肿瘤动物模型的构建——白血病篇

鼠类白血病模型的建立及治疗

鼠类白血病模型的建立及治疗在医学领域中，动物模型的建立是研究新药或治疗方法的必经之路。

而在癌症领域中，鼠类白血病模型被广泛应用于研究治疗方法和治疗效果。

本文将介绍鼠类白血病模型的建立以及针对该模型的治疗方法。

一、鼠类白血病模型的建立1. 研究鼠的选择建立鼠类白血病模型的第一步是选择适合研究的鼠种。

不同鼠种有不同的生理和病理差异，选择恰当的鼠种可以提高实验的可靠性和可重复性。

常用的鼠种有小鼠、大鼠和裸鼠等。

2. 白血病模型的建立方法建立白血病模型的方法有多种，如化学物质、放射性物质、病毒和基因改造等。

其中，化学物质和放射性物质是比较经典的建模方法，常用的有四氯化碳、苯酚和X射线等。

3. 白血病的诊断和评估建立鼠类白血病模型后，需要对其进行诊断和评估。

目前，常用的评估方法包括流式细胞仪、免疫组织化学和分子生物学等。

二、鼠类白血病的治疗方法1. 化疗化疗是目前最为常见的治疗方法之一。

基于不同的药物和治疗方案，白血病的化疗可以分为多种类型。

化疗的原理是通过杀死快速分裂的白血病细胞，从而达到治疗的目的。

2. 免疫治疗免疫治疗是一种新的治疗方法，其原理是通过调节机体免疫系统的功能，增强机体抵抗力，提高治疗效果。

目前，常用的免疫治疗方法包括单克隆抗体和免疫细胞治疗等。

3. 基因治疗基因治疗是一种新兴的治疗方法，其原理是通过改变细胞的基因表达，从而达到治疗的目的。

目前，基因治疗在白血病治疗中的应用还处于研究阶段。

4. 热疗热疗是一种通过高温杀死癌细胞的治疗方法。

热疗需要利用高温对白血病细胞进行有效杀灭。

该方法在一些难以手术切除的白血病中获得了良好的治疗效果。

三、鼠类白血病模型治疗中的关键问题1. 药物的副作用和耐药性化疗药物的副作用和耐药性是治疗中的关键问题。

目前，研究人员在开发新的化疗药物时需要考虑如何降低副作用和改善耐药性。

2. 治疗方案的选择针对不同类型的白血病，需要采用不同的治疗方案。

目前，研究人员正在探索基于基因、肿瘤标志物和治疗反应等因素的个体化治疗方案。

小鼠模型对白血病的研究

小鼠模型对白血病的研究白血病是一种危险的疾病，不仅影响人类，同时也影响着许多动物。

小鼠作为常用的动物模型，已经被广泛用于研究白血病的发病机理以及治疗方法。

一、小鼠模型在白血病研究中的应用小鼠模型是进行白血病研究的理想选择，因为它们具有以下特点：1.受到人们长期的人为繁殖和筛选，对实验室的环境适应性好，繁殖周期短，数量可控。

2. 小鼠基因组与人类基因组有高度的相似性，而且小鼠与人的免疫系统、造血系统、神经系统等方面也有许多相似之处，因此可以模拟人类白血病发生发展的过程。

3.小鼠模型在进行基因敲除、基因编辑、药物筛选等方面有很好的应用前景。

基于这些优点，小鼠模型被广泛应用于白血病研究。

研究者们利用小鼠模型，在模拟某些人类白血病的病理生理过程中，从细胞水平到整个器官、整个个体的水平来开展研究，不断地去剖析白血病的发病机制。

二、小鼠模型研究白血病的方法1. 建立白血病小鼠模型：构建小鼠白血病模型是开展白血病研究的第一步，在基因水平、蛋白水平等方面对小鼠进行改变，从而引发白血病。

2. 分析小鼠模型的病理生理表现：利用小鼠模型去分析白血病的发病机理，可以通过核磁共振成像技术、流式细胞术等方法对白血病小鼠的病理生理表现进行尽可能详细的描述。

3. 基于小鼠模型探索新的治疗方法：小鼠模型还可以被用于药物筛选、基因敲除、基因编辑等方面的研究，如CRISPR/Cas9技术在小鼠模型上的应用，为后期的临床治疗提供了方便。

三、小鼠模型在白血病研究中的应用举例1. 利用小鼠模拟人类急性淋巴细胞白血病病理生理过程：研究者使用胸腺技术去删除小鼠中的成熟T细胞，再通过转染技术将癌细胞植入体内，以此模拟出人类急性淋巴细胞白血病的发生过程，并通过各种研究手段去分析白血病的机制。

2. 小鼠模型应用于白血病免疫治疗的研究：研究者发现CD19抗原能够被淋巴细胞所识别和进攻，于是他们利用CRISPR技术去制造出携带抗癌基因的淋巴细胞，再将这些细胞注射入到小鼠体内，发现注射后患小鼠的存活率更高。

小鼠微小残留白血病模型的构建及生物学特性研究的开题报告

小鼠微小残留白血病模型的构建及生物学特性研究
的开题报告
一、研究背景
白血病是一组危及人类健康的异质性疾病，其起因来源于白细胞的不断增殖和分化障碍。

小鼠微小残留白血病是一种由感染造成的肿瘤型疾病，其严重危害人类健康。

白血病的发病率持续上升，目前尚无有效的诊断和治疗方法。

因此，建立小鼠微小残留白血病模型，对于研究疾病的发生机制及寻找新的治疗方法具有重要的意义。

二、研究目的
本研究旨在构建小鼠微小残留白血病模型，探讨其生物学特性，寻找新的治疗方法，并为临床治疗提供新的思路。

三、研究方法
1、动物模型的建立：选用小鼠为实验对象，按照一定的方法制作肿瘤模型。

2、病理学研究：用病理学方法观察小鼠的病情变化。

3、分子生物学分析：采用PCR方法分析小鼠肿瘤组织中的分子遗传学变异，并测定相关生物标志物的表达情况。

4、药物治疗：选用体外筛选方法，防治小鼠微小残留白血病。

四、研究意义
本研究通过构建小鼠微小残留白血病模型，研究背景、研究目的、研究方法，探讨疾病的发生机制及寻找新的治疗方法，并为临床治疗提供新的思路，为治疗小鼠微小残留白血病提供了一定的科学依据，具有重要的意义。

肿瘤动物模型及应用

小鼠大鼠、小鼠
肺癌肝癌
诱发性模型的比较医学
▪ 病因学人体肿瘤较为近似。癌变过程基本表现了人体肿瘤发生发展的全过程。
▪ 诱发条件相对单一，剂量较大，与实际情况差异较大。
▪ 实验周期一般6～10个月。 ▪ 相对而言肿瘤恶性程度中等，但不同的模型
其恶性程度也不相同。 ▪ 诱癌物来源困难，对实验环境和防护要求高。
▪ 缺点：生长缓慢，不易同时获得大批病程基本一致的动物，可供选择的模型较少。
▪ 应用：多用于肿瘤发病机理等深入研究。很少用于一般药效学研究。
常见模型介绍
▪ 小鼠自发性乳腺癌 C3H（MMTV/L病毒）
▪ 小鼠自发性白血病 AKR、Afb 、C58
▪ 大鼠自发性肝癌 LEC （肝炎结节肝癌）
肝转移灶→皮下移植（扩增）→胃原位
每次筛选传代不少于6只动物
黑色素瘤的体内筛选
高转移模型的验证
▪ 体外验证细胞增殖能力损伤愈合试验
迁移试验、侵袭实验黏附实验（同质、异质） ▪ 体内验证转移特性验证及病理学观察
肿瘤转移模型的比较医学
▪ 就肿瘤转移的研究而言，体内模型优于体外模型，自发性转移模型优于实验性转移模型，人体肿瘤模型优于动物源性肿瘤模型，原位移植高转移动物模型优于皮下移植高转移动物模型。
移植部位及途按径不同分为： ▪ 异位移植（多采用皮下移植） ▪ 原位移植
移植性模型复制的影响因素实验动物
常见同种移植性模型
▪ 腹水性模型 P388白血病，S180肉瘤，H22肝癌等
▪ 实体瘤模型 W256肝肿瘤，C26肠癌，VX-Ⅱ乳头状瘤
▪ 转移性模型 Lewis肺癌，B16黑色素瘤
免疫缺陷小鼠
▪ 实验转移肿瘤模型尾静脉→肺脾→肝足垫→淋巴结左心室→骨

