分子发光荧光与磷光

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荧光与磷光的基本原理

荧光与磷光的基本原理荧光和磷光是物质光致发光过程中常见的两种现象。

它们可以被用来检测材料的性质、追踪物质在生物体内的分布，以及在科学研究和工业中扮演着至关重要的角色。

本文将讨论荧光和磷光的基本原理，以及它们的应用。

一、荧光的基本原理荧光是一种光致发光现象。

当某些物质被激发时，它们会吸收能量，并在吸收后发射光子。

这个过程可以被描述为：M +hυ(excited state) → M* → M + hυ(emission) 。

其中M为物质，hυ为光子，excited state和emission分别表示激发态和发射态。

荧光在荧光检测和生物学研究中被广泛使用。

它可以用于探测药物、发现病毒、细菌和细胞，以及跟踪DNA和RNA等生物大分子。

荧光还有广泛的应用，如流式细胞仪、荧光显微镜等。

二、磷光的基本原理磷光是一种光致发光现象，与荧光相似。

它的过程可以被描述为：M + hυ(excited state) → M* → M + hυ(emission) 。

在此过程中，“excited state”可以分为单重态和三重态。

单重态和三重态分别对应于分子的不同电子的自旋状态。

在很多情况下，荧光和磷光都可以同时存在。

磷光通常比荧光持久，因为在它的发生过程中，光子被释放的能量不是来自分子的振动能，而是来自分子的旋转能。

在这种情况下，分子释放出的能量被分散到周围的基体中，而不是以光子的形式释放。

因此，磷光可以从几纳秒持续到数百微秒。

三、荧光和磷光的应用荧光和磷光的应用非常广泛，从材料科学到医学和环境科学。

在材料科学中，荧光和磷光被广泛用于表面分析、光辐射测量和固体物性等方面。

在医学中，荧光和磷光能够帮助识别肿瘤和病原体，优化药物筛选和治疗方法。

在环境科学中，荧光和磷光可以用于监测水体和土壤中的有机物和无机物质的分布和迁移。

值得注意的是，荧光和磷光的应用通常需要结合化学、光学、电子学和计算机学等多个领域的知识。

例如，荧光和磷光分析需要分析样品中的存在物种和激发条件，并根据荧光和磷光的特性来选择合适的检测设备和荧光染料。

荧光和磷光解析

一、基本原理
（1）螯合物中配位体的发光
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。
如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光
一、基本原理
（2）螯合物中金属离子的特征荧光这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致dd 跃迁和ff 跃迁，最终发射的是d*d跃迁和f *f 跃迁光谱。
一、基本原理
单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s 以上（通常用S和T分别表示单重态和三重态）。
一、基本原理
1.2 激发态分子退激辐射跃迁方式无辐射跃迁方式
辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射
无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫（VR）、内部转移（IR）、系间窜跃（IX）及外部转移（EC）等
一、基本原理
（3）镜像规则
通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。
S2
S1 T1
S0
吸光1
吸光2
荧光3
一、基本原理
（3）镜像规则通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能级形成的。其形状决定于第一电子激发态中各振动能级的分布情况。
激发波长的选择与发射波长的判断
一、基本原理
2.3 荧光发射光谱的普遍特性：（1）Stokes位移在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去能量，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。

第十一章分子发光―荧光、磷光和化学发光光谱法Molecular .

