7.1 荧光和磷光光谱的产生
分子荧光和磷光光谱分析法讲解
2、荧光、磷光的寿命和量子产率
荧光寿命τf ：荧光分子处于S1激发态的平均寿命
f
1 (kf
K)
k f ：荧光发射过程的速率常数
K ：各种分子的非辐射衰变过程的速率常
数的总和。
典型分子的荧光和磷i 在光 10-8~ 10-10s
光谱分析法讲解
➢ 磷光寿命τp ：磷光分子处于T1激发态的平均寿命。
f kf (kf K)
➢ 荧光量子产率的大小取决于荧光发射与非辐射 跃迁过程的竞争结果。
K << k f
f 1
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 磷光量子产率（p）
p
S
TKp
Kp
Kj
K p ：磷光发射的速率常数
ST ：S1 T1系间窜越的量子产率
Kj ：与磷光发射过程相竞争的从T1态发生 的所有非辐射跃迁过程的速率常数的
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
振动弛豫：分子将多余的振动能量传递给介质而 衰变到同一电子能级的最低振动能级 的过程。
内转化：相同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁过程。
例如： S1 S0
T2 T1
系间窜越：不同多重态的两个电子态间的非辐射 跃迁过程。
荧光与磷光的基本原理
荧光与磷光的基本原理荧光和磷光是物质光致发光过程中常见的两种现象。
它们可以被用来检测材料的性质、追踪物质在生物体内的分布，以及在科学研究和工业中扮演着至关重要的角色。
本文将讨论荧光和磷光的基本原理，以及它们的应用。
一、荧光的基本原理荧光是一种光致发光现象。
当某些物质被激发时，它们会吸收能量，并在吸收后发射光子。
这个过程可以被描述为：M +hυ(excited state) → M* → M + hυ(emission) 。
其中M为物质，hυ为光子，excited state和emission分别表示激发态和发射态。
荧光在荧光检测和生物学研究中被广泛使用。
它可以用于探测药物、发现病毒、细菌和细胞，以及跟踪DNA和RNA等生物大分子。
荧光还有广泛的应用，如流式细胞仪、荧光显微镜等。
二、磷光的基本原理磷光是一种光致发光现象，与荧光相似。
它的过程可以被描述为：M + hυ(excited state) → M* → M + hυ(emission) 。
在此过程中，“excited state”可以分为单重态和三重态。
单重态和三重态分别对应于分子的不同电子的自旋状态。
在很多情况下，荧光和磷光都可以同时存在。
磷光通常比荧光持久，因为在它的发生过程中，光子被释放的能量不是来自分子的振动能，而是来自分子的旋转能。
在这种情况下，分子释放出的能量被分散到周围的基体中，而不是以光子的形式释放。
因此，磷光可以从几纳秒持续到数百微秒。
三、荧光和磷光的应用荧光和磷光的应用非常广泛，从材料科学到医学和环境科学。
在材料科学中，荧光和磷光被广泛用于表面分析、光辐射测量和固体物性等方面。
在医学中，荧光和磷光能够帮助识别肿瘤和病原体，优化药物筛选和治疗方法。
在环境科学中，荧光和磷光可以用于监测水体和土壤中的有机物和无机物质的分布和迁移。
值得注意的是，荧光和磷光的应用通常需要结合化学、光学、电子学和计算机学等多个领域的知识。
例如，荧光和磷光分析需要分析样品中的存在物种和激发条件，并根据荧光和磷光的特性来选择合适的检测设备和荧光染料。
荧光和磷光
实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下接
近1，说明 ki 很小，可以忽略不计。一般来说，kf 主要取决于化学结构， 而ki 则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。
磷光的量子产率与此类似
一、基本原理
2. 荧光与有机化合物的结构 （1）跃迁类型 跃迁是产生荧光的主要跃迁类型
S2
S1
T1
S0 吸光1
吸光2 荧光3
荧光
一、基本原理
系间窜跃
不同多重态间的无辐射跃迁，例如 S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发生 系间窜跃时，电子由S1的较低振动能级 转移至T1的较高振动能级处。有时，通 过热激发，有可能发生T1→S1，然后由 S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。
系间窜跃
S2
内转移
S2
S1
T1
S0 吸光1
吸光2
荧光发射
一、基本原理
处于第一激发单重态中的电子跃回至基
态各振动能级时，将得到最大波长为
λ3的荧光。注意：基态中也有振动驰 豫跃迁。很明显，λ3的波长较激发波 长λ1或λ2都长，而且不论电子开始被 激发至什么高能级，最终将只发射出波
长λ3的荧光。荧光的产生在10-7-10-9s 内完成。
一、基本原理
（三）荧光和分子结构的关系
分子产生荧光必须具备两个条件：
① 分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才 能吸收激发光；
② 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有 一定的荧光量子产率。
1. 量子产率
一、基本原理
荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，它表示物质发射荧光的能力，通常 用下式表示
在极稀的溶液中，当lc0.05时 If =2.3 I0 lc
第七章 分子发光-荧光与磷光
蒽的激发光谱
I F ∝f (λex 、λem) 固定激发波长、扫描发射波长 固定激发波长、