白血病小鼠模型的建立及鉴定

白血病小鼠模型的建立及鉴定pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒上清感染6～10周龄C57BL/6供者小鼠的骨髓细胞，移植给致死量射线照射的同种同型受者小鼠，建立BCＲ-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型;监测移植小鼠的体质量，生存率;流式细胞仪检测小鼠外周血有核细胞GFP表达(代表有核细胞表达BCＲ/ABL1)和细胞分型;观察小鼠脾脏、肺脏和肝脏等器官大体形态和HE染色变化．结果：移植20d后，移植小鼠表现弓背、活动性减少、精神萎靡的状态，体质量明显降低;流式细胞仪检测外周血中出现GFP+细胞，并且随着移植时间的延长，GFP+粒细胞明显增多．移植小鼠的生存率较对照组明显降低．移植小鼠发病后表现脾脏显著增大、肺出血、肺脏及肝脏出现白色结节和HE染色表现大量细胞浸润，且小鼠脾脏中有核细胞的80%为GFP+Gr-1+细胞，即BCＲ-ABL1+粒细胞白血病细胞．结论：利用此方法成功建立了BCＲ-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型，为研究慢性粒细胞白血病机制和治疗提供了平台．【关键词】BCＲ-ABL1+粒细胞白血病;BCＲ-ABL1;小鼠;生存率;逆转录病毒载体0引言慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)是一种以粒细胞失去分化水平，过度增殖为特征的骨髓增生性疾病，是一种伴有t(9;22)(q34;q11)染色体易位的恶性增生性疾病［1］．该易位染色体由位于9号染色体的原癌基因ABL1部分序列从其正常位置易位至22号染色体的BCＲ区(breakpointclusterregion，BCＲ)形成［2］，其编码的蛋白具有高度异常酪氨酸激酶活性，造成了CML细胞对酪氨酸激酶抑制剂的抵抗［3］．所以，研究CML的发病机制和治疗药物显得尤为重要，而一个良好的实验平台是研究机制和药理的基础．研究［4－5］发现，虽然我们能够利用将CML患者的白血病细胞移植给NOD/SCID小鼠构建的小鼠模型来研究白血病细胞是否导致并维持了CML，但是这种模型不能造成致死性CML且耗时较长;而BCＲ-ABL转基因小鼠模型因为不能完全发展成为髓系增生性疾病且具有潜伏期长的局限性，不利于治疗药物的研究［4－5］．逆转录病毒感染骨髓细胞的移植模型则是一种稳定高效的诱导方式［6］，能够为研究CML的发病机制和治疗药物提供协助．本研究在逆转录病毒感染骨髓细胞移植模型的基础上建立了更加省时、高效且易于监测病程和鉴定疾病类型的方式，成功建立了容易监测及鉴定的BCＲ-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型，为CML的机制和药物研究提供了一个良好的平台．1资料和方法1．1材料1．1．1载体和试剂pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP、pkat-ampac逆转录病毒包装载体由本实验室保存．5-Fluorouracil(5-Fu，Cat#6627)、HEPES和polybrene来自Sigma．抗小鼠Gr-1-APC(Cat#553129)流式抗体来自BD．SCF、IL-3、IL-6来自Peprotech．1．1．2实验动物6～10周龄的C57BL/6小鼠购买并饲养于西安交通大学医学部SPF级动物房．1．2方法1．2．1pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒的制备用293T细胞培养基(DMEM培养液含有10%FBS、1%青链霉素，200mM谷氨酸和1%MEMnon-essential氨基酸)将293T细胞于10cm培养皿培养至密度为80%时，利用pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒载体转染293T细胞，48h后收集pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒上清液立即使用或储存－80．1．2．2采集和体外培养供者小鼠骨髓细胞要求供者和受者小鼠属于同一品系．通常情况下，10只供者小鼠可提供2～3107骨髓细胞．第1天，取6～10周龄SPF级C57BL/6小鼠20只，尾静脉注射0．6mL5-Fu/只，按200mg/kg计算．第4天时，处死小鼠获取4～6107骨髓细胞，将供者骨髓细胞分为两等分，即实验组和对照组，用48mL骨髓细胞刺激培养基(含有77%DMEM，20%FBS，1%青链霉素，200mM谷氨酸，18ng/mL小鼠重组IL-3，20ng/mL小鼠重组IL-6以及100ng/mL小鼠重组SCF)分别悬于两个六孔板中，在CO2培养箱内培养24h．1．2．3pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒感染供者小鼠骨髓细胞第5天，向实验组的六孔板加入pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒第一次转染骨髓细胞培养基(含有50%pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒上清，18ng/mL小鼠重组IL-3，20ng/mL小鼠重组IL-6，100ng/mL小鼠重组SCF，1%HEPES和20μg/mLpolybrene)，每孔2mL，对照组的六孔板加入骨髓细胞刺激培养基，每孔2mL，轻柔混匀后，室温2300rpm离心90min，继续在CO2培养箱中培养3～4h．室温下1500rpm离心10min，丢弃上清液，各加入24mL骨髓细胞刺激培养基，过夜培养．第6天，向实验组的六孔板加入pMSCV-BCＲ/ABL1-I ＲES-GFP逆转录病毒第二次转染骨髓细胞培养基(含有50%pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒上清，18ng/mL小鼠重组IL-3，20ng/mL 小鼠重组IL-6，100ng/mL小鼠重组SCF，1%HEPES和20μg/mLpolybrene)，每孔2mL，悬浮第一次转染后的骨髓细胞，向对照组的六孔板加入骨髓细胞刺激培养基，每孔2mL，轻柔混匀后，室温2300rpm离心90min，CO2培养箱培养3h．最后用Hank's缓冲液悬浮两组骨髓细胞，准备注射受者小鼠．1．2．4致死量射线照射受者小鼠并实行骨髓移植第6天，采用医用电子直线加速器(英国Eiekta)照射6～10周龄SPF级的C57BL/6小鼠12只，辐射剂量920cGy．将上述pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒感染后的供者小鼠骨髓细胞，尾静脉注射给6只受照射后的受者小鼠作为实验组，同样，将未使用逆转录病毒感染后的供者小鼠骨髓细胞，尾静脉注射给6只受照射后的受者小鼠作为对照组，细胞用量为1106/0．4mL/只．SPF级动物房饲养移植后小鼠．每隔一天观察小鼠存活情况、称取体质量;每周采用流式细胞仪检测受者小鼠外周血GFP阳性细胞数量，即代表表达BCＲ-ABL1的细胞．大约15～20d可建立BCＲ-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型．1．2．5BCＲ-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型的鉴定1．2．5．1移植小鼠体质量和生存率监测每隔一天称取并记录实验组小鼠和对照组小鼠的体质量，计算实验组小鼠和对照组小鼠的生存率．1．2．5．2流式细胞仪检测每周取移植受者小鼠内眦血于抗凝剂中，经红细胞裂解液裂解8min去掉红细胞后，1PBS洗2次，检测外周血有核细胞中GFP+白血病细胞的百分比并计数．将濒死的移植受者小鼠处死后观察小鼠脾脏，尽快收集病鼠的骨髓细胞及脾脏细胞，经红细胞裂解液裂解5min去掉红细胞后，1PBS洗2次，利用抗小鼠Gr-1抗体对移植受者小鼠的骨髓和脾脏细胞避光孵育20min，1PBS洗2次，1PBS悬起后流式细胞仪检测实行免疫分型．以Gr-1+GFP+表示粒细胞白血病细胞．1．2．5．3移植受者小鼠肺脏和肝脏HE染色将濒死的移植受者小鼠处死后观察小鼠肺脏和肝脏，将肺脏和肝脏组织标本经石蜡包埋，切片和HE染色后，显微镜下观察白血病细胞的浸润情况．2结果2．1移植小鼠体质量和生存率变化将pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒感染后的C57BL/6供者小鼠骨髓细胞，尾静脉注射给受照射后的C57BL/6受者小鼠作为实验组，以接受同样剂量照射并移植未感染病毒的供者骨髓细胞的C57BL/6受者小鼠作为对照组，每隔一天称取体质量，监测小鼠体质量变化．因为致死量照射，移植后的C57BL/6小鼠体质量表现照射性降低，随后在一周之内恢复体质量并且持续平稳，在移植后3周时，实验组小鼠体质量连续降低，而对照组小鼠体质量保持平稳(图1A)，C57BL/6实验组小鼠与C57BL/6对照组小鼠的体质量变化比较，差异具有统计学意义(P＜0．05)．2．2移植小鼠外周血白血病细胞监测情况C57BL/6受者小鼠接受供者的小鼠骨髓细胞后，每周取移植受者小鼠内眦血，监测受者小鼠外周血中GFP+白血病细胞的水平．通过流式细胞仪检测后发现，C57BL/6实验组小鼠7d后外周血中即出现GFP+细胞(图2A)，并且随着移植时间推移，GFP+粒细胞明显增多(图2B)．至白血病细胞占外周血有核细胞80%时，小鼠迅速死亡．C57BL/6对照组小鼠外周血中始终未出现GFP+细胞．2．3移植小鼠粒细胞白血病建模成功骨髓移植20d左右时，实验组小鼠表现弓背、活动性减少、精神萎靡、进食减少的状态(图3A)．当实验组小鼠体质量连续减轻且外周血白血病细胞持续增高时，处死实验组小鼠和对照组小鼠，观察肺脏、脾脏及肝脏，发现实验组小鼠脾脏较对照组体积增大显著，且出现肉眼可见大小不一数个白色突起(图3B)，实验组小鼠肺脏表现出血、粗糙且布满白色点状结节(图3C)，肝脏布满白色结节(图3D)．将肺脏和肝脏实行HE染色，观察到实验组小鼠肺脏和肝脏有大量白细胞浸润(图3E、3F)．将脾脏实行HE染色，同样观察到实验组小鼠脾脏有大量白血病细胞浸润(图3G)，收集实验组小鼠的骨髓细胞及脾脏细胞，通过流式细胞仪检测发现脾脏中主要为大细胞(图3H)，且脾脏中GFP+细胞占有核细胞的90%(图3I)，利用抗小鼠Gr-1抗体对实验组小鼠的骨髓和脾脏细胞实行免疫分型(以Gr-1+GFP+表示粒细胞白血病细胞)，通过流式细胞仪检测发现脾脏中有核细胞的80%为GFP+Gr-1+细胞，进一步证实是BCＲ-ABL1+粒细胞白血病.3讨论CML是一种因为粒细胞大量增生却失去分化水平的髓系增生性疾病，来源于造血干细胞并且因为含有致癌基因BCＲ-ABL而获得增殖快速于正常造血干细胞的优势［7－8］，因为致癌基因产生的蛋白具有高度异常的酪氨酸激酶活性，持续活化其下游信号分子通路，促动了CML细胞的增殖和抗凋亡水平，造成CML细胞的恶性转化［9］．在CML进程中CML-BP(blasticphase)患者对酪氨酸激酶抑制性药物、异体造血干细胞移植、或者联合化疗效果均较差，死亡率极高［10］．此外，相对于CML-CP(chronicphase)期，CML-BP期基因组的复杂性和异质性均更高［11］．虽然酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼对CML 的治疗有革命性的突破，但是BCＲ-ABL1基因的突变产生了伊马替尼的耐药问题［12－13］．所以，研究BCＲ-ABL1+粒细胞白血病的发生、耐药机制以及新的药物对治疗CML至关重要．虽然我们能够利用CML细胞异体移植小鼠模型和BCＲ-ABL转基因小鼠模型来研究CML的发病机制，但是因为这些小鼠模型构建潜伏期较长，均不利于CML治疗药物的研究．本研究利用逆转录病毒感染骨髓细胞的移植模型具有稳定且潜伏期短的优势，在其基础上对照射方式实行了改进，使得照射一次性成功，耗时大大缩短，为实验过程节省了宝贵的时间;此外，本研究还利用流式细胞仪检测外周血有核细胞中GFP+白血病细胞数来监测整个病程周期，能够准确地了解移植受者小鼠的移植成功率和病程进展，为CML治疗药物的研究提供精确的控制窗口，使得便捷地观测到药物的治疗效果成为可能．这种容易监测及鉴定的BCＲ-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型，能够为CML的机制和药物研究提供极大的协助．BCＲ-ABL1逆转录病毒感染骨髓细胞移植模型能够诱导出3种疾病：类似于CML的髓系增生性疾病，急性淋巴细胞白血病以及单核细胞性白血病，表明BCＲ-ABL1逆转录病毒感染后的骨髓细胞表现出一种混乱的造血方式［14－15］．5-Fu为细胞周期特异性化疗药物，主要杀伤分裂期细胞，从而富集髓系多能干细胞，所以，本研究利用5-Fu处理供者小鼠的骨髓细胞，能够提升骨髓中髓系多能干细胞的百分比，使转染效率极大提升，然后使用粒系干细胞所需的细胞因子培养供者骨髓细胞，能够导致髓系干细胞向粒系发展，最终发展为CML小鼠模型［16］．本研究利用细胞因子体外培养5-Fu处理后小鼠供者骨髓细胞，再利用BCＲ-ABL1-GFP逆转录病毒感染供者的骨髓细胞，并移植给致死量照射后的同种系受者小鼠，通过监测受者小鼠的体质量、生存率、流式细胞仪检测受者小鼠外周血有核细胞表达GFP的情况来判定小鼠的病程进展，简单且高效，此外，利用抗小鼠Gr-1抗体对发病后的受者小鼠的骨髓和脾脏细胞实行免疫分型，进一步证实了BCＲ-ABL1+粒细胞白血病的小鼠模型建立成功，利用流式检测技术能够高效地监测整个建模过程，且容易判定模型类别．此外，通过观察受者小鼠脾脏和肺脏等器官，我们发现白血病细胞于肺脏和肝脏均有浸润，这显示我们的模型起源于骨髓造血干细胞且具有多器官浸润的水平，这与人的CML较为相似，能够作为较理想的CML小鼠模型，为CML治疗药物的研究提供易观测、易控制的平台，为白血病的治疗提供较大的协助．白血病小鼠模型的建立及鉴定。

