各类神经元细胞的培养方法
神经元细胞培养
神经元细胞培养1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks’平衡盐液中。
2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。
3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。
4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。
重复上述步骤2～3 次。
5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。
6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打成单细胞悬液。
7. 细胞计数，调整细胞密度按（700000个）1.5×105/cm2 种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。
(1)把细胞悬液用(DMEM＋20%FBS)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成2% B27的neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。
（+0.5mmol/L谷氨酰胺）鉴定1.形态学的观察，在DIC下可以很清楚的看到神经元特有的形态，轴突树突以及胞体非常明显。
2.免疫学鉴定：正如楼上几位所说，NF（神经丝）或者tubulin 或者MAP2等都是目前鉴定神经元的Marker,不论你好似免疫荧光还还是免疫组化，阳性表达即可！3.在进一步你可一做mRNA水平的实验，也就是RT-PCR了。
这就更能支持2的阳性表达了。
4.电生理学的鉴定：测定神经元特有的电生理学也是证据之一啊！从以上几个方面去做，应该能证明是神经元了！错误之处还请赐教！TUJ1。
neurobasal 神经细胞培养步骤
neurobasal 神经细胞培养步骤
神经细胞培养使用的神经基底培养基（Neurobasal）通常包括
以下步骤：
1. 准备培养器具：将所需的培养器皿（如细胞培养皿、培养瓶等）进行灭菌处理，确保无细菌或其他污染物。
2. 制备培养基：根据厂家提供的说明书，将神经基底培养基配制好。
通常需要将粉末溶解于培养基补充剂（如B27或N2）中，并加入适量的血清等。
3. 细胞分离：将神经组织（如海马、皮质等）分离并收集。
可以使用酶（如胰酶、纤溶酶等）或机械切割方法（如切割刀或离心式分离）。
4. 细胞孵化：将分离的细胞在预先灭菌的培养器皿中分散均匀，加入预先配制好的培养基。
5. 营养物质补充：在培养基中加入适量的营养物质，如氨基酸、维生素等，以促进细胞生长和分化。
6. 培养条件调节：将培养器皿放入恒温培养箱中，并保持适宜的温度（通常为37°C）和湿度，同时提供适量的CO2（通常
为5-10%）。
7. 细胞观察和维护：每天观察细胞的生长情况，检查细胞形态和健康状况。
适量更换培养基，以保持培养环境的稳定。
需要注意的是，具体的步骤可能会因实验设计的不同而有所差异，因此最好参考实验操作手册或厂家提供的指导。
此外，神经细胞培养也需要一定的专业知识和操作经验，对于初学者来说可能需要辅导或指导。
神经元细胞培养步骤
海马神经元细胞培养一、实验前准备1.手术器械、培养皿、筛网的消毒2.多聚赖氨酸的配制3.培养板处理：（培养板中可加入小的圆形玻片，多次使用）(1)用多聚赖氨酸室温包被5min，随后吸取多余液体，晾干。
(2)用PBS洗一遍，吸取PBS后晾干备用。
4.胰酶的配制5.PBS的配制二、操作步骤1. 新生一天的小鼠，酒精喷洒全身，置于干净的培养皿中，用手术剪刀剪下头部，放入另外一个干净的培养皿中（五只）。
2.用干净镊子取出全脑放于（冰）的PBS的培养皿（10cm）中，置于解剖显微镜下。
3.移入解剖显微镜下，分离出皮层或海马组织，去除血点，移入盛有HOOD下的培养皿中。
4.将皮层或海马组织剪成1-3mm的小块，用0.25%，2ml胰酶-EDTA 消化，37ºC水浴消化30分钟，每消化10分钟振摇一下。
30分钟后，用移液枪吸取可见组织，放入离心管中，并加入与胰酶等体积的DMEM （HG）+10% FBS培养液终止消化，吹打20次左右，注意动作轻柔，不要吹打出气泡。