蒽的发射光谱
蒽的三维等高线光谱图
蒽的三维等荧光强度光谱
发光材料与器件基础
VB1和VB2的三维荧光光谱
3.三维共振光散射光谱 3.三维共振光散射光谱
ADS ATS ADS ATS TS RLS DS TS 散射片三维共振光散射光谱
荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下， 荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不 同波长的荧光。 n 同波长的荧光。 n
M + ∑hvi ⇒M * X X
i =1
M * ⇒M + ∑hv j X X
j=1
IF4800
固定λem=620nm(MAX)
A. 激发光谱
固定发射波长 扫描激发波长 荧光激发光谱与 紫外紫外-可见吸收光 谱类似
发光材料与器件基础
2. 共轭效应 产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系， 产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越 离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。 大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。
化合物 萘 0.29 286 321
苯 0.11 205 278
It 1− = 1−T = 1−e−2.303εbC I0
I0 − It = I0 ( 1−e−2.303εbC )
荧光强度（ 与相应的吸光分数成正比： 荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：
IF =φ( I0 − It ) =φI0 ( 1−e−2.303εbC )
按照级数展开式： 按照级数展开式：
x x2 x3 x4 xn ex = 1+ + + + + ••• + 1! 2! 3! 4! n!
荧光和磷光的产生过程
荧光和磷光的产生过程 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】1．荧光和磷光的产生过程荧光：处于基态的分子吸收光子能量，跃迁至电子激发态，然后通过内转换和振动弛豫回到第一激发单重态的最低振动能级，最后跃迁回基态时发射的光激发态振动弛豫内转换振动弛豫发射荧光S磷光：处于基态的分子吸收光子能量，跃迁至电子激发态，然后通过内转换和振动弛豫和系间窜越到了第一激发三重态，最后回到基态时发射的光激发态振动弛豫内转换系间跨越振动弛豫S发射荧光2.激发光谱和发射光谱概念，有何异同（1）激发光谱：固定发射光的波长，测量激发光的波长与发射光强度之间的关系（选择最佳激发波长）（2）发射光谱：固定激发波的波长，测定发射光强度与发射光波长的关系（选择最佳发射波长）同：都是给样品能量使之发光测量发光强度异：控制的变量不同。
3.化合物荧光与结构的关系a．具有一定的荧光量子产率b．具有合适的结构如：大的共轭π键、刚性平面结构、最低的单重电子激发态为S1 为π * π型、取代基为给电子基团4.荧光量子产率、荧光猝灭、系间跨越、振动弛豫A．荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。
B．荧光猝灭：指荧光物质与溶剂分子之间相互作用，导致荧光强度下降的现象，荧光猝灭分为静态猝灭、动态猝灭等。
C．系间跨越：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程；分子由激发单重态跨越到激发三重态。
D．振动弛豫：同一电子能级内异热交换形式由高振动能级至地振动能级间的跃迁。
时间为10-12s5.实时定量PCR与普通PCR的区别所谓实时荧光定量PCR技术[1]，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR技术是起点检测，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在之中，通过对每个Ct值的计算，根据获得定量结果。
荧光和磷光解析
一、基本原理
（1）螯合物中配位体的发光
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构， 分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金 属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大， 常会发生荧光。
如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但 其金属螯合物具有很强的荧光
一、基本原理
（2）螯合物中金属离子的特征荧光 这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发， 接着配位体把能量转给金属离子，导致dd 跃迁和ff 跃迁， 最终发射的是d*d跃迁和f *f 跃迁光谱。
一、基本原理
单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s， 而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s 以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。
一、基本原理
1.2 激发态分子退激 辐射跃迁方式 无辐射跃迁方式
辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射