关于白血病小鼠模型创建的研究进展

关于白血病小鼠模型创建的研究进展引言白血病是一种由异常增殖的白血病细胞引起的恶性血液疾病，其发病机制复杂，治疗手段有限。

为了深入了解白血病的发病机理以及寻找新的治疗方法，研究人员经过长时间的努力，开发了多种白血病模型。

其中，白血病小鼠模型是最常用的模型之一，能够很好地反映白血病的发病过程和治疗效果。

本文将对白血病小鼠模型的创建方法和研究进展进行综述。

创建白血病小鼠模型的方法1.转基因技术转基因技术是最常用的创建白血病小鼠模型的方法之一。

通过介导基因敲除、基因敲入或基因突变等方式，使小鼠体内产生白血病相关基因的改变，从而模拟人体白血病的病理过程。

例如，可以通过操纵白血病相关基因如FLT3、BCR-ABL等来使小鼠产生白血病。

2.骨髓移植骨髓移植是另一种创建白血病小鼠模型的常用方法。

将白血病患者的骨髓或外周血中的白血病细胞移植到小鼠体内，使小鼠产生由白血病细胞引起的白血病。

这种方法可以很好地模拟人体白血病的发病过程，并用于研究白血病细胞的特性和治疗方法的有效性。

白血病小鼠模型的研究进展1.病理特点的模拟白血病小鼠模型能够很好地模拟白血病的病理特点，如骨髓增殖、脾脏和淋巴结的增大等。

通过观察小鼠模型中的病理变化，研究人员可以深入了解白血病的发展过程，并寻找新的治疗靶点。

2.药物治疗方法的研究白血病小鼠模型也被广泛用于研究白血病的治疗方法。

研究人员通过给小鼠注射抗白血病药物，观察其对白血病细胞的作用和疗效，从而评估潜在治疗药物的效果。

这种方法能够快速筛选出具有抗白血病潜力的药物，并为临床治疗提供新的选择。

3.免疫疗法的开发免疫疗法是目前白血病治疗的前沿领域之一。

白血病小鼠模型被广泛用于开发免疫疗法。

研究人员通过改编小鼠的免疫系统，使其产生特异性的抗白血病免疫反应。

这种方法可以有针对性地杀灭白血病细胞，提升白血病患者的生存率。

结论白血病小鼠模型是研究白血病发病机制、评估药物疗效和开发免疫疗法的重要工具。

通过转基因技术和骨髓移植等方法创建的白血病小鼠模型，能够很好地模拟人体白血病的病理过程，并为白血病的研究和治疗提供新的突破口。

高级病理学：肿瘤的动物实验方法

5-6个月期间，每隔30-40天，注射一次二酚已烷剂量递增，0.5→5kg
终止后2-3个月，29个小鼠中４个癌前病变，4个癌瘤。
（四）应用放谢线等辐射引起实验肿瘤的方法
1、“X”线照射：
（1）6,500 ~ 13,000伦→照射大鼠骶部时，前剂量 → 溃疡性“X”射线皮炎后剂量 → 肉瘤
（上述实验亦可由放射性磷引起）
2、注入放射性物质或辐射引起皮肤癌、肉瘤、白血病等。
3、日光照射及紫外线照射日光照射：每天7小时——6-7个月，600小
时以上，裸露部分的皮肤癌变↑↑ 照射剂量增加，癌发生提前,多数量为生
27 - 28大卡 11-15个月出现
33.3大卡 8个月出现
41大卡耳、鼻、足部、眼部出现
移植瘤甲胎蛋白白蛋白前白蛋白转铁蛋白在人休内证明这种蛋白的产生是困难的但利用裸鼠移植做这方面的研究工作是完全可能的大星等建立了一种胃原发的绒毛膜上皮细胞癌的裸鼠移植瘤株这个瘤株hcg还可产生雌激素孕酮和胎盘性催乳素胎盘性碱性磷酸酶患鼠性腺和乳腺呈现妊娠性变化机能性肿瘤functioningtumor3各种治疗方法的研究1化学药物的筛选
（2）保持了原发瘤的特异蛋白，激素分泌及其它功能
肝癌、肝母细胞癌 → 甲胎蛋白结肠癌、直肠癌 → 癌胚抗原肾癌、肝癌 → 促红细胞生存因子。绒毛膜上皮细胞癌 → HCG 部分胃癌 → 雌激素受体，铁传递蛋白受体
（3）染色体核型：保持了人染色体核型——“X“型（而裸鼠染色体核型——“Λ”型）（4）保持了人原发瘤的抗原性（5）保持了人原发瘤对抗癌药的感受性
肿瘤的动物实验方法
一、肿瘤动物实验的途径：
主要途径有三个 1、自发—— 获得足够大量的动物的自发性肿瘤病例 2、诱发—— 使用各种化学物质或辐射在动物身上引起肿瘤 3、移植—— 将自发或诱发的肿瘤从一个动物接种到另一动

小鼠白血病和淋巴瘤的研究

小鼠白血病和淋巴瘤的研究小鼠白血病和淋巴瘤是常见的实验动物模型，被广泛应用于白血病和淋巴瘤的研究中。

这些模型为科学家们提供了丰富的机会，以深入了解这些疾病的发病机制、寻找新的治疗方法，并为临床研究提供重要的参考。

1. 小鼠白血病研究小鼠白血病是一种造血系统恶性疾病，其中造血干细胞或者造血细胞异常地增生和聚集，导致正常造血功能受阻。

在小鼠白血病的实验模型中，科学家们通过将白血病相关基因或突变体导入小鼠体内，模拟人类白血病的发展过程。

2. 小鼠淋巴瘤研究小鼠淋巴瘤是一种淋巴系统恶性肿瘤，它起源于淋巴细胞，通常表现为淋巴结肿大。

在淋巴瘤的研究中，科学家们通过引入淋巴瘤相关基因突变或突变体，成功构建小鼠淋巴瘤模型，用于探索淋巴瘤的发病机制和治疗方法。

3. 实验动物模型的优势小鼠作为实验动物模型在白血病和淋巴瘤研究中具有诸多优势。

首先，小鼠的基因组与人类基因组的相似性较高，使得其作为模型更有代表性。

其次，小鼠具有较短的繁殖周期和较低的饲养成本，能够满足大规模实验需求。

此外，小鼠模型还能够通过基因转染、基因敲除和基因突变等方法进行个体定制，进一步强化模型的准确性。

4. 白血病和淋巴瘤研究的进展借助小鼠模型，科学家们在白血病和淋巴瘤的研究中取得了许多重要的进展。

例如，通过揭示白血病发生的分子机制，科学家们发现特定基因的突变与白血病的发展相关，为白血病的早期诊断和治疗提供了新的思路。

在淋巴瘤的研究中，科学家们发现某些抗体药物能够靶向淋巴瘤细胞表面的特定蛋白，实现对淋巴瘤的精准治疗。

5. 临床应用前景小鼠白血病和淋巴瘤模型的研究成果为未来的临床应用提供了重要的参考。

这些模型不仅可以帮助研究人员验证治疗药物的安全性和有效性，还可以为个体化医疗提供基础。

通过分析不同患者的基因和白血病或淋巴瘤特征之间的关联，有望开发出针对特定基因突变的靶向疗法，提高患者的治疗效果。

结论小鼠白血病和淋巴瘤模型的研究为白血病和淋巴瘤的发病机制、治疗方法以及个体化医疗提供了重要的理论和实践基础。

肿瘤动物模型的构建

肿瘤动物模型的构建第一类是皮下移植瘤顾名思义，这种模型的建立是将肿瘤细胞或肿瘤组织直接种植在小鼠的皮下。

种植的点也有讲究，一般选择血运淋巴回流丰富的腹股沟和腋窝。

可根据实验设计选择移植点，统一移植点的位置，除了遵守实验统一的条件外，待肿瘤成熟后收集肿瘤时留下照片证据也显得美观。

裸鼠（Balb/c 鼠，无毛发，T 淋巴细胞缺陷）是比较常见和常用的实验用鼠，尤其是在皮下移植瘤肿瘤模型的建立中起到重要作用。

裸鼠移植瘤模型的建立具有建立周期短、成瘤率高、易于操作、成本低的优点。

当然，这种肿瘤模型也有缺陷，即不能很准确的模拟正常人体肿瘤发生发展的过程。

肿瘤细胞移植时的简要步骤：首先准备好要移植的肿瘤细胞（细胞量根据不同肿瘤略有不同，我们所用的前列腺癌细胞系每个移植点一般选择1x106左右；肿瘤细胞可与基质胶1:1 混匀后用 1 ml 注射器吸取，基质胶能够给肿瘤细胞提供营养环境，有助于肿瘤细胞生长）。

戴无菌手套后，将小鼠用左手大拇指和食指捏住颈部皮肤，然后将鼠尾用左手无名指和小指固定于左手大鱼际。

将腋窝或腹股沟用75% 酒精消毒 3 次。

右手持吸有肿瘤细胞和基质胶混合液的注射器，在腹股沟或腋窝的位置，45 度斜角进针，注意不要突破腹膜，将针头保持于皮下位置。

然后近水平位置将针头几乎完全插入皮下，将混有基质胶的肿瘤细胞注射入皮下（肿瘤细胞量约1x106），快速退针，左手食指轻压针孔约1 min 后将小鼠放回饲养笼中，注意将小鼠侧放于垫料上，防止其不适呕吐时呕吐物误入呼吸道引起窒息。

2～3 h 后观察小鼠是否苏醒。

如果是利用肿瘤组织（人体肿瘤标本或小鼠移植瘤传代）建立裸鼠皮下移植瘤模型，则需要首先将肿瘤组织用无菌PBS（或1640 培养基）洗涤 3 次，然后在无菌平皿上切成或用无菌剪刀剪成<1 mm3 体积的小块（种植前可裹基质胶）备用。

将小鼠用水合氯醛麻醉后平卧于解剖板上，四肢用胶带固定，将腋窝或腹股沟用75% 酒精消毒3 次，然后用眼科剪剪开约0.5 cm 小口，小镊子将皮下筋膜与皮肤分开，然后将肿瘤组织放入贴近腹股沟或腋窝的深部，每个位置放置2～3 块肿瘤组织，注意不同组间统一放置肿瘤组织块数以保持一致。

