凋亡相关基因BaxBad和Bcl

凋亡相关基因Bax、Bad和Bcl-2与PTSD的相关性

肖甄男

中国医科大学 93期

【摘要】创伤后应激障碍(PTSD)是指由于异常威胁性或灾难性心理创伤导致延迟出现和长期持续的精神障碍。PTSD患者有强烈的恐惧和惊吓反应，血中糖皮质激素浓度反常低下，下丘脑一垂体一肾上腺轴(HPA)轴调节紊乱，激活糖皮质激素受体进而上调促凋亡基因Bax，Bad引起海马神经元凋亡，海马萎缩，体积缩小。从而影响记忆学习功能的发挥，造成不同的记忆损害甚至导致记忆缺失。杏仁核是大脑中的“恐惧中枢”，杏仁核和海马的功能密切相关，海马的功能受杏仁核的调节而实现。 PTSD导致凋亡相关基因Bax和Bcl一2比值增大，使杏仁核神经元细胞出现凋亡，杏仁核变稀疏，功能减退。Bcl-2相关家族在海马，杏仁核细胞凋亡中起到了关键性的作用

The Relationship of Apoptosis—related Genes Bax，Bad and Bcl-2 with Pathogenesis

of Post—traumatic Stress Disorder

XIAO Zhen-nan

(93k, China Medical University)

【Abstract】 Post-traumatic stress disorder(PTSD)is an anxiety disorder that can develop after exposure to one or more traumatic events threatened or caused grave physical harm． PTSD patients have a strong sense of fear and startle response，abnormal low blood glucocorticoid concentration，disordered HPA axis, activation of glucocorticoid receptor and the expression of apoptosis—related genes Bax，Bad is down-regulated. These changes cause neuronal apoptosis in hippocampus, hippocampus atrophy,volume decreased and affect the exertion of memory and learning function，inducing different memory impairment even memory lost. Amygdala nucleus is the brain’s “fear center”.The function of hippocampus is closely linked with amygdala and realized by the regulation of amygdala. PTSD increases the ratio of Bax/ Bc1—2 and induces neuronal apoptosis in amygdala, causing the amygdala sparse and hypofunction. Bcl-2 related family play an important role in the neuronal apoptosis in hippocampus and amygdala.

创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder，PTSD)是指由于灾害、战争、恐怖事件、交通意外等引起的巨大痛苦或受惊吓、遭受悲剧导致的精神、身心症状的持续状态或焦虑综合征。是应激疾病中最为典型的一种[1]，严重影响人们的生存质量。PTSD患者有强烈的恐惧和惊吓反应；其血中糖皮质激素浓度反常低下，HPA 轴调节紊乱。在严重创伤应激急性期，在中枢神经系统(CNS)皮质边缘区，特别是杏仁核、海马和下丘脑等处短期内神经可塑性改变，提示这些脑区可能为CNS应激应答敏感区。研究表明，PTSD大鼠海马萎缩[2]，海马神经元发生凋亡[3]，杏仁核和海马的功能密切相关，海马的部分功能可由杏仁核的调节而实现[4]，杏仁核作为边缘系统中重要的皮质下核团，在PTSD时也发生细胞凋亡[5]。杏仁核与海马神经元细胞的凋亡可能与PTSD的发病密切相关。

1. 细胞凋亡

细胞凋亡是指为维持内环境稳定而由基因控制的，机体正常细胞在受到生理和病理性刺激后出现的一种自发的，在自身基因调控下进行的一种主动死亡，是机体维持自身稳定的一种基本生理机制。在生理条件下细胞凋亡主要是作为机体调节细胞群生长消亡平衡的重要手段，与细胞增殖一起维持机体细胞群的自身稳定。细胞凋亡与坏死有本质的不同，凋亡是一

