过氧化物酶活性的测定

过氧化物酶活性的测定（比色法）

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量470 nm 处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。

一、仪器、药品与材料

（一）实验材料

新鲜植物组织。

（二）仪器与用品

分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100 mL 容量瓶，吸管，高速冷冻离心机，秒表，磁力搅拌器。

（三）试剂

１．愈创木酚。

２．30％过氧化氢。

３．100 mmol/L 磷酸缓冲液pH 6.0。

４．反应混合液：取100 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 6.0）50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚28 μL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30 % 过氧化氢19 μL，混合均匀，保存于冰箱中备用。

二、实验步骤

1．称取植物材料0.1 g ，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用5 mL 磷酸缓冲液提取一次，以4000 rpm 低温离心15 min ，上清液即为粗酶液，定容至10 mL刻度，贮于低温下备用。

2．取2支试管，于1只中加入反应混合液3 mL 和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1支中加入反应混合液3 mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释之）。迅速将两支试管中溶液混匀后，倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470 nm 处测定吸光度（OD）值，每隔10S读数一次。

3．结果计算：以每分钟OD变化值（ΔA470 / gFW min）表示酶活性大小，。也可以用每min OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位（U）表示。

过氧化物酶活性（U/gFW·min）= ΔA470×VT/W×VS×0.01×t

式中：

ΔA470——反应时间内OD变化值。

VT——提取酶液总体积（mL）。

W ——植物鲜重（g）。

Vs——测定时取用酶液体积（mL）。

t ——反应时间（min）。