白细胞疾病动物模型制作步骤及方法

白细胞疾病动物模型制作步骤及方法在医学研究中，为了更好地理解和治疗白细胞疾病，制作合适的动物模型是至关重要的。

这些模型能够帮助科研人员深入探究疾病的发病机制、发展过程以及测试新的治疗方法。

下面将详细介绍白细胞疾病动物模型的制作步骤及方法。

一、模型选择首先，需要根据研究的具体白细胞疾病类型以及实验目的来选择合适的动物模型。

常见的实验动物包括小鼠、大鼠、豚鼠等。

小鼠由于其繁殖快、基因易于操作等优点，在白细胞疾病研究中应用广泛。

二、诱导方法（一）化学诱导化学物质诱导是常见的方法之一。

例如，使用苯、环磷酰胺等化学物质，可以破坏骨髓造血微环境，影响白细胞的生成和发育，从而诱导白细胞疾病的发生。

（二）放射线诱导通过对动物进行一定剂量的放射线照射，损伤骨髓造血干细胞，导致白细胞异常。

这种方法可以模拟由于放射性损伤引起的白细胞疾病。

（三）病毒感染诱导某些病毒，如人类 T 淋巴细胞病毒 1 型（HTLV-1）、EB 病毒等，与特定的白细胞疾病密切相关。

将这些病毒感染动物，有可能诱导出相应的疾病模型。

（四）基因工程诱导利用基因编辑技术，如 CRISPRCas9 系统，对动物的基因组进行特定的修饰，敲除或插入与白细胞相关的基因，从而构建出遗传性白细胞疾病模型。

三、实验动物的准备（一）动物的选择选择健康、遗传背景清晰、年龄和体重适宜的动物。

一般来说，年轻的动物对诱导因素的反应更敏感，但也需要考虑实验周期和动物的成熟程度对实验结果的影响。

（二）动物的饲养环境提供清洁、安静、温度和湿度适宜的饲养环境，保证动物的正常生长和健康状态。

遵循动物伦理和福利原则，给予充足的食物和水。

四、诱导操作（一）化学诱导操作以环磷酰胺诱导为例，根据动物的体重计算合适的给药剂量，通过腹腔注射或静脉注射的方式给药。

给药过程中要严格控制药物浓度和注射速度，避免药物外渗和动物的过激反应。

（二）放射线诱导操作使用专门的放射线设备，对动物进行全身或局部照射。

肿瘤动物模型

三.移植性肿瘤动物模型及其研究方法
定义：模型是指将动物或人体肿瘤移植到同种或异种动物体内连续传代而形成移植
性肿瘤动物的肿瘤
实验动物选择：移植性肿瘤常用动物为小鼠、大鼠和地鼠
肿瘤细胞的选择：筛选抗癌药物时，最好选用
3类瘤株，及肉瘤、腹水型肿瘤和白血病株。在众多移植性肿瘤中，小鼠Lewis肺癌、小鼠黑色素瘤B16 及小鼠白血病P388是目前最受重视和应用最广的。
操作方法（例：人胃腺癌SGC-7901)：
1.超净台内将移植瘤剪成2~3mm3大小的瘤块，用套管针接种在BALB/c裸小鼠右侧腋窝皮下 2.接种24h后随机分组，开始给予受试药进行实验治疗，试验周期6周左右 3.停药次日，称体重，剥取肿瘤并称重，计算瘤重抑制率。
观察指标与疗效评价：
1.动物在接种肿瘤后6周左右形成1g以上的瘤块（平均瘤重），则表明移植肿瘤成功
结果：一般情况下，接种3~5d形成肿瘤，移植成功率可达85%，移植成功后可
用以观察受试药的疗效
Thanks !
谢谢
瘤细胞悬液接种法
每次接种的动物数量较多时可采用此法。具体方法是：无菌操作取出瘤块，将数个瘤块混合后剪成小块，放入玻璃匀浆器中，加无菌生理盐水向一个方向转动研磨后，经滤网过滤，加生理盐水稀释成1:3~1:4 （肿瘤g：生理盐水ml）的瘤细胞悬液，用台盼兰染色法计数活细胞数，用1ml注射器注射到接种部位，每个接种点接种0.2ml(一般含 1×106~1×107个细胞数）。通常接种到腋窝皮下，每只动物可选用多个接种点。
诱发性肿瘤动物模型建立方法
物理方法：放射性物质致瘤，用放射线照射或局部注射放射性同位素。化学方法：使用化学致癌物，如苯并芘（benzpy rene）、甲基胆蒽

肿瘤动物模型建立实验

肿瘤动物模型建立实验标签：肿瘤动物模型肿瘤动物模型的建立可以：（1）评价抗肿瘤免疫治疗的疗效；（2）作为抗肿瘤药物筛选模型；（3）为肿瘤转移研究提供更好的研究平台；（4）为研发抗肿瘤转移性药物提供良好的实验工具。

实验方法诱发性肿瘤动物模型实验方法原理诱发性肿瘤动物模型是指研究者用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤等。

实验材料肿瘤细胞小鼠试剂、试剂盒无血清培养基质3%中性甲醇石腊仪器、耗材低温离心机血球计数器游标卡尺实验步骤一、肝癌1．二乙基亚硝胺（DEN）诱发大白鼠肝癌（1）取体重250 g左右的封闭群大白鼠，雌雄不拘；（2）按性别分笼饲养。

除给普通食物外，饲以致癌物，即用0.25%DEN水溶液灌胃，剂量为10 mg/kg，每周一次，其余5天用0.025%DEN水溶液放入水瓶中，任其自由饮用；（3）共约4个月可诱发成肝癌；（4）也可以单用0.005%掺入饮水中口吸服8个月诱发肝癌。

2．4-2甲基氨基氮苯（DBA）诱发大鼠肝癌（1）用含0.06%DBA的饲料喂养大鼠，饲料中维生素B2 不应超过1.5～2 mg/kg；（2）4～6月就有大量的肝癌诱发成功。

3．2-乙酰氨基酸（2AAF）诱发小鼠、狗、猫、鸡、兔肝癌（1）给成年大鼠含0.03% 2AAF标准饲料；（2）每日每平均2～3 mg 2AAF（也可将2AAF混于油中灌喂），3～4月后有80～90%动物产生肝肿瘤。

4．二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌：（1）用剂量为每日0.3～14 mg/kg体重，混于饲料或饮水中给予；（2）6～9个月后255/300大鼠发生了肝癌。

5．亚胺基偶氮甲苯（OAA T）诱发小鼠肝癌（1）用1%OAAF苯溶液（约0.1 ml含1 mg）涂在动物的两肩胛间皮肤上，隔日一次，每次2～3滴，一般涂100次。