已逐步形成一支在这个研究领域中的工作队伍，研究内
容2已020从/6/15经典的荧光分析方扩展到新近发展起来的新技术。
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§11－1 分子荧光和磷光光谱法
1．产生机理
在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等到)后天激发为激发态。激发态是很不稳定的，它得很快地释放出能量又重新跃迁回基态。若分子返回基态时以发射的电磁辐射(即光) 的形式释放能量，就称为“发光”；如果物质的分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。现从分子结构理论来讨论荧光和磷光的产生机理。
进入二十世纪以后，荧光现象被研究得更多了，在理论或实验技术上都得到极大的发展。特别是随着激光、计算机和电子学的新成就及技术的引入，大大推动了荧光分析法在理论上及实验技术的发展，出现了许多新的理论和新的方法。
在我国，二十世纪五十年代初期仅有极少数的分析工作
者从事荧光分析方面的研究工作。到了下一张幻灯片
磷光也是某些物质受紫外光照射后产生的光。1944年 Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念，指出磷光是分子从亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光，它有别于从激发单态跃迁回基态所发射的荧光。磷光分析法由于其有某些特点，几十年来的理论研究及应用也不断得到发展。
2020/6/15
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处于分子基态单重态的分子轨道上的电子，激发时不能直接跃迁至第一激发三重态轨道上（不符合光谱选择定则），但处于单重激发态的轨道上的电子，可以通过体系跨越（系间窜跃），转移到三重态轨道上；在这个过程中，处于激发态的电子自旋发生变化，这个过程需要时间较长，故处于三重激发态的寿命为10－4~1s；当其由三重激发态的最低振动能级跃迁回基态时产生磷光。

第七章分子发光-荧光与磷光解读

激发光谱
发射光谱
l
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
400
450
蒽的激发光谱和荧光光谱
500 nm
三、荧光光谱的特征—激发光谱与发射光谱的关系
1、Stokes位移在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的吸收(或激发)光谱的波长长，荧光发射这种波长位移的现象称为Stokes 位移。处于激发态的分子一方面由于振动弛豫等损失了部分能量，
T1
紫外可见吸收光谱
紫外可见共振荧光 S0 光谱
S1
迟滞荧光
振动弛豫: Vr 10-12sec 外转移:无辐射跃迁回到基态内转移:S2~S1能级之间有重叠系间窜跃: S2~T1能级之间有重叠反系间窜跃:由外部获取能量后 T1 ~ S2
磷光
外转移
蒽的发射光谱
蒽的三维等高线光谱图
蒽的三维等荧光强度光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3.三维共振光散射光谱
ADS ATS ADS ATS RLS DS TS
RLS
DS
TS 散射片三维共振光散射光谱
固定lex=270nm
共振光散射瑞利散射拉曼光二级共振光散射三级共振光散射
500 550 600 650 700 750 800 850 900
2.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
S0→T1 禁阻跃迁；
通过其他途径进入

分子荧光与分子磷光

光与物质作用产生激发态分子，其返回基态时的发光现象称为光致发光，荧光和磷光都是光致发光。

多环芳烃和某些金属配合物分子结构中含有大平面丌电子共轭体系，是常见的荧光分子，可以直接进行荧光分析。

对于那些无荧光或荧光较弱的分子，通过与荧光试剂反应后可进行间接荧光分析。

分子荧光光谱法某些物质被紫外光照射激发后，在回到基态的过程中发射出比原激发波长更长的荧光，通过测量荧光强度进行定量分析的方法。

测定原理：由光源发射的光经第一单色器得到所需的激发光波长，通过样品池后，一部分光能被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发射荧光。

为了消除入射光和散射光的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行。

为消除可能共存的其它光线的干扰，如由激发所产生的反射光、Raman光以及为将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，在样品池和检测器之间设置了第二单色器。

荧光作用于检测器上，得到响应的电信号。

（1）激发光源在紫外-可见区范围，通常的光源是氙灯和高压汞灯。

（2）样品池荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英，形状以方形和长方形为宜。

（3）单色器光栅（4）检测器由光电管和光电倍曾管作检测器，并与激发光成直角。

荧光分析方法的特点：（1）灵敏度高（2）选择性强（3）试样量少和方法简单（4）提供比较多的物理参数荧光分析法的弱点是它的应用范围小。

因为本身能发荧光的物质相对较少，用加入某种试剂的方法将非荧光物质转化为荧光物质进行分析，其数量也不多；另一方面，由于荧光分析的灵敏度高，测定对环境因素敏感，干扰因素较多。