5.如果组织明显不能吹散或粘稠的话，过一下200目筛网。
过滤液DMEM，进入大离心管中。
离心800r，3min。
弃去上清，加入DMEM 培养液，分装在培养皿（6cm）中，放入含5% CO2 的37C恒温培养箱内培养。
6.6-8小时（或第二天）后换液，用PBS液先洗两遍，并上下左右摇晃10次左右，去除一些细胞碎片，随后培养液换成Neurobasal 培养液+B27（2%）+谷氨酰胺（0.5mM）（+双抗)继续培养，并且3天半换液一次。
7.到第八天时，将培养液换成新鲜Neurobasal无B27、谷氨酰胺、双抗，开始用于实验。
神经元细胞培养步骤
神经元细胞培养
灭菌准备：
1、将玻璃培养皿（3个）、滤器（清洗、换滤片、锡纸包裹）放入盒中、将盒拿到桶中灭菌
2、将显微镜搬至超净台灭菌
3、将直头镊（1个）、弯头镊（1个）放入盛有酒精的小烧杯，放入超净台
材料准备：17天孕鼠、冰块、75%酒精、50mL离心管、PBS、胰酶、培养基、双抗、注射器、灭菌的显微镜、灭菌的玻璃培养皿（3个）、10cm培养皿（1个）、计数器、包被好的培养板
1、处死孕鼠，取小鼠，放入50mL离心管（冰块上），移至超净台，
2、将小鼠倒入盛有PBS的玻璃培养皿中，关灯，开显微镜
3、将头取出（左手直头镊，右手弯头镊），放入盛有PBS的玻璃培养皿中
4、夹取皮层（皮质及髓质），放入盛有PBS培养皿中，移去显微镜
5、将PBS倒入50mL离心管
6、用枪弃去PBS，再以PBS洗3次，晃匀
7、弃去PBS，加入5mL胰酶，放于37℃细胞培养箱内5分钟
8、弃去胰酶，以PBS洗2次，吸掉
9、加入5mL PBS,对着底面吹打成悬液
10、吸至50mL离心管中，
11、灭菌后的滤器置于15mL离心管，用注射器将细胞加入，抽空气再吹数次
12、离心，25℃，1500rpm，5分钟
13、配制培养液，混匀
14、弃上清，将离心管中加入5mL培养液，吹打成悬液
15、再加入5mL培养液，再次吹打
16、加1滴加至计数器中央，显微镜下观察，
17、20—50个/每16小格，即20—50 ×104 = 2—5×105，若密度加大，则加入培养液稀释
18、加100uL至96孔板中（四边不用），晃匀，
19、放37℃细胞培养箱。
各类神经元细胞的培养方法
各类神经元细胞的培养方法神经元细胞是神经系统中的主要细胞类型之一，负责传递神经信息和调控神经功能。
神经元细胞的培养是神经科学研究和临床治疗的重要工具。
通过细胞培养，可以研究神经元的发育、功能和病理机制，同时也可以应用于药物筛选、组织工程和神经修复等领域。
下面将介绍一些常用的神经元细胞培养方法。
1.原代培养2.细胞系培养细胞系是已经建立起来的可持续增殖和培养的细胞株。
细胞系培养可以使用血清或无血清培养基。
通常，将细胞系继代传代，以保持其细胞特性和增殖能力。
细胞系培养可以持续扩大细胞数量，并用于大规模试验和应用，如药物筛选和基因表达研究等。
3.单细胞培养单细胞培养是将单个神经元细胞分离和培养。
首先，通过机械或酶消化方法将神经组织分散为单细胞悬浮液。
然后，通过单细胞分选技术，将单个神经元细胞分离并分配到各个培养孔中。
最后，单个细胞通过培养基提供的营养物和因子进行生长和分化。
单细胞培养是研究神经元个体特性、细胞发育和功能的重要手段。
4.同代培养同代培养是将同一类型的神经元细胞培养在同一培养物中，以形成功能连通的细胞群。
同代培养可以通过多孔膜培养皿、微流控芯片和三维支架等技术实现。
通过细胞之间的相互作用和联结，同代培养可以模拟神经系统的复杂性和功能，用于研究神经网络特性和神经系统发育。
5.共培养共培养是将不同类型的细胞培养在同一文化器皿中，以研究细胞之间的相互作用和信号传递。
常见的共培养方法包括胶质细胞和神经元细胞的共培养，以及神经元细胞和非神经元细胞的共培养。
共培养可以提供更接近体内情况的环境，用于研究细胞间相互作用和细胞发育过程。
成年鼠皮质神经元培养方法
成年鼠皮质神经元培养方法
神经元是大脑中最基本的神经细胞类型，对于神经科学研究具有重要意义。
成年鼠皮质神经元的培养和维持对于研究神经系统疾病、药物筛选和神经再生等方面具有重要意义。
下面将介绍一种常用的成年鼠皮质神经元培养方法。
材料和方法：
1. 成年鼠的大脑组织。
2. 无菌生理盐水。
3. 0.25% 胰蛋白酶。
4. 0.1% DNase I.