无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛 豫（VR）、内部转移（IR）、系间窜跃（IX）及外部转移 （EC）等
一、基本原理
（3）镜像规则
通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。
S2
S1 T1
S0
吸光1
吸光2
荧光3
一、基本原理
（3）镜像规则 通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。 吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能 级形成的。其形状决定于第一电子激发态中各 振动能级的分布 情况。
激发波长的选择与发射波长的判断
一、基本原理
2.3 荧光发射光谱的普遍特性： （1）Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长， 称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去能 量，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量 的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。
第七章 分子发光-荧光与磷光解读
激发光谱
发射光谱
l
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
蒽的激发光谱和荧光光谱
500 nm
三、荧光光谱的特征—激发光谱与发射光谱的关系
1、Stokes位移 在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的吸收(或激 发)光谱的波长长，荧光发射这种波长位移的现象称为Stokes 位移。 处于激发态的分子一方面由于振动弛豫等损失了部分能量，
T1
紫 外 可 见 吸 收 光 谱
紫 外 可 见 共 振 荧 光 S0 光 谱
S1
迟 滞 荧 光
振动弛豫: Vr 10-12sec 外 转 移:无辐射跃迁 回到基态 内 转 移:S2~S1能级 之间有重叠 系间窜跃: S2~T1能级 之间有重叠 反系间窜跃:由外部获 取能量后 T1 ~ S2
磷 光
外转移
蒽的发射光谱
蒽的三维等高线光谱图
蒽的三维等荧光强度光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3.三维共振光散射光谱
ADS ATS ADS ATS RLS DS TS
RLS
DS
TS 散射片三维共振光散射光谱
固定lex=270nm
共振光散射 瑞利散射 拉曼光 二级共振光散射 三级共振光散射
500 550 600 650 700 750 800 850 900
2.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单 重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
S0→T1 禁阻跃迁；
通过其他途径进入
第七章分子发光荧光与磷光详解演示文稿
i1
kF、 kp主要取决与荧光物质的分子结构； st系间窜跃效率。
ki主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。
大多数的荧光物质的量子产率在0.1~1之间；
例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55； 荧光素 F=1
化合物
F 0.11
第三十一页，共69页。
第十二页，共69页。
S1
外转移
荧光
反系间 窜跃 系间 窜跃
１. 辐射跃迁的类型
共振荧光：10-12 sec 荧 光：10-8 sec 磷 光：1~10-4 sec 迟滞荧光:102~10-4 sec
２. 无辐射跃迁的类型
振动弛豫: Vr 10-12sec T1 外 转 移:无辐射跃迁回
迟
到基态
滞
荧 光
lex =290nm (MAX)
l
lem= 620nm(MAX)
镜像规则的解释
大多数吸收光谱的形状表明了 分子的第一激发态的振动能级 结构，而荧光发射光谱则表明 了分子基态的振动能级结构
一般情况下，分子 的基态和第一激发 单重态的振动能级 结构相似，因此吸 收光谱的形状与荧 光发生光谱的形状 呈镜像对称关系。
对于处于S1(T1)电子态的荧光体来说，其平均 寿命()可以左式表示：
F(P)
1
n
kF(P) ki
i1
第三十页，共69页。
3. 荧光(磷光)的量子产率
荧光量子产率的定义：
发射荧光的分子数
F 激发分子总数
发射磷光的分子数
P 激发分子总数
F
kF
n
kF ki
i1
P st
kP
n
kP ki
1. 分子能级与跃迁
荧光磷光基本原理
Hale Waihona Puke 荧光延迟荧光磷光系间跨越 内转移
外转移
振动弛预
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态 单重态的最低振动能级→基态； 荧光 单重态 磷光：10-4～10s；第一激发三重态 三重态的最低振动能级→基态； 磷光 三重态
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 激发光谱与荧光(磷光)
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 荧光(磷光)
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大；