（2）实验后7～8周即而出现第一个肝肿瘤，7个月以上可诱发小鼠肝肿瘤约55%。

（3）或用2.5 mg OAA T溶于葵瓜子油中，给C3H小鼠皮下注射4次，每日间隔10天，也可诱发成肝癌。

肿瘤动物模型的构建——白血病篇

移植后第二天对小鼠分组பைடு நூலகம்进行给药；统计小鼠生存率。
评价：此种模型易建立，成瘤率高，成瘤时间差异小，是筛选抗肿瘤药物常用的动物模型。
数据分析：小鼠经X射线照射后尾静脉注射2×105个hMRP8-PML-RARα细胞，建立ATRA耐药移植型小鼠模型[3]。如下图：
图A统计生存曲线，给药组（LG362B和阳性药ATRA）均可延长小鼠生存期。
第二章：实验研究所用白血病模型首先，来了解一下常用的细胞株白血病中常用的小鼠品系
用于建立白血病小鼠模型的小鼠可分为近交系和突变系。根据不同类型和目的选择不同的小鼠品系，具体如下图所示：
最后说说常用的动物模型，主要分为三类：
一、异种移植模型
异种移植模型是最常用的淋巴瘤动物模型。根据实验目的选择相应的小鼠品系和细胞株后，通常细胞的接种方式为皮下注射、腹腔注射和尾静脉注射。
肿瘤动物模型的构建——白血病篇
导读白血病（Leukemia）是一种常见的恶性血液疾病，俗称血癌。据统计，白血病是儿童恶性肿瘤的头号原因，在儿童及35岁以下成人中发病率位居第一[1]。同时也是十大恶性肿瘤之一。目前，白血病具体的发病原因至今尚未研究透彻，因此建立合适的白血病动物模型，对于白血病发病机制及药物研发具有重要意义。
图C与D剥离小鼠脾脏拍照并称重，患白血病小鼠较正常小鼠脾脏肿大，给药组（LG362B和阳性药ATRA）均可使脾脏恢复正常。
图e：取小鼠外周血和骨髓细胞制作涂片进行Wright-Giemsa染色，从形态学上可观察到给药组（LG362B和阳性药ATRA）可诱导白血病细胞分化。
二、基因修饰型白血病模型
基因修饰型白血病模型主要为利用基因编辑技术进行敲除或插入特定基因，从而诱发动物产生白血病。如骨髓增生异常综合征（MDS）转化为急性髓系白血病是由于NRAS和BCL-2在形成复合物，建立骨髓增生异常综合征转化AML小鼠模型MRP8[NRASD12/hBCL-2]筛选出BCL-2抑制剂ABT-737[4]。下图为主要的基因工程型白血病模型[5]：评价：基因修饰型动物模型成瘤机制清楚、病理表现明确，常用于白血病发病机制的研究。但需构建基因工程载体，胚胎培养、显微注射等一系列工作，周期长，花费大，一般根据实验需求构建适合的动物模型。

肿瘤动物模型的构建——淋巴瘤篇

肿瘤动物模型的构建——淋巴瘤篇导语淋巴瘤（Lymphoma）是一种原发于淋巴结和淋巴组织的恶性肿瘤。

近年来其发病率正以每年4%的速度上升。

初期往往仅因表现为持续发烧或淋巴结肿大，而被大家忽视。

加上淋巴瘤亚型（＞80种）众多，治疗困难重重。

因此迫切需要建立正确的动物模型，这对于研究淋巴瘤的发病机制和治疗手段十分重要。

淋巴瘤为全身性肿瘤？淋巴系统像血液系统一样遍布全身，所以淋巴瘤几乎可以发生在身体的任何部位。

如果淋巴瘤细胞浸润进血液，则发展成淋巴细胞白血病(lymphoma cell leukemia，LCL)，变成液体瘤，成为全身性肿瘤。

如下图：人体淋巴组织分布和淋巴瘤后期转移示意图（图片来自Zevalin网站）。

淋巴瘤分类众多淋巴瘤种类繁多，发病机制复杂，分为霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）两类，其中以生发中心（Germinal center）来源的淋巴瘤占到NHL的80%，包括伯基特淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤和弥漫大B淋巴瘤。

其发病机制是B细胞经历生发中心不同阶段时，基因发生突变易位等。

生发中心来源淋巴瘤发病机制示意图[1]临床上根据淋巴瘤分类分为多种细胞株，下面列举一些常用淋巴瘤细胞株：下面说说常见的淋巴瘤动物模型有哪些一、异种移植型淋巴瘤模型淋巴瘤细胞株或病人淋巴瘤组织种植于免疫缺陷动物体内，建立移植性淋巴瘤模型，是目前研究最多的肿瘤模型。

一般选择免疫缺陷小鼠：SCID小鼠或NOD/SCID小鼠淋巴瘤动物模型常选用SCID小鼠，它是一种先天性T/B淋巴细胞联合免疫缺陷动物，移植成功率比较高。

但SCID小鼠仍残留某些免疫功能，而NOD/SCID小鼠较SCID小鼠出现更多的免疫缺陷，它又降低了NK细胞的活性，成为淋巴瘤实验研究的有效工具。

异种移植进一步又分为细胞移植（CDTX）和组织块移植（PDTX）操作步骤如下图所示[2]：A（CDTX）和B（PDTX）注意：（1）细胞移植法：常用皮下荷瘤，也用腹腔注射，静脉注射和原位荷瘤。

小鼠肿瘤模型

肿瘤模型我们一般常用的就是小鼠模型和人肿瘤裸小鼠移植瘤模型。

其中用得最多的是皮下模型，另外还有腹水（或者尾静脉注射）以及原位模型，其他的模型很少用，就不提他们了。

小鼠模型分三大类：第一类是以S180、EAC、H22等为代表的，他们的宿主小鼠多选用KM，可产生腹水，也可在皮下成瘤。

多以腹水传代，实验时抽取腹水，经过一定稀释后皮下接种构建模型，接踵后第二天开始给药，给药7到10天，接种10天后结束试验，剥取肿瘤称瘤重。

1. 关于构建瘤种可以用体外细胞株培养后，用PBS悬浮至1~3×106/0.1ml/mouse，i.p接种即可，最好用6号左右的针头，就是常用的2ml一次性注射的针头。

2. 关于腹水传代观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约8~9天左右），可以传代，传代时取1ml注射器，用2ml 注射器的针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点，还可以把老鼠拎起来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，一般抽个0.5ml就可以了，不用离心，直接用PBS3~6倍稀释后，接种到新的老鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的，但是血性腹水说明不好，需要注意调整，第二代以后，尽量6~7天的时候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易血性。

三代后可用于试验。

3. 关于接种进行试验这个时候抽取的腹水需要量比较多，一般需要处死种鼠后，小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子（最好是哪种前面有倒勾的镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开一个小口，然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。

然后进过一定的稀释后，接种到小鼠的腋下。

关于稀释量，各个实验室的情况都不一样，最好摸索一下，开始的时候可以适当的计数，但是要用台盼兰染色后计活细胞数。

接种部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋窝里面，会给以后的操作带来麻烦。

接种时的进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容易污染。

急性早幼粒白血病HL-60细胞动物模型的构建与鉴定

急性早幼粒白血病HL-60细胞动物模型的构建与鉴定重度联合免疫缺陷(SCID) 小鼠是美国Bosma证实的属CB - 17 近交系小鼠第16 号常染色体发生隐性突变基因(SCID) 的突变型小鼠1 [赛业可提供重度联合免疫缺陷]。

纯合的SCID 鼠基因导致小鼠几乎完全丧失T 和B 淋巴细胞的功能, 人们便将这类小鼠广泛用于免疫学、肿瘤学的研究。

急性早幼粒细胞白血病(APL) 在诱导分化剂全反式维甲酸作用下可向正常粒系分化,临床上用全反式维甲酸(ATRA) 治疗APL 虽能引起完全缓解,但APL 的发病机制仍不太清楚,因此,建立一个稳定的动物模型用来研究APL 诱导分化的机制有重要的意义。

1 材料与方法1. 1 材料1. 1. 1 人白血病细胞系人急性早幼粒白血病HL - 60 细胞株从中南大学肿瘤研究所引进,用含10 %小牛血清(杭州四季青) 的RPMI - 1640 培养基(Gibco 公司产品) ,5 %CO2 ,37 ℃培养。

1. 1. 2 SCID 小鼠16 只,雄性,3～4 周龄(购于上海中国科学院实验动物中心) ,小鼠在层流架内带盖鼠盒中饲养(符合SPF 标准) 。

室内空气经中效过滤, 饮用水为加少量食盐的灭菌双蒸水, 标准颗粒饲料加维生素C、鸡蛋, 垫料及一切与鼠接触物品均灭菌处理。

分为两组,每组8 只,每只分别腹腔或静脉直接接种5 ×106 个细胞。

1. 2 方法1. 2. 1 移植SCID 小鼠移植前未作任何处理,取对数生长期HL - 60 细胞用于移植, 每只鼠以尾静脉注射或腹腔接种5 ×106 个细胞。

1. 2. 2 外周血白细胞计数及分类接种前和接种1、2、3、4 周或病程后期, 分别取尾静脉血检测。

1. 2. 3 形态学观察取外周血,吉姆萨染色,油镜下观察细胞形态,每片计数200 个细胞,按早幼粒、中幼粒、晚幼粒、杆状核及分叶核细胞分类计数,计算早幼粒细胞的比例。