5. 神经元培养基。
6. 神经元培养补充剂。
7. 聚-L-赖氨酸涂层的培养皿。
8. 离心管。
9. 离心机。
10. 显微镜。
步骤：
1. 收集成年鼠的大脑组织，并迅速置于无菌生理盐水中。
2. 将大脑组织切成小块，加入0.25% 胰蛋白酶和0.1% DNase
I 消化酶液中，在37°C下消化30分钟。
3. 用离心机离心，去除上清液，将细胞沉淀加入神经元培养基中。
4. 将细胞悬浮液均匀地滴加到聚-L-赖氨酸涂层的培养皿中，培养皿预先用神经元培养基预涂。
5. 将培养皿置于37°C的细胞培养箱中，培养2-3周，每周更
换一次培养基。
6. 使用显微镜观察神经元的形态和生长情况。
通过以上方法，可以成功地培养成年鼠皮质神经元，为神经科学研究提供了重要的实验材料。
这种方法可以应用于研究神经系统疾病的机制、药物的筛选以及神经再生的机制研究等领域，对于推动神经科学的发展具有重要的意义。
人神经元细胞培养
1520Human Neurons人神经元细胞中枢神经系统的组织由两类细胞组成，它们可以广义地分为神经元和神经胶质。
神经元是大脑的解剖、功能及营养上的单元。
尽管神经元在大小和形状上有很大的差异，但它们都具有共同的形态学特征，而且它们是复杂的通信网络中的重要物质。
神经元是动态极化的细胞，并且是神经系统中的主要信号物质。
人类大脑包含1 x 10^11 神经元，而且每个神经元至少可与10000个其它神经元互通信息。
细胞培养说明注意：冷冻保存的细胞非常脆弱。
将小瓶置于37°C水浴，然后尽快移入培养物中，尽量减少操作。
启封1.对于冰冻细胞：如果包装箱里干冰，并且你不想立即培养细胞，将冻存管立即放入液氮中。
如果包装箱中没有干冰，立即融化培养细胞2.对于增殖的细胞：用70%的酒精喷洒培养容器(瓶，板或slide)以消毒。
将细胞放入37°C，5%二氧化碳培养箱中平衡两小时。
细胞平衡好后，更换新鲜培养基。
经过以下步骤后开始培养细胞1.用层粘连蛋白或多聚赖氨酸包被培养容器神经元接种在层粘连蛋白或多聚赖氨酸包被的培养瓶中将促进细胞帖壁和神经突生长(多聚赖氨酸包被：浓度为2 μg/ml 包被培养瓶或培养板1小时，然后用无菌水洗三次)，这一点非常重要。
2.培养基的准备：用70%的酒精为培养基和添加物的外表面消毒，然后放到无菌的地方。
在无菌环境下打开每一个添加物小管并用吸管加入到基本培养基中。
用培养基冲洗每一个小管以保证添加物全部加入基本培养基中。
3.准备培养：为每一支冻存管准备一个T-45培养瓶。
加入适量的培养基(推荐20 ml/T-45 培养瓶)，将培养瓶放入37°C，5%二氧化碳培养箱中至少平衡30分钟。
4.融化细胞：将小瓶入入37°C水浴中，握住并轻轻的旋转小瓶直到完全融化。
将小瓶立刻移出水浴，擦干，用70%的酒精冲洗小瓶，然后放到无菌环境中。
用70%的酒精冲洗小管，擦去多余的酒精。
神经元培养步骤
新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定11 21 1 培养器皿的预处理: 包被D -多聚赖氨酸: 将无菌处理的血盖片放入24孔聚乙烯培养板( Falcon) 或直径为35mm 的塑料培养皿( Falcon) 内, 在培养前24 小时用终浓度为50Lg/ ml 的多聚赖氨酸50Ll/ cm2 包被血盖片及培养皿各孔, 37e 5% CO2 孵箱孵育过夜。
临用前吸弃D- 多聚赖氨酸液, HBSS液清洗2 次即可使用。
1.大鼠大脑皮质神经元的分离及培养2大鼠大脑皮质神经元的形态学观察光学显微镜: 细胞接种后, 每天在倒置相差显微镜下观察神经细胞的生长情况, 拍照记录。
台盼蓝染色计数活细胞取0.1 mL 的体积分数为0.4% 台盼蓝加到0.9mL 细胞悬液中, 充分混匀后立即滴加到血球计数板上并分别计数未染色的细胞数(活细胞) 及染色的细胞数(死细胞)。
用台盼蓝染细胞时, 活细胞拒染, 死细胞可摄取染料。
计算公式: 每mL原液的细胞数= 4个大方格的细胞总数/4 X 104X稀释倍数。
3-1神经元的免疫细胞化学鉴定Dapi + NF3-2大脑皮质神经元纯度的鉴定( Nissl. s 染色)将细胞爬片的小玻片用0. 01 mo l/ L 的PBS 漂洗, 40 g/ L 多聚甲醛固定, 再用10 g/ L 甲苯胺蓝染色, 梯度酒精( 70%、80% 、95% 、100%) 分色, 置倒置相差显微镜下, 随机观察并计数30 个视野( 目镜10 @ , 物镜20 @ , 框面积0. 3 mm2) 内的神经细胞数。
连续观察10 d, 并拍照记录。
神经元比例( % ) = NF阳性细胞数/DAPI(+) 星形胶质细胞比例( % ) = GFAP阳性细胞数/DAPI(+)鉴定②NF 荧光免疫细胞化学染色 : 神经丝( neurofilaments, NF) 蛋白是构成神经轴突和树突的主要结构成分 , 在中枢和外周神经系统的神经元细胞核周、特别是轴突有表达, 也是神经元特异性标志物之一。
原代海马及皮质神经元培养方法
原代海马及皮质神经元培养方法海马和皮质神经元是神经系统的重要组成部分，在研究神经生物学和药物疗效等方面具有重要价值。
为了研究这些神经元的生理特性和功能，我们常常需要从动物体内分离和培养这些神经元。
以下是针对原代海马和皮质神经元的培养方法。
1.实验动物准备：首先，需要准备实验所需的动物。
一般情况下，小鼠是最常用的实验动物。
在实验进行前，需要确保动物符合实验伦理和动物保护要求，并获得相应的实验动物使用许可。
2.动物脑组织的获取：在实验动物处死后，需要尽快取出脑组织。
使用无菌技术将大脑取出，并将其放入生理盐水或培养基中。
3.脑组织的分离和消化：将脑组织放入含有0.02％的溴酚红的磷酸缓冲生理盐水中，用无菌剪刀和镊子将其剪碎成小块。
然后，将组织块放入含有0.25％胰酶的溶液中，在37℃的恒温培养箱中消化2至5分钟。
然后，将溶液过滤并离心，以去除细胞碎片和大块组织。
4.细胞的分离和培养：将离心沉淀涂布在含有25％培养基和10％胎牛血清的培养皿中，然后放入37℃的恒温培养箱中。
培养基的成分可以根据具体需要进行调整。
细胞会附着在培养皿上，并开始生长和繁殖。
在细胞培养过程中，需要定期更换培养基，以提供细胞所需的营养物质。
5.细胞的处理和分选：在培养4至7天后，细胞会形成较为密集的神经元网络。
在这个时候，可以通过处理和分选细胞来提高神经元的纯度。
例如，使用抗体标记法可以针对神经元选择性地杀死胶质细胞。