2.荧光光谱(或磷光光谱) 2.荧光光谱(或磷光光谱) 荧光光谱
固定激发光波长(选 最大激发波长), 化合物 发射的荧光(或磷光强度) 与发射光波长关系曲线( 图中曲线II或III)。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260 320 380 440 500 560 室温下菲的乙醇溶液荧（ 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
内转换 S2 S1 能 量 吸 收
内转换 振动弛豫 系间跨越
T1 发 射 荧 光
T2
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
荧光和磷光
差越小，荧光峰的波长越长。
也可以从位能曲线解释镜像规则。由于光吸收在大约10-15的 短时间内发生，原子核没有发生明显的位移，即电子与核之 间的位移没有发生变化。假如在吸收过程中，基态的零振动 能级与激发态的第二振动能级之间的跃迁几率最大，那么， 在荧光发射过程中，其相反跃迁的几率也应该最大。也就是 说，吸收和发射的能量都最大。
了解荧光、磷光分析仪器的结构。
简介
一、基本原理
（一）荧光和磷光的产生 1.1 电子由基态跃迁激发态
S = 2Ssi + 1
一、基本原理
（一）荧光和磷光的产生
1.1 电子由基态跃迁激发态
处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中 一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上， 也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选 律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。 单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态 具有较低能级。
一、基本原理
单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s， 而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s 以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。
一、基本原理
1.2 激发态分子退激
辐射跃迁方式
无辐射跃迁方式
辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射
无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛 豫（VR）、内部转移（IR）、系间窜跃（IX）及外部转移 （EC）等
第二章 荧光光谱与磷光光谱
分子发光包括荧光、磷光、 化学发光、生物发光和散射光谱 等。
简述荧光与磷光的产生原理及应用
简述荧光与磷光的产生原理及应用
简述荧光与磷光的产生原理及应用，并说明有机物结构是如何影响荧光的。
具有荧光性的分子吸收入射光的能量后，其中的电子从基态（通常为自旋单重态）跃迁至具有相同自旋多重度的激发态。
处于各激发态的电子通过振动驰豫、内转移等无辐射跃迁过程回到第一电子激发单重态的最低振动能级。
然后再由这个最低振动能级跃迁回到基态时，发出荧光。
由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光。
荧光与磷光的根本区别：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。
荧光主要用于元素及有机化合物的荧光测定，照明，印刷防伪技术，生化和医药方面等。
磷光分析主要用于测定有机化合物，如石油产品、多环芳烃、农药、药物等方面。
有机物结构对荧光的影响主要有以下方面：（1）跃迁类型：相对于n-n *跃迁，n - n *跃迁能发出较强的荧光（较大的量子产率）。
（2）共轭效应：增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大。
（3）刚性平面结构：多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。
（4）取代基效应：给电子基团使荧光增强，吸电子基团，会减弱甚至会猝灭荧光；卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低；取代基的空间障碍对荧光也有影响；立体异构现象对荧光强度有显著的影响。
分子荧光和磷光光谱讲解ppt课件
GFP
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
Generation of Molecular Fluorescence and Phosphorescence
原理
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
荧光和磷光的产生过程
• 分子能级和跃迁
– 电子能级、振动能级和转动能级 – 基态（S0）→激发态(S1、S2、激发态振动能
级）：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位； – 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)； 速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
500
nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
分子产生荧光的条件
• 分子产生荧光必须具备的条件
– 具有合适的结构（强的紫外可见吸收） – 具有一定的荧光量子产率
荧光量子产率（）
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
内容(contents)
• 原理
– 分子荧光与磷光产生过程 – 激发光谱与荧光光谱 – 荧光的产生与分子结构关系 – 影响荧光强度的因素
荧光和磷光的产生过程
1．荧光和磷光(de)产生过程荧光：处于基态(de)分子吸收光子能量,跃迁至电子激发态,然后通过内转换和振动弛豫回到第一激发单重态(de)最低振动能级,最后跃迁回基态时发射(de)光激发态振动弛豫内转换振动弛豫发射荧光S磷光：处于基态(de)分子吸收光子能量,跃迁至电子激发态,然后通过内转换和振动弛豫和系间窜越到了第一激发三重态,最后回到基态时发射(de)光激发态振动弛豫内转换系间跨越振动弛豫S发射荧光2.激发光谱和发射光谱概念,有何异同（1）激发光谱：固定发射光(de)波长,测量激发光(de)波长与发射光强度之间(de)关系（选择最佳激发波长）（2）发射光谱：固定激发波(de)波长,测定发射光强度与发射光波长(de)关系（选择最佳发射波长）同：都是给样品能量使之发光测量发光强度异：控制(de)变量不同.3.化合物荧光与结构(de)关系a．具有一定(de)荧光量子产率b．具有合适(de)结构如：大(de)共轭π键、刚性平面结构、最低(de)单重电子激发态为S1 为ππ型、取代基为给电子基团4.荧光量子产率、荧光猝灭、系间跨越、振动弛豫A．荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收(de)光能转化为荧光(de)本领,是荧光物质发出光子数与吸收光子数(de)比值.B．荧光猝灭：指荧光物质与溶剂分子之间相互作用,导致荧光强度下降(de)现象,荧光猝灭分为静态猝灭、动态猝灭等.C．系间跨越：处于激发态分子(de)电子发生自旋反转而使分子(de)多重性发生变化(de)过程；分子由激发单重态跨越到激发三重态.D．振动弛豫：同一电子能级内异热交换形式由高振动能级至地振动能级间(de)跃迁.时间为10-12s5.实时定量PCR与普通PCR(de)区别所谓实时荧光定量PCR技术[1],是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析(de)方法.实时荧光定量PCR技术是起点检测,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号(de)强度,并记录在之中,通过对每个Ct值(de)计算,根据获得定量结果.具有重现性,误差小(de)特点.传统PCR技术是终点检测,即PCR到达平台期后进行检测,而PCR经过扩增到达平台期时,检测重现性.同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验,所得结果有很大差异,因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量.加入内标后,可部分消除终产物定量所造成(de)不准确性.但即使如此,传统(de)定量方法也都只能算作半定量、粗略定量(de)方法.6.简述影响荧光效率(de)主要因素1.。
荧光和磷光
S2
S1
T1
S0 吸光1
吸光2 荧光3
荧光
一、基本原理
系间窜跃
不同多重态间的无辐射跃迁， 例如S1→T1就是一种系间窜 跃。通常，发生系间窜跃时 ，电子由S1的较低振动能级 转移至T1的较高振动能级处 。有时，通过热激发，有可 能发生T1→S1，然后由S1发 生荧光。这是产生延迟荧光 的机理。
系间窜跃
在极稀的溶液中，当lc0.05时 If =2.3 I0 lc
当入射光强度I0 和l一定时，上式为： If = K c
较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因， 使荧光强度和浓度不呈线性关系
一、基本原理
（2）影响荧光强度的因素 ① 溶剂对荧光强度的影响
荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动能级回到基 态中各不同能级形成的。所以荧光光谱的形状决定于基态中各 振动能级的分布情况。
基态中振动能级的分布和第一电子激发态中振动能级的分布 情况是类似的。 因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极为 相似。
由基态最低振动能级跃迁到 第一电子激发态各个振动能级的 吸收过程中，振动能级越高，两个能级之间的能量差越大， 即激发所需的能量越高，所以吸收峰的波长越短。反之，由
在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无辐射跃 迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移动 ，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也相对较弱。
激发波长的选择与发射波长的判断
一、基本原理
2.3 荧光发射光谱的普遍特性：
（1）Stokes位移
在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长， 称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去能 量，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量 的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。