白血病小鼠模型的建立及鉴定

白血病小鼠模型的建立及鉴定pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒上清感染6～10周龄C57BL/6供者小鼠的骨髓细胞，移植给致死量射线照射的同种同型受者小鼠，建立BCＲ-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型;监测移植小鼠的体质量，生存率;流式细胞仪检测小鼠外周血有核细胞GFP表达(代表有核细胞表达BCＲ/ABL1)和细胞分型;观察小鼠脾脏、肺脏和肝脏等器官大体形态和HE染色变化．结果：移植20d后，移植小鼠表现弓背、活动性减少、精神萎靡的状态，体质量明显降低;流式细胞仪检测外周血中出现GFP+细胞，并且随着移植时间的延长，GFP+粒细胞明显增多．移植小鼠的生存率较对照组明显降低．移植小鼠发病后表现脾脏显著增大、肺出血、肺脏及肝脏出现白色结节和HE染色表现大量细胞浸润，且小鼠脾脏中有核细胞的80%为GFP+Gr-1+细胞，即BCＲ-ABL1+粒细胞白血病细胞．结论：利用此方法成功建立了BCＲ-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型，为研究慢性粒细胞白血病机制和治疗提供了平台．【关键词】BCＲ-ABL1+粒细胞白血病;BCＲ-ABL1;小鼠;生存率;逆转录病毒载体0引言慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)是一种以粒细胞失去分化水平，过度增殖为特征的骨髓增生性疾病，是一种伴有t(9;22)(q34;q11)染色体易位的恶性增生性疾病［1］．该易位染色体由位于9号染色体的原癌基因ABL1部分序列从其正常位置易位至22号染色体的BCＲ区(breakpointclusterregion，BCＲ)形成［2］，其编码的蛋白具有高度异常酪氨酸激酶活性，造成了CML细胞对酪氨酸激酶抑制剂的抵抗［3］．所以，研究CML的发病机制和治疗药物显得尤为重要，而一个良好的实验平台是研究机制和药理的基础．研究［4－5］发现，虽然我们能够利用将CML患者的白血病细胞移植给NOD/SCID小鼠构建的小鼠模型来研究白血病细胞是否导致并维持了CML，但是这种模型不能造成致死性CML且耗时较长;而BCＲ-ABL转基因小鼠模型因为不能完全发展成为髓系增生性疾病且具有潜伏期长的局限性，不利于治疗药物的研究［4－5］．逆转录病毒感染骨髓细胞的移植模型则是一种稳定高效的诱导方式［6］，能够为研究CML的发病机制和治疗药物提供协助．本研究在逆转录病毒感染骨髓细胞移植模型的基础上建立了更加省时、高效且易于监测病程和鉴定疾病类型的方式，成功建立了容易监测及鉴定的BCＲ-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型，为CML的机制和药物研究提供了一个良好的平台．1资料和方法1．1材料1．1．1载体和试剂pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP、pkat-ampac逆转录病毒包装载体由本实验室保存．5-Fluorouracil(5-Fu，Cat#6627)、HEPES和polybrene来自Sigma．抗小鼠Gr-1-APC(Cat#553129)流式抗体来自BD．SCF、IL-3、IL-6来自Peprotech．1．1．2实验动物6～10周龄的C57BL/6小鼠购买并饲养于西安交通大学医学部SPF级动物房．1．2方法1．2．1pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒的制备用293T细胞培养基(DMEM培养液含有10%FBS、1%青链霉素，200mM谷氨酸和1%MEMnon-essential氨基酸)将293T细胞于10cm培养皿培养至密度为80%时，利用pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒载体转染293T细胞，48h后收集pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒上清液立即使用或储存－80．1．2．2采集和体外培养供者小鼠骨髓细胞要求供者和受者小鼠属于同一品系．通常情况下，10只供者小鼠可提供2～3107骨髓细胞．第1天，取6～10周龄SPF级C57BL/6小鼠20只，尾静脉注射0．6mL5-Fu/只，按200mg/kg计算．第4天时，处死小鼠获取4～6107骨髓细胞，将供者骨髓细胞分为两等分，即实验组和对照组，用48mL骨髓细胞刺激培养基(含有77%DMEM，20%FBS，1%青链霉素，200mM谷氨酸，18ng/mL小鼠重组IL-3，20ng/mL小鼠重组IL-6以及100ng/mL小鼠重组SCF)分别悬于两个六孔板中，在CO2培养箱内培养24h．1．2．3pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒感染供者小鼠骨髓细胞第5天，向实验组的六孔板加入pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒第一次转染骨髓细胞培养基(含有50%pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒上清，18ng/mL小鼠重组IL-3，20ng/mL小鼠重组IL-6，100ng/mL小鼠重组SCF，1%HEPES和20μg/mLpolybrene)，每孔2mL，对照组的六孔板加入骨髓细胞刺激培养基，每孔2mL，轻柔混匀后，室温2300rpm离心90min，继续在CO2培养箱中培养3～4h．室温下1500rpm离心10min，丢弃上清液，各加入24mL骨髓细胞刺激培养基，过夜培养．第6天，向实验组的六孔板加入pMSCV-BCＲ/ABL1-I ＲES-GFP逆转录病毒第二次转染骨髓细胞培养基(含有50%pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒上清，18ng/mL小鼠重组IL-3，20ng/mL 小鼠重组IL-6，100ng/mL小鼠重组SCF，1%HEPES和20μg/mLpolybrene)，每孔2mL，悬浮第一次转染后的骨髓细胞，向对照组的六孔板加入骨髓细胞刺激培养基，每孔2mL，轻柔混匀后，室温2300rpm离心90min，CO2培养箱培养3h．最后用Hank's缓冲液悬浮两组骨髓细胞，准备注射受者小鼠．1．2．4致死量射线照射受者小鼠并实行骨髓移植第6天，采用医用电子直线加速器(英国Eiekta)照射6～10周龄SPF级的C57BL/6小鼠12只，辐射剂量920cGy．将上述pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒感染后的供者小鼠骨髓细胞，尾静脉注射给6只受照射后的受者小鼠作为实验组，同样，将未使用逆转录病毒感染后的供者小鼠骨髓细胞，尾静脉注射给6只受照射后的受者小鼠作为对照组，细胞用量为1106/0．