此外，还可以使用细胞遗传方法，如转染特定基因或使用荧光探针标记细胞。
6.测试和分析：经过特定时间的培养后，可以对原代海马和皮质神经元进行测试和分析。
这些测试和分析可以包括细胞生存率、纯度、形态特征、电生理活性、细胞内信号和细胞功能等方面的内容。
这些测试和分析的方法可以通过显微镜观察、电生理仪器、蛋白质和基因分析等手段进行。
7.特殊处理：有时对于特定的研究需要，还可以对原代海马和皮质神经元进行特殊处理。
例如，可以通过给予特定药物、激素或其他刺激条件，来模拟不同的疾病模型或研究特定功能。
神经元原代培养
神经元原代培养一、准备1. 试剂1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。
选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。
对照瓶内插入1～2支温度计(保证测试温度的准确性)。
将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30分钟。
灭活后分装，10ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20～-70℃保存。
2）D-Hank’s液(g/L)：NaCl: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O: 0.06, NaHCO3: 0.35; 酚红：0.02，超纯水溶解，调节PH至7.2，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。
3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤，200µl或400µl/tube分装, -20度储存。
母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma，P2636，100mg）。
配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。
用时加入49ml超纯水稀释为0.1mg/ml的工作液。
4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50µl/tube，-20℃保存。
使用时需将终浓度调整为25µM（购自Sigma，G8415，100g，分子量：147.13）。
配制方法：电子天平称量谷氨酸1.4713g，即0.01mol=10mmol，溶于200ml超纯水中，配制为50mM的谷氨酸母液。
例：500ml的Neurobasal Medium中加入Glutamate母液（50mM）250μl，此时终浓度约为25μM。
5）胰蛋白酶：0.25%（购自Hyclone，SH30042.01，100ml）。
6）阿糖胞苷（AraC）母液：10mM，(阿糖胞苷，1：1000稀释用)（购自Sigma，C1768，100mg，分子量：243.22）；配制方法：100mg/243.22≈0.41mM，加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。
神经元和其它细胞的体外培养
神经元和其它细胞的体外培养神经元和其他细胞体外培养是神经生物学领域的研究重点。
这种技术可以用来研究神经元对不同刺激和药物的反应、神经元增殖和形态学变化等方面。
此外，这种技术还可以用来制备大量的细胞，以用于药物筛选和基因工程等领域。
下面我们就来详细了解一下神经元和其他细胞的体外培养技术。
1. 基本概念细胞体外培养是指将细胞从动物或植物体内取出并在体外特定的培养基中进行生长和维持细胞生存的过程。
在神经生物学中，神经元或其他神经细胞可以分离和培养。
神经元是一种非常重要的细胞类型，它是神经系统的基本功能单元。
神经元由细胞体、树突、轴突和突触四部分组成。
树突和轴突是神经元和其他神经细胞之间的联系。
为了保证神经元在体外培养的成功，必须在细胞培养前认真准备培养基和其他必要的试剂。
2. 培养基的制备培养基是细胞体外培养不可缺少的组成部分，一般由水、糖、氨基酸、维生素和生长因子等组成。
最基本的培养基是DMEM（Dulbecco最小必需培养基），它能够支持多种细胞的生长和分化。
以人体为例，对于神经元和其他神经细胞体外培养，需要添加生长因子，如NGF（神经生长因子）等。
NGF是神经元的生长因子，能够刺激神经元的生长和增殖。
此外，还需添加血清、氧化物和胶原酶等试剂来促进细胞的生长和形态学变化。
3. 细胞体外培养的方法（1）单细胞悬浮培养法：将细胞收集后直接悬浮在培养基中培养。
（2）均质化培养法：将细胞分散在表面涂有蛋白质的培养皿上，以使细胞附着在表面上并生长和扩散。
（3）移植培养法：将细胞悬浮在小孔的凝胶或其他类似的基质中，以便细胞在凝胶中生长并产生分支。
4. 细胞培养的重要性体外培养技术的发展在神经生物学科研领域中起到了重要的作用，对神经元的大规模培养和成像、神经萎缩和神经细胞增殖等方面进行了深入的研究。
此外，它还可以用于基因工程和药物筛选，为向神经系统提供较好的药物和治疗方案提供了有力的支持。
细胞体外培养技术可通过培养基和培养方法的选择等多种方式来不断完善。
2021三种皮质神经元培养方法及其比较范文2
2021三种皮质神经元培养方法及其比较范文 神经科学是现代科学中进展最为迅猛的研究领域之一，体外原代培养神经细胞的形态学特性及生长发育特征与体内非常相似，较少受到体内循环、内分泌等因素的影响，且便于直接观察、检测指标，已成为神经科学研究中必不可少的模型工具，细胞培养的质量将直接影响研究工作的进展[1-3]. 神经元原代培养是指从活体获得细胞或组织在体外条件下进行的第一次培养，当从胚胎脑组织中分离培养神经元时，由于他们已在原位组织完成分裂时分化，所以培养的神经元将不再会分裂、增殖，这使神经元培养与其他种类体细胞培养相比有很大的不同[4].目前，原代皮质神经元培养的方法有很多，本研究参照相关文献[5-9],对机械吹打法、胰蛋白酶消化法以及木瓜蛋白酶法进行比较研究，并在其基础上进行了实验细节的改良，旨在探讨稳定适当的神经元培养方法及上述三种方法在皮质神经元培养中各自的优缺点，为研究工作者根据各自条件选择合适的培养方法提供理论依据。