个有基因表达的主动死亡过程。细胞凋亡过程受到一系列相关基因的调节和控制：抗凋亡成员(又称抗凋亡蛋白，antiapoptotic proteins)有Bcl-2、Bcl—xL、Bc1-w、ced-9等，促凋亡成员(又称凋亡前体蛋白，Proapoptotic proteins)有Bad、Bax、Bak、Bid、Bik、Bim、Bcl-xs等。促凋亡成员又分为两类：仅含BH3同源区域(BH3 only Proreins)的成员，包括Bik，Bid，Bad，Bim，Bmf等；含多个同源区域(Bcl-2 homology domain，BH)的成员，包括Bax、Bak、Bcl-xs、Mtd。有研究者【6】将凋亡发生过程分为四个步骤，即诱导凋亡刺激信号的出现、凋亡诱导阶段、凋亡执行阶段和细胞死亡后解体阶段。而凋亡基因Bcl-2家族主要在凋亡执行阶段发挥作用。

2. 凋亡基因Bcl-2家族

细胞凋亡途径中存在Fas／Fas—L介导的死亡受体通路[7-8]和Bcl一2家族调节的线粒体通

路【9】。细胞凋亡过程十分复杂，涉及不同基因及其产物的调控和细胞因子的调节。各种刺激凋亡发生的因素均可破坏线粒体膜，开放线粒体膜孔道、使跨膜电位下降及渗透性增加，并使线粒体内的细胞色素C(Cyt-c)等凋亡因子外溢而激活细胞质内特异性凋亡酶，即半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（caspases），进而导致细胞凋亡。近年来研究表明，Bcl一2家族成员的构成比例是上述两种凋亡通路的核心机制之一，尤其这一家族的2个代表性成员Bax 和Bcl-2，是目前公认的哺乳动物细胞凋亡过程中的正、负调控剂[10]。Bcl-2／Bax基因主要在凋亡执行阶段发挥作用, Bax基因与Bcl-2基因同源，二者可形成异二聚体或Bax与自身形成二聚体，通过转基因动物和基因转染实验研究发现，Bc1-2对细胞凋亡具有明显的抑制作用，而Bax拮抗Bc1-2，促进细胞凋亡。因此Bcl-2与Bax的比例决定着细胞受凋亡因素刺激后的生存与凋亡，一切促进或抑制凋亡基因对细胞凋亡的影响最终归结为Bax与Bcl一2比值的改变。

2.1 Bcl-2与Bax

Bcl一2家族成员含有1～4个同源结构域，现已至少发现19个同源物。根据蛋白在细胞凋亡中的功能可将Bcl一2基因家族分为两类：一类是抗凋亡的，如Bcl一2、Bcl—xl、Bcl—W、Mcl—l；一类是促进凋亡的，如Bax、Bak、Bad、Bid、Bim [11]。其中Bcl一2是B细胞淋巴瘤／白血病-2(B-celllymphoma ／leukemia-2)的缩写。定位于人染色体18q21．3，在正常组织中低表达。1985年,Tsujimoto等【12】研究滤泡性非霍奇金B细胞淋巴瘤时，从其染色体断裂易位点初克隆而得。

Bcl一2是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因[13]，Bc1-2抑制氧自由基的产生或起到抗氧化剂的作用而阻断细胞凋亡[14]。Bcl-2是一种直接调节细胞凋亡的线粒体膜蛋白，其C末端含有1个由l9个氨基酸组成的疏水跨膜区，作为信号锚定序列，负责定位和插入到线粒体外膜，抑制细胞凋亡，其表达可对抗细胞内外的氧自由基对细胞的毒害与损伤作用，其在细胞内表达增强可以抑制或防止多种因素或因子诱发的细胞凋亡，延长细胞的寿命，是许多生理或病理凋亡的关键性调节因子。

Bax是最早发现的促凋亡因子，其中21％的氮基酸与Bcl一2同源。Bax分子结构中含有类似于抗凋亡成员的疏水C端，然而亚细胞分级和免疫组织化学实验均表明Bax在正常细胞中主要定位于细胞浆。虽然在线粒体上也发现有部分Bax存在，但Bax分子并非插入线粒体外膜内而是附着于线粒体表面[15]。