4mL/只．SPF级动物房饲养移植后小鼠．每隔一天观察小鼠存活情况、称取体质量;每周采用流式细胞仪检测受者小鼠外周血GFP阳性细胞数量，即代表表达BCＲ-ABL1的细胞．大约15～20d可建立BCＲ-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型．1．2．5BCＲ-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型的鉴定1．2．5．1移植小鼠体质量和生存率监测每隔一天称取并记录实验组小鼠和对照组小鼠的体质量，计算实验组小鼠和对照组小鼠的生存率．1．2．5．2流式细胞仪检测每周取移植受者小鼠内眦血于抗凝剂中，经红细胞裂解液裂解8min去掉红细胞后，1PBS洗2次，检测外周血有核细胞中GFP+白血病细胞的百分比并计数．将濒死的移植受者小鼠处死后观察小鼠脾脏，尽快收集病鼠的骨髓细胞及脾脏细胞，经红细胞裂解液裂解5min去掉红细胞后，1PBS洗2次，利用抗小鼠Gr-1抗体对移植受者小鼠的骨髓和脾脏细胞避光孵育20min，1PBS洗2次，1PBS悬起后流式细胞仪检测实行免疫分型．以Gr-1+GFP+表示粒细胞白血病细胞．1．2．5．3移植受者小鼠肺脏和肝脏HE染色将濒死的移植受者小鼠处死后观察小鼠肺脏和肝脏，将肺脏和肝脏组织标本经石蜡包埋，切片和HE染色后，显微镜下观察白血病细胞的浸润情况．2结果2．1移植小鼠体质量和生存率变化将pMSCV-BCＲ/ABL1-IＲES-GFP逆转录病毒感染后的C57BL/6供者小鼠骨髓细胞，尾静脉注射给受照射后的C57BL/6受者小鼠作为实验组，以接受同样剂量照射并移植未感染病毒的供者骨髓细胞的C57BL/6受者小鼠作为对照组，每隔一天称取体质量，监测小鼠体质量变化．因为致死量照射，移植后的C57BL/6小鼠体质量表现照射性降低，随后在一周之内恢复体质量并且持续平稳，在移植后3周时，实验组小鼠体质量连续降低，而对照组小鼠体质量保持平稳(图1A)，C57BL/6实验组小鼠与C57BL/6对照组小鼠的体质量变化比较，差异具有统计学意义(P＜0．05)．2．2移植小鼠外周血白血病细胞监测情况C57BL/6受者小鼠接受供者的小鼠骨髓细胞后，每周取移植受者小鼠内眦血，监测受者小鼠外周血中GFP+白血病细胞的水平．通过流式细胞仪检测后发现，C57BL/6实验组小鼠7d后外周血中即出现GFP+细胞(图2A)，并且随着移植时间推移，GFP+粒细胞明显增多(图2B)．至白血病细胞占外周血有核细胞80%时，小鼠迅速死亡．C57BL/6对照组小鼠外周血中始终未出现GFP+细胞．2．3移植小鼠粒细胞白血病建模成功骨髓移植20d左右时，实验组小鼠表现弓背、活动性减少、精神萎靡、进食减少的状态(图3A)．当实验组小鼠体质量连续减轻且外周血白血病细胞持续增高时，处死实验组小鼠和对照组小鼠，观察肺脏、脾脏及肝脏，发现实验组小鼠脾脏较对照组体积增大显著，且出现肉眼可见大小不一数个白色突起(图3B)，实验组小鼠肺脏表现出血、粗糙且布满白色点状结节(图3C)，肝脏布满白色结节(图3D)．将肺脏和肝脏实行HE染色，观察到实验组小鼠肺脏和肝脏有大量白细胞浸润(图3E、3F)．将脾脏实行HE染色，同样观察到实验组小鼠脾脏有大量白血病细胞浸润(图3G)，收集实验组小鼠的骨髓细胞及脾脏细胞，通过流式细胞仪检测发现脾脏中主要为大细胞(图3H)，且脾脏中GFP+细胞占有核细胞的90%(图3I)，利用抗小鼠Gr-1抗体对实验组小鼠的骨髓和脾脏细胞实行免疫分型(以Gr-1+GFP+表示粒细胞白血病细胞)，通过流式细胞仪检测发现脾脏中有核细胞的80%为GFP+Gr-1+细胞，进一步证实是BCＲ-ABL1+粒细胞白血病.3讨论CML是一种因为粒细胞大量增生却失去分化水平的髓系增生性疾病，来源于造血干细胞并且因为含有致癌基因BCＲ-ABL而获得增殖快速于正常造血干细胞的优势［7－8］，因为致癌基因产生的蛋白具有高度异常的酪氨酸激酶活性，持续活化其下游信号分子通路，促动了CML细胞的增殖和抗凋亡水平，造成CML细胞的恶性转化［9］．在CML进程中CML-BP(blasticphase)患者对酪氨酸激酶抑制性药物、异体造血干细胞移植、或者联合化疗效果均较差，死亡率极高［10］．此外，相对于CML-CP(chronicphase)期，CML-BP期基因组的复杂性和异质性均更高［11］．虽然酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼对CML 的治疗有革命性的突破，但是BCＲ-ABL1基因的突变产生了伊马替尼的耐药问题［12－13］．所以，研究BCＲ-ABL1+粒细胞白血病的发生、耐药机制以及新的药物对治疗CML至关重要．虽然我们能够利用CML细胞异体移植小鼠模型和BCＲ-ABL转基因小鼠模型来研究CML的发病机制，但是因为这些小鼠模型构建潜伏期较长，均不利于CML治疗药物的研究．本研究利用逆转录病毒感染骨髓细胞的移植模型具有稳定且潜伏期短的优势，在其基础上对照射方式实行了改进，使得照射一次性成功，耗时大大缩短，为实验过程节省了宝贵的时间;此外，本研究还利用流式细胞仪检测外周血有核细胞中GFP+白血病细胞数来监测整个病程周期，能够准确地了解移植受者小鼠的移植成功率和病程进展，为CML治疗药物的研究提供精确的控制窗口，使得便捷地观测到药物的治疗效果成为可能．这种容易监测及鉴定的BCＲ-ABL1+粒细胞白血病小鼠模型，能够为CML的机制和药物研究提供极大的协助．BCＲ-ABL1逆转录病毒感染骨髓细胞移植模型能够诱导出3种疾病：类似于CML的髓系增生性疾病，急性淋巴细胞白血病以及单核细胞性白血病，表明BCＲ-ABL1逆转录病毒感染后的骨髓细胞表现出一种混乱的造血方式［14－15］．5-Fu为细胞周期特异性化疗药物，主要杀伤分裂期细胞，从而富集髓系多能干细胞，所以，本研究利用5-Fu处理供者小鼠的骨髓细胞，能够提升骨髓中髓系多能干细胞的百分比，使转染效率极大提升，然后使用粒系干细胞所需的细胞因子培养供者骨髓细胞，能够导致髓系干细胞向粒系发展，最终发展为CML小鼠模型［16］．本研究利用细胞因子体外培养5-Fu处理后小鼠供者骨髓细胞，再利用BCＲ-ABL1-GFP逆转录病毒感染供者的骨髓细胞，并移植给致死量照射后的同种系受者小鼠，通过监测受者小鼠的体质量、生存率、流式细胞仪检测受者小鼠外周血有核细胞表达GFP的情况来判定小鼠的病程进展，简单且高效，此外，利用抗小鼠Gr-1抗体对发病后的受者小鼠的骨髓和脾脏细胞实行免疫分型，进一步证实了BCＲ-ABL1+粒细胞白血病的小鼠模型建立成功，利用流式检测技术能够高效地监测整个建模过程，且容易判定模型类别．此外，通过观察受者小鼠脾脏和肺脏等器官，我们发现白血病细胞于肺脏和肝脏均有浸润，这显示我们的模型起源于骨髓造血干细胞且具有多器官浸润的水平，这与人的CML较为相似，能够作为较理想的CML小鼠模型，为CML治疗药物的研究提供易观测、易控制的平台，为白血病的治疗提供较大的协助．白血病小鼠模型的建立及鉴定。