1材料与方法 1.1 材料 1.1. 1 主要试剂及配制 多聚赖氨酸（L-polysine） ,L-半胱氨酸（ L-cyste-ine） ,胰蛋白酶（ tripsin） ,木瓜蛋白酶（ papain） ,联咪二苯吲哚（ DAPI） : Sigma 产品；D-Hank's 平衡液，马血清： Thermo 产品； DMEM 培养液，双抗（青霉素，链霉素） : Corning Cellgro 产品； Neurobasal Medi-um,B27 培养基添加剂： Gibco产品。
胎牛血清：上海依科赛生物制品有限公司；兔抗大鼠 NSE 单克隆抗体，FITC标记抗兔 Ig G（ Abcam） . L-polysine打底液：用灭菌 ddH2O 配至工作浓度 50 μg/mL.Tripsin消化液：用 D-Hank's 溶液溶解配至工作浓度0. 125%; 木瓜蛋白酶消化液（ papa-in） : 用D-hank' s 溶液配至工作浓度200μg / mL,现用现配；接种液配制（体积分数） : DMEM 83. 5%,胎牛血清 10%,马血清 5%,双抗 1%,L-半胱氨酸1% ; 神经元培养液（体积分数） : Neurobasal Medium98% ,B27 2% .所有配制液体均用 0. 22 μm筛网过滤。
各类神经元细胞的培养方法
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。
神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。
(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。
(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。
(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。
我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一、鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。
在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1、材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。
2、结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。
神经细胞实验报告
一、实验目的本研究旨在通过体外培养神经细胞，探讨CA1重组蛋白在神经细胞生存以及学习记忆过程中的生物学功能，并深入了解其调控机制，为神经科学领域的研究提供实验基础。
二、实验材料1. 细胞：大鼠胚胎海马神经元2. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、神经生长因子、抗凋亡因子、CA1重组蛋白、学习记忆相关基因的抗体、荧光标记抗体等3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、荧光显微镜、酶标仪、离心机、凝胶成像系统等三、实验方法1. 细胞培养：将大鼠胚胎海马神经元接种于细胞培养皿中，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于细胞培养箱中培养。
2. CA1重组蛋白表达和纯化：通过基因工程方法表达CA1重组蛋白，并进行纯化。
3. 神经元培养和CA1处理：将培养至一定时期的神经元分为实验组和对照组，实验组加入一定浓度的CA1重组蛋白，对照组加入等体积的DMEM培养基。
4. CA1对神经元细胞凋亡的影响：通过流式细胞术检测CA1处理组与对照组神经元细胞凋亡率的差异。
5. CA1与学习记忆相关基因的表达关系研究：通过RT-qPCR检测CA1处理组与对照组神经元中学习记忆相关基因的表达水平。
6. 穿透式电子显微镜观察CA1对突触结构的影响：通过透射电子显微镜观察CA1处理组与对照组神经元突触结构的差异。
7. CA1对学习记忆行为的影响：通过Morris水迷宫实验检测CA1处理组与对照组小鼠的学习记忆能力。
8. 数据分析与统计：采用SPSS软件对实验数据进行统计分析，包括t检验、方差分析等。
四、实验结果1. CA1处理组神经元细胞凋亡率显著低于对照组（P<0.05），表明CA1重组蛋白具有抑制神经元细胞凋亡的作用。
2. CA1处理组神经元中学习记忆相关基因的表达水平显著高于对照组（P<0.05），表明CA1重组蛋白可能通过调控学习记忆相关基因的表达来影响神经元的学习记忆功能。
3. 透射电子显微镜观察结果显示，CA1处理组神经元突触结构较为完整，而对照组神经元突触结构出现一定程度的损伤。
神经元原代培养_
神经元原代培养_
神经元原代培养
从孕17-18天的雌鼠的胎儿分离神经元细胞。
孕雌鼠麻醉然后解剖，胎儿收集到HBSS-1中然后快速断头。
剥离脑膜和白质后，大脑皮质收集入HBSS-2 液中机械磨碎。
皮质碎片移到有0.025%胰酶的H BSS-2液中37°C消化15分钟。
胰酶消化后，细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲洗两次，用神经基础培养液重悬细胞（培养液添加了0.5mM左旋-谷氨酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/ mL庆大霉素）。
以1×105cell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上，放到37°C，5%CO2湿温培养箱里进行培养。
每3天用吸管换液，一次换0.5mL。
体外培养8天细胞就能用于实验。
选用17-18天的胎鼠能够提高神经元培养的效率，因为与乳鼠相比胚胎组织的细胞连接还很少。
因此，用乳鼠会使神经元的分离更加困难，会造成细胞连接不可逆的损伤，细胞之间的共同的轴突和树突更容易发生损伤。
另外，用出生后1天内的大鼠皮质培养容易有胶质细胞污染，而用胎鼠则可以避免这种情况。
如果用的是乳鼠，一般是在培养36个小时后加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞生长。
另外，如果把分化的影响看成是考虑的重要因素，可以用培养4天的、8天的、18天的细胞。
其中一个例子可以是观察毒性物质对小孩和成年的不同效应。
神经细胞的培养