分子磷光光谱法处于第一最低单重激发态分子以无辐射弛豫方式进入第三重激发态，再跃迁返回基态发出磷光。

测定磷光强度进行定量分析的方法。

分子磷光与分子荧光光谱的主要差别是磷光是第一激发单重态的最低能层，经系间跨越跃迁到第一激发三重态，并经振动弛豫至最低振动能层，然后跃迁回到基态发生的。

与荧光相比，磷光具有如下三个特点：（1）磷光辐射的波长比荧光长，分子的T1态能量比S1态低。

分子发光—荧光、磷光和化学发光法

第5章分子发光—荧光、磷光和化学发光法(Molecular Emisssion and Luminescence)（3学时）教学目的和要求：1.学会分子发光——荧光、磷光和化学发光原理。

2.了解分子发光——荧光、磷光和化学发光法的特点和应用。

教学要点和所涵盖的知识点：荧光、磷光和化学发光原理、仪器、分析方法及应用重点和难点：荧光的原理、仪器、分析方法及应用。

分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。

发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。

物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。

第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。

荧光分析的特点：灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1~0.001μg/mL之间。

可见比UV-Vis 的灵敏度高得多。

选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。

结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。

应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。

二、基本原理1、分子荧光的产生处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。

这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。

单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。

在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s;而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4~1s以上(通常用S和T分别表示单重态和三重态)。

处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。

辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫( VR)、内部转移(IR)、系间窜跃(IX)及外部转移(EC)等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。

医学：分子荧光与分子磷光分析法

在疾病诊断和治疗中的应用
肿瘤诊断
荧光与磷光分析法可用于肿瘤的早期诊断和监测，通过检测肿瘤标志物或特定基因的表达水平，为肿瘤治疗提供依据。
感染性疾病诊断
药物疗效评估
荧光与磷光分析法可用于评估药物治疗的效果，通过监测疾病标志物的变化，了解药物治疗对疾病的影响。
荧光与磷光分析法可用于检测病原体和抗体，快速准确地诊断感染性疾病，如细菌、病毒和寄生虫感染。
06
未来展望
分析技术的发展趋势
智能化
01
随着人工智能和机器学习技术的快速发展，分析方法将更加智
能化，提高检测的准确性和效率。
高灵敏度
02
通过改进荧光和磷光的发光机制，提高检测的灵敏度，实现对
低浓度生物分子的快速检测。
多组分同时检测
03
发展多组分同时检测技术，实现对复杂生物样本中多种生物分
子的快速、准确检测。
在医学领域的应用前景
01
02
03
疾病诊断
利用荧光和磷光分析法对生物分子进行高灵敏度检测，为疾病诊断提供准确依据。
药物研发
通过荧光和磷光分析法对药物与生物分子相互作用进行研究，为新药研发提供有力支持。
个体化医疗
根据个体基因组、蛋白质组等信息的检测结果，制定针对性的治疗方案，实现个体化医疗。
在生物分子检测中的应用
蛋白质检测
荧光与磷光分析法可用于检测蛋白质的含量和性质，有助于研究蛋白质的功能和相互作用。
核酸检测
通过荧光与磷光分析法，可以检测DNA和RNA的含量和序列，用于基因诊断、基因表达研究和疾病诊断。
生物标记物检测
荧光与磷光分析法可用于检测生物体内的生物标记物，如肿瘤标志物、炎症标志物等，有助于疾病的早期发现和治疗监测。

第五章分子发光—荧光、磷光和化学发光法

2.化学发光效率
发射光子的分子数 cl ce em 参加反应的分子数
激发态分子数化学效率： ce 参加反应分子数
发光效率：
em
产生光子数激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
dc I cl t cl dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
目录
5-1 荧光和磷光光谱法
5-1-1 5-1-2 5-1-3 5-1-4 基本原理荧光分析仪器荧光分析方法的特点与应用磷光分析法
5-2 化学发光与生物发光分析法
5-1-1 基本原理
5-1-1-1 5-1-1-2 5-1-1-3 5-1-1-4 荧光和磷光的产生光谱曲线荧光的影响因素荧光强度的定量关系
5-1-1-4 荧光强度的定量关系
根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c 之间的关系是：
F 2.3kI 0 Fcl[1 (2.3cl) / 2! (2.3cl) 2 / 3! ]
k 与仪器有关的常数
I0 激发光的强度 F 荧光量子产率荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数 l 光程长度。
当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均可忽略不计，Parker方程可简化为： F 2.3kI 0 Fcl F = Kc
5-1-2 荧光分析仪器
5-1-2-1 荧光分析仪器框图
光源
消除溶液中可能共存的其它光线的干扰,以获得所需要的荧光.
显示
激发光单色器
信号处理
I0
样品池 F 发射光单色器 (荧光单色器) 检测器
4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量） NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h