Bcl-2家族成员复杂的相互作用通过控制线粒体外膜的透化作用(MOMP)而实现的。Bax在组织器官中的表达比Bcl-2更加广泛,主要分布在线粒体外膜上。正常情况Bax位于胞质，在凋亡信号诱导下，胞质内的Bax接到死亡信息使其构象发生改变，由胞质移位并插入到线粒体膜中，并在此形成微孔结构的低聚物Bax—Ba x同源二聚体，然后激动MOMP[16]，开启线粒体通透性转换孔引起线粒体跨膜电位下降，释放凋亡前因子包括细胞色素C、omi／htra2、Smac ／DIABLO和核酸内切酶G，释放的细胞色素C与凋亡蛋白活化因子（apoptosis proteinase

activating factor-1， Apaf-1)、dATP及 caspase一9前体结合形成凋亡小体而发生凋亡[17-19]Bcl-2存在于线粒体外膜，其表达可竞争性地与Bax蛋白结合，形成比Bax/Bax同源二聚体更稳定的Bax/Bcl一2异源二聚体，从而“中和”Bax/Bax诱导凋亡的作用，终止细胞凋亡的发生。Oltvai et al[20]认为，决定细胞命运的关键因素是抑制与促进二者间的比率，Bc1-2、Bax分别是凋亡抑制和促进因子，其比值与细胞凋亡的发生直接相关，如二者表达量平衡则细胞生存期正常;当Bcl-2表达量较高时,形成异源二聚体Bcl一2／Bax,抑制细胞凋亡；当Bax 表达量较高时，形成同源二聚体Bax／Bax，通过抑制Bcl-2的抗凋亡作用而促进细胞凋亡的发生【21】。因此有学者将Bc1-2和Bax的比值称作“凋亡开关”【22】。

2.2 Bad

Bad基因首先从鼠的cDNA文库中克隆鉴定出，其后又克隆出人的同源基因，由Yang等于1995年发现，其编码一个含204个氨基酸的蛋白质。双杂交和序列分析发现，Bad可与Bc1-2和Bcl-xL结合形成异源二聚体，具有促进细胞凋亡作用，故名Bad(Bcl-xL／Bcl-2 associated death promoter) 。Bad游离于胞浆而不是固定于线粒体外膜，不含信号锚定蛋白的结构特点决定了它接受多种细胞外传入的信号，并传递到线粒体外膜与其他Bcl-2家族成员相互作用，从而调节细胞的生长或凋亡【23】。

Bad在内源性线粒体凋亡途径中发挥了中枢作用[24-26]凋亡信号和药物处理信号都由Bad整

理并转呈至线粒体外膜，藉此触发caspase依赖性凋亡进程【27-29】。Bad三个磷酸化部位在Ser112、Set136和Ser155【30-32】 ,线粒体相关蛋白激酶（mitochondria—associated protein kinase，PKA)、Ras一丝裂原激活的蛋白激酶(Ras-mitogen-activated protein kinase，RSK)及P21激活的蛋白激酶(P21 activated kinase 1，PAK1)诱导Ser112 磷酸化；PAKl或ATP依赖的酪氨酸激酶AKT（又称蛋白激酶B)诱导Set136磷酸化；RSK或PKA诱导Ser155磷酸化。在生理状态下，磷酸化的Bad与伴侣蛋白14-3-3结合，干扰了Bad与Bcl一2或Bc1-xL的结合从而抑制细胞凋亡。接受凋亡信号刺激后,钙调磷酸酶等诱导Bad去磷酸化，Bad发生构象变化并自转位至线粒体外膜。去磷酸化Bad强烈干扰Bcl-xL-Bax聚合物的稳定性,将Bax从中置换出来。解离后的Bax作用于线粒体外膜形成通透性改变孔道，导致线粒体膜电位变化和Cyt- c 、AIF 外流,Bax结合Apaf-1并与ATP、procaspase- 9、Cyt-c一起形成凋亡体，触发整个凋亡事件的发生。

Bad可以说是Bcl-2／Bax和Bcl-xL／Bax异二聚体的负调控基因，依靠自身的强结合力，以浓度依赖性方式替换Bcl-2／Bax，Bcl-xl/Bax二聚体中的Bax，使Bax游离后成为二聚体而促进凋亡，当一细胞系所有细胞中的Bax同源二聚体含量>80％，再加上适当的信号诱导，细胞就出现凋亡[33]，这表明Bad通过调节Bax同二聚体与异二聚体的比值介导凋亡。