海马神经元的培养总结1.新生大鼠海马常规取法：断头，线剪剪去皮肤，组织剪从椎管纵向剪开颅骨，再颅顶横向剪一刀。
暴露两侧大脑半球，用小弯镊翻出大脑，延纵裂分别向两侧翻开大脑半球，在底部可见新月形的海马，用眼科镊取出置于冰浴的盐溶液中，在解剖镜下剥离周围组织和血管膜。
2.培养基：我用的接种培养基是DMEM/F12+10的胎牛血清＋胰岛素＋葡萄糖＋谷胺酰胺，维持培养基里就是多加了5uM的阿糖胞苷。
培养液的pH调至6.8—7.4可，最好不要调至7.4或高。
一般在培养液放置两周后，加入终浓度为2mM的谷氨酰胺3.胰酶：酶用0.125的。
其实一次性消化比较简单，关键是消化时间不要太长，不知你用多长时间，一般是15-20分。
4.多聚赖氨酸的配置：可以用去离子水配, 也可以用D-HANKS也配(我用的配方),或者PBS 效果都差不多. 一般先配成1mg/ml的母液, 用高压过的滤器过滤,最好分装以后放在-20度, 用的时候再稀释至0.01mg/ml.5.铺板：我的办法是将盖玻片直接经泡酸后要反复的洗干净，用单蒸后用双蒸水。
后放在75％的酒精中浸泡半个小时以上，在超净台中取出后用酒精灯烧一下，注意不要太久，以防破碎，后放在24或6孔板中，加入稀释好的多聚赖氨酸，室温放置3小时以上或过夜，切记不要照紫外，可以在上面覆盖东西。
结束后回收多聚赖氨酸，并用灭菌水或PBS等清洗三遍以上即可使用，我用的效果非常好。
6. 1. 盖玻片洗净之后, 需要泡酸过夜处理, 这样玻片会比较干净, 养原代背景会干净的多. 就算是新的也要洗(曾经有过教训).2.包被多聚赖氨酸用之前要用高压的去离子水洗3遍,再用D-HANKS过一遍.3. 多聚赖氨酸包被时,如果有条件可以放在4度振摇过夜,效果更佳.4. 神经元细胞种植之前1小时把种植培养基加进去,会提高细胞活力.7.纯化细胞方法：1.差速贴壁：接种前可将制备的细胞悬液放入底面积为75cm2的培养瓶中（未包被），然后放入37度，5%CO2培养箱中半小时，然后再过滤，转移至培养皿/瓶中。
神经元培养 -总结
Coverslips的清洗方法1.三蒸水浸泡过夜2.硝酸浸泡48小时, 硝酸每月更换一次。
（18h<时间<72h ）3.先用单蒸水冲洗几遍，将表面的硝酸洗去，然后用双蒸水洗8次，在摇床上摇90-100转，1小时换一次水。
最好能摇过夜。
4.干烤6小时，干烤温度为225度。
注：洗玻片这一步很重要，如果洗不彻底，细胞贴壁明显不好，并有聚团现象。
洗得过程中，请按照先放水，再放入玻片架，以免玻片互相粘在一起，洗不彻底。
换水时用PE手套，每次换水请更换PE手套，如洗的过程中有粘在一起的现象，请用镊子一个一个分开后，再继续洗。
5.在超净台，放到无菌培养皿里，封口膜封好6.用0.1mg/ml的PLL coat玻片，每个玻片100-120ul,过夜放置，60mm 加3ml，12孔板加1ml。
注：PLL最好不要使用超过1个月。
母液浓度1mg/ml，-20℃贮存，工作浓度0.1mg/ml（100ul母液+ 900ul ddH2O）7.种细胞前吸去多赖，用HBSS洗，2ml/well ，2-3次。
注：没有放coverslips的dish 不用洗，直接吹干就好了，30min 左右。
8.在Hood里自然干燥，不开紫外，紫外线可以分解多赖。
Preparation:1）冰盒，解剖工具（1把大剪刀，2 把尖镊子，2把尖嘴弯镊）泡在75%的酒精中消毒，100mm dish 2个，60mm dish 4个，细胞计数板，timer，1大1小两个塑料袋。
2）4个60mm dish每个放3ml左右HBSS置冰上，1个100mm dish 加入20ml左右DMEM全培置冰上。
3）打开37 C水浴，pre-warm HBSS，NB全培，0.25%胰酶（trypsin）学生值日准备工作1 预先查看是否有NB液及加B27的NB液2 查找并确定共需多少皿神经元，注意孵箱里保顾的待培养的皿，24孔板，6孔板等2 确定共需配制多少神经元培养液（即10% HS的全培）3 吸去待培养神经元的培养皿中的多赖并回收多赖，晾干4 配制神经元培养液，并加于各待培养的皿中，24孔板500ul，96孔板100ul神经元基础培养液：Neurobasal Medium + B27(2%，10ml/500mlNB，避光融化)神经元原代培养种植液50ml：DMEM + HS(5ml，10%)神经元培养液：神经元基础培养液 + GlutaMAX (125ul，100X，0.25%) + 双抗（1%，P-S，无血清）NB，0.25% trypsin，37℃预热。
原代海马神经元细胞培养
原代海马神经元细胞培养-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1原代海马神经元细胞培养溶液的配制：(1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤，室温保存。
(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO412H2O，1.7g；KCl，0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。
用0.2m滤膜过滤，4℃保存。
(3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液冻存。
使用时，用解剖液稀释至0.25%。
(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。
将上述多聚赖氨酸放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。
(5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP047H20，0.18g；KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。
(6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。
(7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。
(8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg ml-1的母液储存。
用0.2m 滤膜过滤，-20℃储存。