分子荧光和磷光光谱讲解ppt课件

GFP
为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
Generation of Molecular Fluorescence and Phosphorescence
原理
为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
荧光和磷光的产生过程
• 分子能级和跃迁
– 电子能级、振动能级和转动能级 – 基态（S0）→激发态(S1、S2、激发态振动能
级）：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； – 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
500
nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
分子产生荧光的条件
• 分子产生荧光必须具备的条件
– 具有合适的结构（强的紫外可见吸收） – 具有一定的荧光量子产率
荧光量子产率（）
为了规范事业单位聘用关系，建立和完善适应社会主义市场经济体制的事业单位工作人员聘用制度，保障用人单位和职工的合法权益
内容(contents)
• 原理
– 分子荧光与磷光产生过程 – 激发光谱与荧光光谱 – 荧光的产生与分子结构关系 – 影响荧光强度的因素

90350-仪器分析-第八章分子发光分析法

禁阻跃迁． • 磷光发射过程：由第一激发单重态的最低振动能级，
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。
3、荧光/磷光光谱曲线
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
• 激发光谱曲线-荧光强度与激
发光波长的关系
• 固定测量波长为荧光/磷光的最大发射波长，改变激发波长，测量荧光或磷光强度；
荧光发射光谱荧光激发光谱
磷光光谱
• 荧光或磷光光谱曲线-荧光
或磷光强度与发射光波长的关系
• 固定激发光波长为其最大激发波长，测量发射不同波长的荧光或磷光强度．
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
4. 荧光、磷光与分子结构的关系
荧光激发光谱荧光发射光谱
200 蒽25的0 激30发0光3谱50和4荧00光4光50n谱m500
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量
子产率( f）的关系：
If = Ia
由朗伯-比耳定律：
A=lg（I0/ It）， Ia= I0- It
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
9. 影响分子发光的环境因素
a.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；
b.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。
c. 溶液pH
酸碱化合物受溶液pH的影响较大，需要严格控制.
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法

分子发光

(三)荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件（1）合适的结构（芳环/多个共轭双键）（2）一定的荧光量子产率发射的光量子数
吸收的光量子数
一般在0.1－1之间；凡是使荧光增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率；荧光强度由分子结构（内因）和所处化学环境（外因）共同决定
（二）激发光谱与荧光光谱
1 激发光谱改变激发波长，测量在最强荧（磷）光发射波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程。激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长
（二）磷光的特点 • 磷光波长比荧光的长(T1<S1)�� • 磷光寿命比荧光的长(磷光为禁阻跃迁产生，速率常数小) • 磷光寿命和强度对重原子和氧敏感
（三）荧光分析法的应用 1 无机化合物的分析铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法
荧光试剂/探针
2
生物与有机化合物的分析
3. 室温磷光低温荧光需低温实验装臵且受到溶剂选择的限制 1）固体基质：在室温下以固体基质（如纤维素等）吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率 2）胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性。利用胶束增稳、重原子效应和溶液除氧是该法的三要素
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型： *→n和*→，后者的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，利于产生荧光（2）共轭效应：共轭利于增加荧光效率产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互碰撞作用，共轭分子共平面性增强，故具有很强的荧光

第七章分子发光荧光和磷光

❖ 1867Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。
❖ 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928Jette和 West提出了第一台荧光计。
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
内转换
振动弛豫内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸收
发
射
外转换
荧
光
发
射
磷振动弛豫光
S0
l3 l 1 分子吸收l 2和发射l 过2 程的Jablonski能级图
非辐射能量传递过程
振动弛豫：在凝聚相体系中，被激发到激发态(如S1和S2)的分子能通过与溶剂分子的碰撞迅速以热的形式把多余的振动能量传递给周围的分子，而自身返回该电子能级的最低振动能级，这个过程称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间10 -12 s。内转换：当S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上。这个过程称为内转换。内转换发生的时间约为10 -12 s。内转换过程同样也发生在激发态三重态的电子能级间。
?直到1852年年stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光而不是由光的漫射作用所引起的从而导入了荧光是光发射的概念他还由发荧光的矿石萤石推演而提出荧光这一术语
第七章分子发光荧光和磷光
§7.1 分子发光的基本原理