荧光和磷光的产生原理
荧光和磷光的产生原理
荧光是一种不发光的物质在受到紫外光、可见光或者其他射
线照射后，其内部的化学键会断裂，产生自由电子和空穴，在重
新结合时就会发出光。
荧光是一种很容易发光的物质，在一些适
当的条件下，这种物质可以发出很强的光。
所以磷光的强度远比
荧光强。
这种现象叫做磷光效应。
我们用荧光粉来做实验，就会看到荧光粉发出一束很强的绿光。
在磷光粉中加入适量的荧光粉就会产生荧光。
人们利用磷光光谱可以进行能量转换，用磷光粉来做光源时，发出的是绿光。
当把磷光粉和其他物质混合时就会产生出红光。
人们还利用磷光光谱可以检测到生物分子内电子转移及离子
对之间的交换等过程，如DNA分子中含有的电子转移、DNA复制
时的离子交换等过程都可以用磷光光谱来检测。
同时利用磷光粉
还可以用来做激光材料，例如用它做激光器时，就可以发出很强
的绿光和红光。
—— 1 —1 —。
第七章分子发光荧光与磷光
共振光散射
瑞利散射
二级共振光散射
拉曼光
三级共振光散射
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
l
三. 分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系
1. 荧光强度(磷光)与浓度的关系
光吸收定律（Lambert – Beer Law）
电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多为 S1→ S0
跃迁），发射波长为 l’2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长
长； l’2 > l 2 > l 1 ；
磷光发射：激发态分子经过系间跨跃达到激发三重态后，并经 过迅速的振动弛豫达到第一激发三重态(T1)的最低振动能级上， 从T1态分子经发射光子返回基态。此过程称为磷光发射。
❖ 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由 Jette和West提出了第一台荧光计。
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。
如S1到T1跃迁就是系间跃迁的例子，即单重态到三重态的 跃迁。即较低单重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠。 这种跃迁是“禁阻”的。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
辐射能量传递过程
荧光发射：当分子处于第一激发单重态S1的最低能级时，分 子返回基态的过程比振动弛豫和内转化过程慢得多。分子可 能通过发射光子跃迁回到基态S0的各振动能级上，这个过程 称为荧光发射。
荧光磷光产生的原理
荧光产生的必要条件
（1）物质的分子必须具有能吸收激发光的结构，通常是共轭双键结构。
（2）分子必须具有一定程度的荧光效率。所谓荧光效率是荧光物质吸光后所发射的荧光 量子数与吸收的激发光的量子数的比值。
荧光的应用
荧光分析法： 利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光，对物 质进行定性和定量分析。例如轻油、重油、原油等石油产品的硫含量测量等。
⑵磷光的产生 受激分子经激发单重态到三重态体系间跨越后，很快发生振动弛豫，到达 激发三重态的最低振动能级，分子在三重态的寿命较长（10-4~10S），所以可延迟一段时 间，然后以辐射跃迁返回基态的各个振动能级。
磷光的产生原理
磷光：S1* 体系间跨越 T1*(V=1,2,3……) 振动弛豫 T1*(V=0) 辐射 S0(V=1,2,3……)
荧光检测：是一种自然发光反应，通过荧光素酶与 ATP进行反应，可检测人体细胞、细菌、 霉菌、食物残渣，在15秒钟内得到反应结果。光照度通过专用设备进行测量，并以数字形 式予以表示，在1975年首先被应用到食品工业中，在1985年在化妆品制造业中得到应用。
磷光的产生原理
⑴体系间跨越 处于激发单重态较低振动能级的分子有可能发生电子自旋反转而使分子的 多重性发生变化，经过一个无辐射跃迁转移至激发三重态的较高振动能级上。
⑶外部能量转换 溶液中激发分子通过碰撞将能量转移给溶剂分子或其它溶质分子（常以 热能的形式放出），而直接回到基态的过程。这有可能使荧光和磷光的强度减弱甚至消失， 这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。
磷光的应用
磷光分析广泛用于药物分析，生物液中痕量药品的分析和吲哚衍生物、多环芳烃的 分析；结合气相色谱法，还可用于石油馏分中含氮和含硫的芳香族化合物的分析。采用 时间分辨磷光法，可在多环芳烃存在下检测杂环化合物。70年代以来，陆续提出一些室 温磷光技术，如吸附在滤纸、纤维素或硅胶上以及利用胶束溶液等，进一步扩大磷光分 析的应用范围。
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发生振动弛豫的时间10 -12 s
内转换：相同多重度电子能级间的无辐射能量传递过程。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级
7.1 荧光和磷光光谱的产生
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜跃
S1 能
T1 T2
量
荧
磷
吸
光
外转换
光
收
S0
l1
l 2 l 2
l3