使用时，取6l母液加入2ml培养液中，终浓度为3g ml-1。
（根据实验情况调整浓度）大鼠原代海马神经元细胞的培养(1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解剖液的培养皿中。
(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。
在分离出全部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。
神经胶质细胞培养
神经胶质细胞培养
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神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。
而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。
人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。
一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV
等诱发转
4
化。
养方法如下：
1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks 液中漂洗一、二次。
2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。
3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。
4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，计数并调整细胞密度。
5、接入培养瓶或皿中，置5%CO
温箱中培养。
2
该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。
贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。
细胞传代可以0.25%胰酶消化处理。
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体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。
神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。
(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。
(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。
(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。
我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一、鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。
在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1、材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。
2、结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。
而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。
二、新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。
在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。
1、材料和方法取新生一天的大鼠(wistar种)和小鼠(昆明种)。
用眼科剪在无菌条件下除去背部皮肤, 然后剪取一段脊髓,背侧朝上置于灭菌毛玻璃片上,在解剖显微镜下沿椎管两侧水平剪除腹侧一半椎骨,暴露脊髓和神经节,用解剖镊分离出神经节。
鸡胚背根神经节的取材方法同前。
剥除神经节被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃30min)分散后用种植(Plating)培养液稀释成0.2×105 个细胞/ml密度的细胞悬液，接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml细胞悬液置。
置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。
24h后倾去培养皿内种植培养液，改用饲养(Feeding)培养液培养。
接种第3d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神经细胞的增殖, 作用48 h后更换新鲜饲养培养液，以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。
2、培养液成份种植培养液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO33.7g/L);10%胎牛血清; 10%马血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。
脱氧核糖核酸酶I 40μg/ml。
饲养培养液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,)；5 % 马血清；NGF 20ng/ml；神经营养素1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。
3、新生大鼠背根节神经元的生长分化和形态特征新生大鼠背根节神经元接种后4h,大部分细胞可贴壁, 呈圆形或椭圆形,直径8-14μm, 胞体周围呈现一圈光晕。
神经元的细胞核位于中央或偏于胞体一侧,核仁明显,亦可见双核神经元。
接种后24h, 大部分贴壁细胞开始长出突起。
其中多数为具有多个突起的多极神经元,少数为双极和假单极神经元, 突起细长,并可观察到突起末端的生长锥。
