植物(拟南芥水稻)原位杂交详细protocol试验方法

植物材料的固定、包埋和制片

一、植物材料的固定和包埋

在此过程应注意避免Rnase的污染。所使用的熔蜡管（管盖不能耐受180℃烘，只需高压湿热灭菌即可）、量筒、三角瓶和药勺均需180℃烘5小时以上。所用蒸馏水无需用DEPC处理。所固定的材料越小越好，尽可能切除多余的材料。材料取下后应立即固定。取材后若不能立即固定，则应置于冰上运输。配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。

300 ml量为例）

1、先打开一个60℃左右的水浴锅。

2、在通风橱中往三角瓶中加入12 g多聚甲醛(终浓度为4%)。

3、用量筒配300 ml PBS缓冲液（30 ml 10×PBS+270 ml水），另加1粒NaOH，盖好锡

箔纸后，轻轻摇动，稍微溶化后置于水浴锅中溶解。

4、完全溶解后，取出，加0.1% Tween-20 (300 ul)和0.1% Triton(300 ul)混匀（包

埋水稻时还要再加3 ml 25%的戊二醛）。

5、置于冰上或4℃冰箱降至室温，然后用硫酸调pH 至7.0。

6、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中，（一般用10 ml的小瓶）。

7、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用。

二、固定材料

1、取植物新鲜材料，去除不需要的部分至适当大小。注意：所固定的材料越小越好，

尽可能去除无用多余的部分。

2、把取好材料放入冰浴的装有甲醛溶液的小瓶中。注意每瓶中的切块数：太多固定不

好；太少则浪费固定液（固定液:材料≥20:1）。

3、材料放入固定液后，应通过抽真空（1至数分钟，视具体情况而定：尽可能短时间，

以材料沉入固定液中为准），帮助固定液进入组织中，以达到迅速固定植物材料的目

的。抽气减压时，尽量不要使液体过分沸腾。抽真空时，材料一般在固定液中浮起；

抽完真空的材料应该沉入固定液中，有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在

固定液中。一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见，

如果此情况发生，建议抽真空达10分钟后，继续做步骤4。

4、抽真空后需要更换一次新鲜的固定液。

5、更换新鲜固定液后，材料在4℃过夜。

注意：甲醛有剧毒，因此药品的称取和溶液的配置必须在通风橱中进行！多聚甲醛极易飞散；称取时通风橱可暂不抽风；要避免将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染，如有洒落，要及

按以下序列对材料进行脱水（水为高压灭过菌的双蒸水）。

0.85% NaCl 冰浴，30 分钟

2、50%乙醇/0.85% NaCl 冰浴，5 小时

3、70%乙醇/0.85% NaCl 冰浴，5 小时

4、85%乙醇/0.85% NaCl 4℃，过夜

50%乙醇后，材料应开始脱色。

/水 4℃，5小时

2、100%乙醇 4℃，5小时

3、100%乙醇 4℃，过夜

注：第三天起，每个脱水步骤时间可延长至一天。两次100%乙醇脱水后，材料应为无色。

室温，2小时

2、50%乙醇/50% 二甲苯室温，1小时

3、100% 二甲苯室温，1小时

4、100% 二甲苯室温，1小时

5、100% 二甲苯室温，1小时

6、50% 二甲苯/50%石蜡 58℃，过夜（使用熔蜡台）

后，应在通风橱中操作，要避免让在同一实验室工作的人闻到二甲苯的味道。

石蜡（58℃），倾倒时避免产生气泡。

1-2小时，把石蜡装于干净熔蜡管内，置于熔蜡台上熔化备用。

将折好的纸盒于氯仿（废氯仿可回收重复利用）中泡一会，再取出晾干。

包埋蜡块：先准备一盆水放在旁边备用，再将大小合适的纸盒放在熔蜡台上（在纸盒上写明材料的名称等有关内容），将新熔化的石蜡倾倒于此盒内，把材料放到此盒内。用加热的镊子迅速把材料按需要的切面及材料之间的间隔排列整齐。用嘴吹气，使石蜡表面凝固形成一层薄膜时，再平放入冷水中，使其尽快凝固，数秒后翻转蜡块。约半小时后取出，置于有吸水纸的塑料框里晾干。包埋好的蜡块放入4℃冰箱中备用。

二、载玻片和盖玻片的处理

1、将挑好的载玻片和盖玻片放入洗液（2%HCl+70%乙醇溶液：70 ml 无水乙醇+2 ml浓HCl+28

ml H2O）浸泡过夜，流水冲洗干净。

2、准备2个烧杯的双蒸水、2个烧杯的95%乙醇和2个烧杯的无水乙醇，将洗好的载玻片和盖

玻片依次经过这6个烧杯，在干的纸上蘸干酒精后，于酒精灯上烧干。

3、烧好的载玻片和盖玻片放在折好的锡纸上晾干，最后用锡箔纸包裹。

4、180℃烘5个小时。

5、待载玻片冷却，加4 ul多聚-L-赖氨酸（1mg/ml）于一端。用盖玻片（已经过180℃烘5

个小时处理）的一边接触液滴，进行涂片。涂片时应观察到“虹膜”的形成。

注意：若涂片后多聚-L-赖氨酸不形成一层水膜，则表明载玻片没有洗干净，必须重洗。

请注意标记载玻片的哪一面涂有多聚-L-赖氨酸。

6、涂片之后放入37 ℃的烫板中干燥过夜（最短可以4小时，水干了即可），准备切片。经过

处理的载玻片应在一周内使用。。

7、最后封片用的盖玻片不需作任何处理。使用前用擦镜纸擦净即可（主要是防尘）。

三、切片和展片

1、修块。将包有材料的小蜡块（包含一个材料）初步修成六面体，粘在硬木块上。用刀片将

蜡块修成梯形，在材料的周围各留2mm的石蜡即可（尽可能少留）。

2、切片。切片的厚度为7-10 um。在解剖镜下用暗视野观察蜡带，以决定取舍。

3、展片。将DEPC处理过的蒸馏水滴加在涂有多聚赖氨酸的载玻片上（注意分清哪一面涂有多

聚赖氨酸），将蜡带的反面（注意正反面！）漂浮于其上放入烫板上（42℃）进行展片。蜡带完全展开后（数分钟至几十分钟不等，注意观察以免展过头，以组织不裂开为度），吸去多余的水，用一张镜头纸轻轻压在蜡带上，然后用吸水纸吸去多余的水。置于42℃烫板上干燥过夜。

4、切好的片子应尽量在一星期内进行杂交。