2.3 caspase

细胞凋亡后期的共同途径是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（caspases）的激活。caspases 直接参与了凋亡早期启动、凋亡信号的传递以及凋亡晚期作用于不同凋亡底物( 主要是一些D N A 酶和一些细胞骨架蛋白)并产生细胞皱缩、核分裂、DNA 断裂等等凋亡特征现象。c aspases处于凋亡诱导信号传递、caspases级联反应、下游效应因子作用这一凋亡过程的中心位置。当凋亡起始信号作用于线粒体后，引起线粒体释放细胞色素C(Cyt-c)，接着Cyt-c 与凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)结合并使Apaf-1改变构象形成八聚体，后者与caspase一9结合并诱导其发生自我催化，活化的caspase一9进一步激活下游的caspase，使级联反应进一步放大。因此，caspase-9是细胞线粒体依赖的凋亡途径中重要起始因子而caspase一3被证明是凋亡的关键执行者，激活的caspase一3能裂解大量底物使细胞凋亡。

3. 凋亡基因与PTSD

创伤后应激障碍(PTSD)是指由于异常威胁性或灾难性心理创伤导致延迟出现和长期持续的精神障碍。PTSD患者有强烈的恐惧和惊吓反应。其特征性的症状为病理性重现创伤体验、

持续性警觉增高、持续性回避、对创伤性经历的选择性遗忘等的临床精神症状. 是应激疾病中最为典型的一种，,严重影响人们的生存质量。海马，杏仁核的损伤有PTSD的发生有着紧密的关系。

海马富含各种信使受体，是应激激素作用的一个靶区，因此是调节应激反应并受应激影响最重要的脑部结构之一。海马是大脑的重要结构，在学习和记忆功能以及调节神经内分泌和自主神经活动中起重要作用。Bremner等【34】。用磁共振测量了26例诊断为PTSD越战老兵的海马体积，发现患者右侧海马体积较对照组缩小8％，而其他脑区体积未发现差异。在创伤性应激反应中海马的形态结构发生了明显的变化，主要表现：海马体积缩小[35]、功能减退[36]。李晓明等人的前期研究发现，PTSD样大鼠海马萎缩是由于海马神经元发生凋亡，PTSD 大鼠海马神经元凋亡细胞数量随时间的延长而逐渐增多，于SPS刺激后7d达高峰；Bcl-2蛋白于SPS刺激后4d达高峰；Bax蛋白于SPS刺激后7d达高峰，之后逐渐下降。Bcl一2／Bax的比值于SPS刺激后一过性增加，以后随时间延长比值下降。由此我们推测，Bc1-2和Bax蛋白含量增加以及两者比值失衡可能是导致PTSD大鼠海马神经元发生凋亡的机制之一。

杏仁核是边缘系统中重要的皮质下核团，主司恐惧,位于中枢神经系统(CNS)皮质边缘区，其功能和应激关系密切，因此杏仁核在PTSD的发病中可能起重要作用[37]。有研究报道PTSD 杏仁核体积变小，杏仁核的变化与PTSD症状的严重程度成正相关[38]。丁金兰等人通过大鼠PTSD—SPS模型研究表明大PTSD—SPS后，Bax、Bcl一2表达均增强，Bax／Bcl-2比值升高，超微结构改变[39]， PTSD大鼠杏仁核细胞凋亡率升高，杏仁核神经元发生了凋亡，杏仁核神经元凋亡导致杏仁核功能异常[40,41]。

以上资料表明，凋亡相关基因Bax，Bad，Bcl-2等家族参与了PTSD的发生，在诱导海马，杏仁核神经元细胞凋亡，引起实质萎缩，功能减退并进一步导致患者产生强烈的恐惧和惊吓反应，持续性警觉增高，对创伤性经历的选择性遗忘等临床精神症状中，Bax，Bad的上调和Bcl-2的下调起到了关键性的作用。

[1].Vanitallie T B．Stress：a risk factor for serious illness[J]．Metabolism，2002，

51(6)：40-45．

[2] Lindauer R J，Vlieger E J，Jalink M，et a1．Effectsof psychotherapy on hippocampal

volume in out—patients with post traumaticstress disorder：a MRI investigation[J]. Psychol Med，2005，35(10)：1421-1431．

