转基因和基因敲除技术(及英文文献讲解)

Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤 ：
①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的 链连接，形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA
④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体 DNA，分别为：
5´ 3´ 3´ 5´
5´ 3´
片 5´ 段 重 组 体 拼 接 重 组 体
5´ 3´ 5´ 3´
5´
DNA 连接酶
5´
5´ 3´ 5´3´ 3´
3´ 5´ 3´ 5´
5´
RNA干扰引起的基因敲除
利用随机插入突变进行基因敲除
即基因捕获法： 利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌 或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机 插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库， 然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲 除细胞。
转基因技术基本原理
1、
目的基因的获取
2、 克隆载体的选择和构建 3 、 外源基因与载体的连接 4、 DNA导入受体
5、
6、
重组体的筛选
克隆基因的表达
重组DNA技术操作的主要步骤 载体
质粒 噬菌体 病毒
目的基因（外源基因）
基因组DNA
限制酶消化
cDNA 人工合成
PCR产物
开环载体DNA
连接酶 转化
Failure of mouse ES cells
chromosomal abnormalities in ES cells
DAc8-p53-1 ES cell 染色体组型分析
over 65% of the cells were polyploid（多倍体）
whether germline competency of DAc8-p53-1 rat ES cells could be improved through subcloning
目的基因
重组体
体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
分子杂交
目录
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
( )
目录
原 位 杂 交
目录
Southern印迹
目录
常用的植物转基因方法
遗传转化的方法按其是否需要通过组织培养、再生植株可 分成两大类: 1、需要通过组织培养再生植株，常用的方法有农杆菌介 导转化法、基因枪法； 2、不需要通过组织培养，目前比较成熟的主要有花粉管 通道法。
a germline chimaera
76 offspring 6 germline pups
inheritance the gene-targeted p53 allele
母
公
纯合子
9/12
summary
1
2
扩增耐抗生素克隆体
obtained 14 p53 gene-targeted DA rat ES-cell clones
相差镜检法
荧光影像
PCR
DAc8-p53-1 ES cell 显微注射 79 blastocysts（囊胚） collected from E4.5 Fischer 344 (F344) rats 嵌合体
转基因与敲除技术
陈春桂 甄云梅 2011-12-5
www.dayeh.com.cn
转基因技术
1
•定义与原理
•常用方法
•研究前景与运用
定义
转基因技术：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基 因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗 传的变化，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。
利用基因同源重组进行基因敲除
发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重组。 是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连 接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链 片段的交换。
同源重组需要一些重组蛋白和酶，如Rec A、B、C、D及 DNA连接酶等 最为广泛
转基因技术发展情况
一是品种培育速度加快。随着生命科学、基因组学、信息 学等学科的发展，目前全球转基因生物新品种已从抗虫和 抗除草剂等第一代产品，向改善营养品质和提高产量的第 二代产品，以及工业、医药和生物反应器等第三代产品转 变，多基因聚合 二是产业化应用规模迅速扩大。全球已有25个国家批准了 24种转基因作物的商业化应用。转基因大豆、棉花、玉米、 油菜为代表的转基因作物种植面积迅速增长。 三是生态和经济效益十分显著。1996至2007年，全球转 基因作物的累计收益高达440亿美元，累计减少杀虫剂使 用35.9万吨。2008年，全球转基因产品市场价值达到75亿 美元。
研究现状
现在基因敲除技术主要应用动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小 鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。
文献讲解
技术原理： 同源重组的基因敲除
实验目的： 用胚胎干细胞为基础的基因打 靶技术方法，构建基因敲除 （p53）的大鼠模型。
wenku.baidu.com
PGK-DTA(磷酸甘油酸激酶1-白喉毒素-A链)不参与同源重组，它的随机插入是 位于10号染色体上，包括10个外显子，其中启动子外显子2上 为了减少含有随机目标媒介插入的耐抗生素型ES细胞，以富集正确的目标细胞。
转移
pseudo-pregnant female Sprague –Dawley rats
6 female pups
Twenty-four live-born pups
female Sprague–Dawley rats 交配 over 600 offspring one carried the DA rat ES-cell genome 10 male pups
Around 10% of the cells formed round and compact colonies 扩增建立亚克隆
identified 2 subclones with euploid chromosome numbers
2 subclones 显微注射 39 F344 rat blastocysts
Positive selection
negative selection
6.7 kb 1.6 kb dark agouti (DA) rat ES-cell genomic DNA
电穿孔法
构建基因载体
DA ES cell
鉴定中靶细胞
培养基中加入抗生素
PCR和Southern blot analysis
DNA 连接酶
5´ 3´ 3´ 5´
Holiday中间体
3´ 5´ 5´ 3´
5´ 3´ 3´ 5´
Holiday中间体
3´ 5´ 5´ 3´
内切酶 (ruvC)
3´ 5´
5´ 3´
5´ 3´ 3´ 5´
内切酶 (ruvC)
3´ 3´ 5´ 5´ 3´ 3´ 3´
5´
5´ 3´ 3´ 5´ 3´
DNA 连接酶
3´ 5´ 内切酶 5´ (recBCD)
3´
5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´
DNA侵扰 (recA)
5´ 3´ 3´ 5´
内切酶 (recBCD)
3´ 5´ 5´ 3´
分支迁移 (recA)
5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´ 3´
5´ 3´ 3´ 3´
3´ 5´ 5´ 3´
应用
植物：抗虫、抗病、抗除草剂 植物培育、改良作物品质（富 含赖氨酸的玉米） 动物：提高生长速度、生产药 物蛋白、器官移植、乳腺生物 反应器 微生物：疫苗 基因治疗，生物治疗，基因诊 断，疾病基因的发现与克隆、 遗传病的预防
基因敲除 (knock-out)
•定义
•方法
•现状
定义
identified by the appearance of agouti coat colour
产24只幼鼠，其中 10只公鼠和6只母 鼠被着色，说明存 在DAc8-p53-1。
PCR genotyping results showed that this germ line animal did not inherit the gene-targeted p53 allele
常用的动物转基因技术
1．核显微注射法 2．精子介导的基因转移 3．核移植转基因法 4．体细胞核移植法 过去的几千年里农作物改良的方式主要是对自然突变产生 的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自然的方 式来积累优良基因。遗传学创立后近百年的动植物育种则 是采用人工杂交的方法，进行优良基因的重组和外源基因 的导入而实现遗传改良。 因此，转基因技术与传统技 术是一脉相承的，其本质都是通过获得优良基因进行遗传 改良。