、从土壤中采样

土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。

（一）根据土壤特点

1．土壤有机质含量和通气状况

一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。酵母菌分布土层最浅，约5～10cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。

2.土壤酸碱度和植被状况

土壤酸碱度会影响微生物种类的分布。偏碱的土壤（pH7.0～7.5）环境，适合于细菌、放线菌生长。反之在偏酸的土壤（pH7.0以下）环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。

（二）采样方法

用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25处的土样10～25，装入事先准备好的塑料袋内扎好。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。但有时样品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。到一处将取好的土样混匀，取3～4撒到试管斜面上，这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。

二．根据微生物生理特点采样

1.根据微生物营养类型

每种微生物对碳\氮源的需求不一样,分布也有差异。研究表明，微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。２.根据微生物的生理特性

在筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。

三、特殊环境下采样

1．局部环境条件的影响

值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和环境条件综

合因素的影响之外，还要受局部环境条件的影响。

具有特殊性质的微生物通常分布在一些特殊的环境中。

2．极端环境条件的影响

微生物一般在中温、中性pH条件下生长。但在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下，也有少数微生物存在，这类微生物被称为极端微生物。

嗜冷菌的最适生长温度为15℃，在0℃也可生长繁殖，最高温度不超过20℃。主要分布于寒冷的环境中。这类微生物在低温发酵时可生产许多风味食品且可节约能源及减少中温菌的污染。

最适生长pH在8.0以上，通常在pH9～10之间的微生物，称之为嗜碱菌。

（二）培养

含微生物样品的富集培养

富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。

富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。

一般可从以下几个方面来进行富集。

一、控制培养基的营养成分

微生物的代谢类型十分丰富，其分布状态随环境条件的不同而异。如果环境中含有较多某种物质，则其中能分解利用该物质的微生物也较多。因此，在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。

根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点，可通过连续富集培养的方法分离降解高浓度污染物的环保菌。。

二、控制培养条件

在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