[3] 袁辉，韩芳，石玉秀．PTSD样大鼠海马神经元凋亡及其ACP变化的研究[J]．中国组织化

学与细胞化学杂志，2008，17(2)：100-1O5．

[4] Roozendaal B，Griffith O K，Buranday J，et a1．The hippocampus mediates glucocorticoid—induced impairment of spatial memory retrieval：dependence on the

basolateral amygdale[J]．Proc NatlAcad Sci USA，2003，100(3)：1328—1333．

[5]丁金兰，韩芳，石玉秀．PTSD发生与杏仁核神经元细胞凋亡的关系[J]．中国组织化学与

细胞化学杂志，2008，17(5)：422—427．

[6]刘婧，李兆申，宛新建，等．凋亡相关基因Bel-2／Bax和Fas／Fasl在应激性溃疡发生发

展过程中的表达及作用[J]．中华医学杂志，2003，83(6)：504-509．

[7]Harper N，Hughes M ，M acFarlane M，Cohen GM ．Fas-associated death domain protein

and caspase-8 are not recruited to the tumor necrosis factor receptor 1 signaling

complex during tumor necrosis factor-induced apoptosis．[J] Biol Chem 2003；278：

25534—25541

[8]Jaeschke H，Gores GJ，Cederbaum AI，HinsonJA，Pessayre D，Lemasters JJ．Mechanisms

of hepatotoxicity．Toxicol Sci 2002；65：166-176

[9]Baskin-Bey ES．Gores GJ．Death by association：BH3 domain-only proteins and liver

injury．Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol 2005；289：G987-90

[10]赵和平，解燕茹.Bcl一2、Bax蛋白表达在非酒精性脂肪性肝病中的作用[J].世界华人消

化杂志,2009,17(23)：2409—2412.

[11]白世平，罗绪刚，吕林．线粒体在细胞凋亡中的介导作用[J]．生命科学，2006，4(18)：

368—372．

[12] Tsujimoto Y，Finger LR，Yunis J，et a1．Cloning of the chromosome breakpoint

of neoplastic B cells with the t(14;18)chromosome translocation[J]．Science．1984，

226(4678)：1097-1099．

[13] Vaux D L，Cory S，Adams J M．Bcl一2 gene promotes haemopoietic cell survival

and cooperates with c—myc to immortalize pre—B cells[J]．Nature，1988，335(6189)：

44O-442．

[14]Hockenbery D M，Ohvai Z N，Yin X M，et a1．Bcl一2 functions in all antioxidant

pathway to prevent apoptosis[J]．Cel，1993，75(2)：241-251．

[15]DESAGHER S，ASTRID S，NICOLS A，et a1．Bid。induced conformational changes of

Bax is responsible for mitochondrial cytochrome c release during apoptosis[J]．J

Cell Biol，1999，144(5)：891—901．

[16]Cheng EH，Wei MC ，Weiler S，et al．Bcl-2，Bcl-X(L)sequester BH3 domain-only

molecules preventing BAX-and BAK-mediated mitochondrial apoptosis[J]．Mol Cell，2001，8(3)：705—711．

[17]Debatin KM ．Chronic lymphocytic leukemia：keeping cell death at bay．Cell 2007：129：853-855.

[18]Wong CK Chen Z，So KL．Li D Li P．Polycomb group protein RING1B is a direct substrate of Caspases一3 and一9．Biochim Biophys Acta 2007；1773：844—852. [19]Bao Q ,Lu W, Rabinowitz JD,Shi Y Calcium blocks formation of apoptosome by preventing nucleotide exchange in Apaf-1．MolCell 2007;25：181-192.

[20]Oltvai ZN，Milliman CL，Korsmeyer SJ．Bc1-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog,Bax，that accelerates programmed cell death．Cell 1993 ;74：609—619.

[21]Rogerio F，Jordao H Jr，Vieira AS, Maria CC, Santos de Rezende AC，Pereira GA，Langone F．Bax and Bcl-2 expression and TUNEL labeling in lumbar enlargement of neonata1 rats after sciatic axotomy and melatonin treatment．Brain Res 2006;1112：80-90.