除单个散布的神经元外,还常见到几个或多个神经元聚集在一起, 它们向四周发出树枝状的神经突起。
培养2-3d后神经元的突起逐渐增多并延长, 形成稀疏的神经网络。
随着培养时间的延长, 神经元突起的主干和分枝明显延长并增粗,神经突起网络变得更加稠密, 神经元胞体逐渐增大。
大鼠背根节神经元可维持培养2个月。
4、新生小鼠背根节神经元的生长分化和形态特征新生小鼠背根节神经元的形态结构和生长分化基本上与新生大鼠相似,但小鼠背根节神经元的胞体较大鼠稍小。
神经元亦随着培养时间的延长而逐渐增大。
小鼠背根节神经元亦可维持培养2个月。
5、鸡胚背根节神经元的生长分化和形态特征鸡胚背根节神经元的生长分化基本上亦与新生大鼠和小鼠相似。
但鸡胚背根节神经元以假单极为多见。
与大鼠或小鼠背根节培养神经元相比,神经突起分枝较少。
神经元胞体稍小,神经元亦随着培养时间的延长而逐渐增大。
鸡胚背根节神经元亦可维持培养2个月。
三、新生小鼠颈上交感神经元分散细胞培养交感神经系统在维持机体的正常功能和对环境的适应性反应中起着十分重要的作用。
交感神经细胞培养特别有助于神经细胞发育和可塑性研究，利用体外培养系统可进行交感神经细胞的发生、死亡、形态和生化发育、递质表形的获得，以及靶组织与传入纤维的突触形成的研究。
此外，通过体外培养系统可获得关于神经营养因子、激素，细胞因子等调节交感神经元发育的信息，了解传入纤维的输入以及与靶组织的联系的机制。
1、材料和方法实验用出生当天的昆明种小鼠，在无菌条件下腹部朝上固定于塑料泡沫板上,用微解剖镊在解剖显微镜下找到气管两侧的颈总动脉,并以此为标志,在颈总动脉分为颈内外动脉交叉处找到上颈交感节, 取出上颈交感节, 置于含 1 % 胶元酶(Collagenase)和1 % 消化酶(Dispase)的2ml混合消化液中消化(37℃，1 h)分散后，用种植(Plating)培养液稀释成0.2×105个细胞/ml密度的的细胞悬液；接种于涂有小牛皮胶或以小鼠脑皮层胶质细胞为背景的35mm塑料培养皿中，每皿2ml细胞悬液置。
置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。
24h后倾去培养皿内种植培养液,改用饲养(Feeding)培养液培养。
接种第3d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml, 作用48 h后更换新鲜饲养培养液,以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。
2、培养液成份种植培养液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L)；10%胎牛血清；10%马血清；NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。
脱氧核糖核酸酶I 40μg/ml。
饲养培养液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,)；5%马血清；NGF 20 ng/ml；神经营养素1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。
3、新生小鼠交感节神经元的生长分化和形态特征新生小鼠交感节神经元在含NGF 的培养液中种植后4h, 细胞即开始贴附在胶元薄膜或在皮层胶质细胞层上生长, 交感神经元的胞体一般为圆形, 有时亦可见椭圆或梭形,体积较大, 直径约8-14μm左右,胞体周围呈现一圈光晕,神经元的细胞核大多偏于胞体一侧,核仁明显,亦可见双核神经元。
接种后24h, 大部分贴壁神经元开始长出突起。
培养2-3天后,神经元突起逐渐增多并延长, 形成稀疏的网络。
随着培养时间的延长, 神经突起网络变得更加稠密。
神经细胞的主干和分枝明显延长并增粗, 神经元的胞体逐渐增大。
小鼠交感神经元可维持培养1-2个月。
四、胚胎小鼠、大鼠、鸡胚脊髓腹角运动神经元培养中枢神经系统包括脑和脊髓，脊髓是中枢的初级部分，其功能有二，一是传导感觉和运动冲动，二是完成躯体运动的基本反射。
脊髓突然被横断并与高级中级失去联系后产生脊休克。
因此，利用体外培养的脊髓腹角运动神经元进行脊髓损伤和修复的研究日益受到重视。
1、材料和方法用12-14d 胚龄的小鼠、12-14d 胚龄的大鼠、孵化10 d 的鸡胚，在无菌条件下取出胎鼠或鸡胚脊髓，剥除脊膜后,将整个脊髓腹侧面朝上置于平皿中，用微解剖镊和双面刀片沿脊髓中央管纵切两半，再将脊髓两侧的腹侧部分切下，将组织块切碎，用0.125% 胰蛋白酶消化(37℃30min)分散后,用种植培养液(同第二节)稀释成5×105个细胞/ml密度的细胞悬液,接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml,置36℃、10%CO2的培养箱中培养,24h后倾去培养皿内种植培养液, 改用饲养培养液(同第二节)进行培养。
以后每周换液两次,每次更换50%的新鲜饲养培养液。
2、胚胎小鼠、大鼠、鸡胚脊髓腹角运动神经元的生长分化和形态特征胚鼠和鸡胚脊髓腹侧神经元培养12h后,大部分神经元可贴壁,贴壁神经元呈圆形,直径5-8μm,其中少数神经元开始伸出1-2个突起。
培养24h后, 神经元突起逐渐增多并延长,形成稀疏的网络,培养的脊髓神经元以双极和多极为多见, 神经元呈圆形或椭圆形及多边形不等,胞核清楚,多数具1-2个核仁。
随着培养时间延长, 神经元突起进一步增多、增粗并延长,形成稀疏的神经网络, 神经元胞体逐渐增大。
多极胞体大的神经元逐渐增多,经胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫组织化学染色和乙酰胆碱酯酶(AChE)组化染色呈阳性反应。
此后，只要定期换液并适当抑制非神经细胞的过度增殖,胚眙大鼠、胚盼小鼠和鸡胚脊髓腹侧运动神经元在体外可维持培养2个月。
五、新生大鼠海马神经元分散培养海马属大脑边缘系统，与情绪、学习及记忆有关，它具有明显的长突触传递的长时间程长时程增强（LTP）和长时程抑制（LDT）的能力。
LTP和LDP具有协动性、特异性、长时性的特点，目前已被认为是学习和记忆的基础。
而且海马组织常常是引起癫痫发作的病变部位，并且海马细胞对缺血、缺氧特别敏感。
这些特征反映了海马神经元的内在性。
例如，对缺氧的可塑性和易感性均与NMDA （N-methyi-D-aspartate，N-甲基-D-天冬氨酸）受体的独特性质相关。