白细胞疾病动物模型制作步骤及方法

白细胞疾病动物模型制作步骤及方法1白细胞减少症动物模型(Animal model of leucopenia)在研究化疗药物毒性的减毒实验中，经常需要建立化疗所致的白细胞减少症及骨髓有核细胞减少症的动物模型。

白细胞减少症(leucopenia)为临床常见血液病。

凡机体外周血液中白细胞数持续低于4×1000000000/L时，称之为白细胞减少症；若机体白细胞总数明显减少，低于2×1000000000/L，中性粒细胞值低于0.5×1000000000/L甚至消失者，则称为粒细胞缺乏症(agranulocysis)。

临床上白细胞减少症患者的临床表现主要为乏力、头晕，并常伴有食欲减退、四肢酸软、失眠多梦、低热心悸、畏寒腰酸等症状；而粒细胞缺乏症则多以突然发病、畏寒高热、咽痛为主。

粒细胞缺乏症为白细胞减少症发展至严重阶段的表现，两者病因和发病机制基本相同。

临床上白细胞减少症主要可分为原因不明性和继发性两种。

其中又以前者多见，而后者则多为化学因素、物理因素、药物因素及某些疾病；或可见于各种实体肿瘤化疗后、多种血液疾病、严重感染及原因不明者等。

1.1大鼠白细胞减少症模型(1)复制方法体重约为150g的SD大鼠，按30mg/kg体重的剂量经其腹腔注射环磷酰胺，连续注射5d。

模型大鼠在给药前、给药第3, 5日，以及停药后第2, 5, 8, 11, 15日时分别采血作外周血象检测，观察外周血白细胞总数。

后1次检测观察后麻醉处死动物，取其股骨，用hanks液冲洗骨髓细胞，显微镜下观察骨髓有核细胞数。

(2)模型特点注射环磷酰胺后，模型大鼠的食耗量、饮水量减少，活动减少，被毛疏松无光泽，体重增长趋缓，明显消瘦；停药15d后机体开始明显恢复。

给药3d时，模型大鼠的外周血白细胞总数明显降低，给药5d时其外周血白细胞总数可降至低值；停药后第2日时白细胞总数无明显回升，停药第5, 8, 11, 15日时，白细胞总数呈逐渐回升趋势；模型大鼠低白细胞水平维持时间较长，至停药后第15日时仍未见明显回升。