[22]Higuchi M ，Aggarwal BB，Yeh ET．Activation of CPP32一like protease in tumor necrosis factor-induced apoptosis is dependent on mitochondrial function．J,Clin Invest 1997; 99：1751—1758.

[23] Niquet J，Wasterlain CG．Bim，Bad，and Bax：a deadly combination in epileptic seizures． J Clin Invest， 2004，113：960—962．

[24] Green DR，Reed JC．Mitochondria and apoptosis[J]．Science，1998，281(5381)：1309—1312．

[25] Datta SR，Katsov A，Hu L，et a1．14-3-3 proteins an d survival kinases cooperate to inactivate BAD by BH3 domain phosphorylation[J]．MolCell，2000，6(1)：41—51．[26] Jung JI，Lim SS，Choi HJ，et al Isoliquiritigenin induces apoptosis by depolarizing mitochondriai membranes in prostate cancer cells[J]．JNutr Biochem，2006。l7(10)：689—696．

[27] Kim BC，Mam ura M，Choi KS，et al.Transform ing growth factor beta1 induces apoptosis through cleavage of BAD in a Smad3-dependent mechanism in FaO hepatoma cells[J]．Mol Cell Biol，2002，22(5)：I369一l378．

[28] Ranta F，Avram D，Berchtold S，et a1．Dexamethasone induces cell death in insulin-secreting cells，an efect reversed by exendin-4[J]．Diabetes，2006，55(5)：1380—1390．

[29] Grethe S，Cohella N ，Di Renzo MF，et al．p38 MAPK downregulates phosphorylation of Bad in doxorubicin—induced endothelial apoptosis[J]．Biochem Biophys Res Commun，2006，347(3)：781—790．

[30] Datta SR，Dudek H，Tao X，M asters S，Fu H，Gotoh Y，Greenberg ME．Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell-intrinsic death machinery．Cell 1997；9l(2)：231-241．

[31]Bonni A，Brunet A，West AE，Datta SR，Takasu MA，Greenberg ME．Cell survival promoted by the Ras-MAPK signaling pathway by transcription-dependent and

–independent mechanisms．Science 1999；286(5443)：1358一l362．

[32]Datta SR，Katsov A，Hu L，Petros A，Fesik SW，Yaffe MB．Greenberg ME．14—3—3 proteins and survival kinases cooperate to inactivate BAD by BH3 domain

phosphorylation．Mol Cell 2000；6(1)：41—51．

[33] Yang E，Zha J，Jockel J，et al．Bad，a heterodimeric partner for Bcl—xL and Bcl一2，displaces Bax and promotes cell death[J]．Cell，1995，80(2)：285-291．[34]Bremner JD，Vythilingam M，Yermetten E，et a1．Neural correlates of declarative for emotional valenced words in women with posttraumatic stress disorder related to early childhood sexual abuse [J]．Biol Psychiatry，2003，53(10)：879-889. [35]HULL AM、Neuroimaging findings in post—traumatic stress disorder．Systematic review[J].J Psychiatry，2002，181(8)：102—110.

[36]RAUCH SL，SHIN LM，PHELPS EA.Neurocircuitry models of post—traumatic stress disorder and extinction：human neuroimaging research—past，present，and

future[J].Biolychiatry，2006，60(4)：376—382.

[37]刘婷婷，丁金兰，刘宁宇，等．杏仁核与创伤后应激障碍发病机制的相关性[J]．解剖科学进展，2009，15(3)：329-332．

[38]Hull AM．ncuroimaging findings in post—traumatic stress disorder．Systematic review[J]．Br J Phychi，2002，181(1)：102—110．

[39]刘冬娟，韩芳，刘宁宇，等．PTSD大鼠杏仁核神经元和突触的超微结构研[J].解剖学进展，2009，15(1)：17—20．

[40]丁金兰，韩芳，石玉秀．PTSD发生与杏仁核神经元细胞凋亡的关系[J].中国组织学与细胞化学杂志，2008，17(5)：422—427．

[41]丁金兰，韩芳，石玉秀．创伤后应激障碍大鼠杏仁核神经元凋亡及三偏磷酸酶活性的变化[J]．解剖学杂志，2009，32(1)：19—22．