细胞培养方法

2007-10-03 | 软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆)

将1.2％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合制备

0.6％的底层琼脂，6 孔板中每个孔1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000 个/ml，将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液（约1000cell/well)，混匀，室温凝固。置于37℃，5％CO2 的细胞培养箱中培养2－3 周，计数含50 个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，SpotII 采集图像。

2007-10-03 | MTT检测细胞增殖及见解

细胞以每孔3000个接种至96孔板，分成不同组，每组3孔，利用含有10％胎牛血清的DMEM培养液培养24 h之后，向培养液中加入一定工作浓度的药物（单体或混合物），继续培养24 h或48h。培养结束，直接向每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，孵育2－4小时（应常在显微镜下观察）。去除培养液，每孔加入DMSO 100μl，充分振荡3分钟，立即在酶标仪上测定490nm的吸光度值。

由于这种方法基于琥珀酸脱氢酶的活性，因而加入MTT之后应该在显微镜下观察，药物是否可以改变细胞琥珀酸脱氢酶的活性。若是改变则不可以使用此种方法。

另有根据细胞ATP含量测定细胞增殖的方法，但是都要考虑药物对细

胞ATP是否有影响。

所以测定细胞增殖，最简单，最原始，最麻烦的方法，进行细胞计数我

们感觉还是最好的方法。

细胞培养方法

哺乳动物细胞培养规则：

1，严格按照细胞培养室规则进行哺乳动物细胞，由于细胞为整合生物中心共用，使用紧张，在使用时尽可能提高速度，保证操作规范。

2，使用细胞间之后，主动将安全柜台面和桌面等清理整齐干净。

3，在自己培养细胞出现污染之时，及时通报同一培养箱培养细胞者，并将培养相关细胞的培养液/PBS/胰酶等全部清出细胞培养室，以减轻对细胞培养的影响。

4，实验所用细胞培养原则要求：A，细胞复苏之后两代开始使用；B，保证细胞每次传代前密度不超过90%；C，细胞使用最多12代（约2个月）。

5，最好每天观察细胞生长状态，若有异常及时处理。

6，具体参照中细胞培养要求。

细胞传代方法

1，将长至80-90%细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。

2，加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。

3，瓶口用瓶盖盖好，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入适当体积的培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。根据不同细胞而异。

4，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，尽可能的避免气泡产生，分到另外两到三瓶中，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。

5，细胞培养液参照，一般含有10%胎牛或小牛血清。

96/24孔板传代：

1，前同于普通细胞传代方法。

2，细胞吹打均匀后，对细胞进行计数，根据需要调至适当浓度。例如：每孔传代10000个细胞，可以将细胞调至浓度十万，之后利用排枪，吸取100ul，至96孔板中。

3，24孔板，采用1ml移液器进行传代。

细胞冻存方法

1，预先配制冻存液：含90%FBS，10%DMSO的冻存液，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；

2，取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106～5 ×106细胞/ml)；

3，加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称/冷冻日期/操作者。

4，放于程序降温盒，之后在-80℃冰箱过夜。

5，将程序降温盒中细胞放于液氮保存。

6，要保证冻存细胞数量。

细胞复苏方法

1，从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，不断摇动使其融化（1分钟左右）；

2，尽快用培养液稀释至原体积的10倍以上；

3，低速离心10分钟，1000转；

4，去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。

5，尽快对复苏细胞进行换液。

6，扩大培养后，再冻存至少复苏数量的细胞，以保证细胞库的完整。

细胞计数

1、将血球计数板及盖片用双蒸水擦试干净，并将盖片盖在计数板上。

2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

3、静置3分钟。

4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000

实验前准备下列物品：双蒸水瓶子（500ml、250ml），离心管，tip头，Eppendorf管，滤纸，餐巾纸，微量加样器20-50µl。具体实验步骤如下：

细胞总蛋白的提取

利用RIPA细胞裂解液，提取经处理细胞的总蛋白，根据RIPA试剂盒提取步骤如下：

1，收集细胞，加入300µlRIPA和3µlPMSF（不可以预先加入PMSF），利用枪头吹打，放置于冰上30min

2，将样品于4℃、30min、20000g离心

3，小心将上清液转移到新的离心管中，分装成每管25µl，于－70℃保存

4，两份5µl的细胞裂解液，稀释10倍之后，利用BCA法测定蛋白质浓度。

利用BCA－100蛋白质定量测定试剂盒（购自上海申能博采生物科技有限公司）测定蛋白质浓度，步骤如下

1，SolutionA and SolutionB混合液（根据需要确定混和量，A：B＝50：1）

A，绘制标准曲线和加样，如下表3－4：