外转换：激发分子与溶剂或其它分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁
荧光激发和发射光谱
7.1 荧光和磷光光谱的产生
Summary of the Key Points
物质吸收光后会被激发到激发态，激发态不稳定，会释放能量返回基态 若发生第一激发单重态的最低振动能级至基态的辐射跃迁，产生荧光 若发生第一激发三重态的最低振动能级至基态的辐射跃迁，产生磷光
如果某物质吸收光的波长为l 1，荧光波长为l 2，磷光波长为l 3，则三者的大小关系为 l 1<l 2<l 3
图中谱线（I）为激发光谱，谱线（II）为荧光光谱，谱线（III）为磷光光谱
7.1 荧光和磷光光谱的产生 练习2
判断题
通常情况，荧光光谱的最大发射波长随激发波长的改变而改变。 （X）
一般来说，改变激发波长，发射波长不变，因为荧光发射通常由S1最低振动能级 跃迁至基态。合成荧光材料时，一般希望激发光谱较宽，发射光谱较窄
延时荧光：某些物质的分子经系间窜跃至T1后，可能因相互碰撞或其他作用又回到S1 态 再发射荧光（T1 → S1 → S0跃迁）
7.1 荧光和磷光光谱的产生 练习1
左图为萘的荧光激发光谱，荧光发射光谱及磷光光谱，试指出对应关系。 荧光激发光谱是激发光（入射光，吸收光）的波长连续变化时，固定发射 波长，荧光强度随激发波长变化的谱图 荧光（发射）光谱指固定激发波长，荧光强度随发射波长变化得到的谱图
S2
能 量
S0 l1
内转换
振动弛豫
内转换
系间窜跃
S1
T1 T2
吸
荧 光
外转换
磷 光
收
l2
l 2
l3
基态用 S0 表示 S1 、S2 表示第一电子激发单重态、第二电子激发单重态 T1 、T2 表示第一电子激发三重态、第二电子激发三重态
7.1 荧光和磷光光谱的产生
电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M = 2s+1 s为电子自旋量子数的代数和(0或1) 当分子中两个电子自旋方向相反（成对自旋）时，s = 0, M = 1 单重态 当两电子自旋方向相同（平行自旋）时，s = 1, M = 3 三重态
① 大多数有机分子的基态处于单重态 （成对自旋） ② 三重态能级比相应的单重态能级略低（ S1能量高于T1 ） ③ 不同多重态之间的跃迁为禁阻跃迁 （例S1→T1的几率小）
7.1 荧光和磷光光谱的产生
激发态→基态的能量传递途径
处于S0态的分子吸收不同波长的光被激发到S1、S2态后，因为激发态不 稳定，分子要释放能量返回基态。能量释放可通过辐射跃迁(发光)和非 辐射跃迁等方式
发射磷光的可能过程：（S0 → T1禁阻跃迁） S0 →激发S2→振动弛豫→内转换S1 →系间窜越→振动弛豫→ T1
7.1 荧光和磷光光谱的产生
辐射能量传递过程
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜跃
S1 能 量
吸 收
T1 T2
荧
磷
光
外转换
光
S0
l1
l2 l3
l4
判断吸收光波长与荧光发射波长的大小 ΔE = hν = hc/λ 荧光发射波长大于吸收光波长 最大发射波长与最大激发波长之差为Stokes 位移 Stokes 位移越小，激发光对发射光的干扰越大 通常Stokes 位移大于20 nm，可进行荧光测定
Q：分子发光是如何产生的？荧光和磷光有什么区别？
7.1 荧光和磷光光谱的产生
分子发光的产生过程
室温下，大多数分子处于基态（ground electronic state）。处于基态的分 子吸收能量后会被激发到激发态（excited state）。激发态分子不稳定，会释 放能量返回基态。若返回基态伴随着光子的辐射，这种现象称为“发光”
第七章
荧光光谱分析法
Fluorescence Spectroscopy
青岛科技大学化学与分子工程学院 于锡娟
7.1 荧光和磷光光谱的产生
分子发光，2008年诺贝尔化学奖授予日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁·查尔菲Martin Chalfie，以及美国华裔科 学家钱永健。三人在绿色荧光蛋白（GFP）方面作出突出成就。
能量传递途径
辐射跃迁
非辐射跃迁
荧光 延时荧光 磷光 振动弛豫 内转换 外转换 系间窜跃
7.1 荧光和磷光光谱的产生
非辐射能量传递过程
内转换 振动弛豫 内转换
S2
系间窜跃
S1 能
T1 T2
量
吸
荧 光
外转换
磷 光Leabharlann 收S0l1
l 2 l 2
l3
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。
Types of Luminescence： 光致发光Photo-luminescence (Fluorescence荧光，Phosphorescence 磷光) 化学发光Chemiluminescence 生物发光Bioluminescence
7.1 荧光和磷光光谱的产生
分子能级图（Jablonski diagram）
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”
系间窜跃：不同多重态间的非辐射跃迁 禁阻跃迁
7.1 荧光和磷光光谱的产生
辐射能量传递过程
内转换
振动弛豫
内转换
S2
系间窜跃
S1 能 量
吸 收
T1 T2
荧
磷
光
外转换
光
S0
l1
l 2 l 2
l3
荧光：电子由第一激发单重态的最低振动能级→ 基态各个振动能级所产生的辐射光 （S1 → S0跃迁）荧光寿命 10-9～10 -6 s，瞬时荧光 磷光：电子由第一激发三重态的最低振动能级→ 基态（T1 → S0）磷光寿命10-4～10 s 入射光停止后，仍可持续一段时间