LS-45／55 荧光／磷光／发光分光光度计使用说明书

ＬＳ－４５／５５荧光／磷光／发光分光光度计使用说明书美国Perkin Elmer公司王国强黄建权编译２００２年４月一、理论基础荧光、磷光、化学发光及生物发光均属于分子发光。

现将其原理简介如下：室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。

处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态。

激发态不稳定，将很快衰变到基态。

若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象被称为“发光”。

每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级，而每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转动能层。

图中基态用Ｓ０表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重态分别用Ｓ１、Ｓ２表示，０、１、２、３…表示基态和激发态的振动能层（见图１），第一、二电子的激发三重态分别用Ｔ１和Ｔ２表示（见图２）。

图１荧光的能级图１、荧光的产生当分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活化过程的一种形式是以１０－９～１０－６秒左右的短时间内发射一个光子返回基态，这一过程称为荧光发射（见图１）。

２、磷光的产生从单重态回到三重态的分子系间跨越越迁发生后，接着发生快速的振动驰豫而到达三重态的最低振动能层上，当没有其他过程同它竞争时，在１０－４～１０２秒左右的时间内跃迁回基态而发生磷光（见图２）。

由此可见，荧光与磷光的的根本区别是：荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振动能层的跃迁产生的，而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。

图２磷光的能级图３、化学发光及生物发光的产生某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出了一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。

化学发光也发生于生命体系，这种发光被称为生物发光。

二、仪器简介１、仪器原理图３ＬＳ４５／５５荧光／磷光／发光分光光度计的原理图用于测量荧光／磷光／发光的ＬＳ４５／５５是由图３所示的五个主要部件组成的：光源、激发光单色器、样品池、发光单色器及检测器。

分子发光分析法

分子发光分析法基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(Molecular Luminescence)。

依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。

光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。

本章讨论分子荧光(Molecular Fluorescence)、分子磷光(Molecular Phosphorescence)和化学发光(Chemiluminescence)分析法。

第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。

早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。

这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。

到1852年才由斯托克斯(Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。

斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。

1867年Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。

进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。

荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。

虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。

使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。

二、基本原理(一)分子荧光的产生大多数分子含有偶数电子。

根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态(2S+1=1)，基态单重态以S0表示。

当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以S1、S2表示。

第七章分子发光-荧光与磷光

x x2 x3 x4 xn ex 1 1! 2! 3! 4! n!
( 2.30 ε bC )2 ( 2.30 ε bC )3 ( 2.30 ε bC )4 I F I 0 ( 2.30 ε bC ) 2! 3! 4!
荧光
斯托克斯荧光(Stokes)： λex < λem 反斯托克斯荧光 (Antistokes)：λex > λem 共振荧光(Resonance)： λex = λem
分子的活化与去活化
振动弛豫
S2
内转移荧光
反系间窜跃
系间窜跃
１. 辐射跃迁的类型共振荧光：10-12 sec 荧光：10-8 sec 磷光：1~10-4 sec 迟滞荧光:102~10-4 sec ２. 无辐射跃迁的类型
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越内转移
外转移
振动弛预
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ；第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；

荧光现象和磷光现象名词解释

荧光现象与磷光现象：荧光现象：是指叶绿素在透射光下为绿色，而在反射光下为红色的现象，这红光就是叶绿素受光激发后发射的荧光。

叶绿素溶液的荧光可达吸收光的10%左右。

而鲜叶的荧光程度较低，只占其吸收光的0.1~1%左右。

产生原因：（1）对着光源观察叶绿素提取液时，看到的是叶绿素的吸收光谱。

由于叶绿素提取液吸收的绿光部分最少，故用肉眼观察到的为绿色透射光。

（2）背光源观察叶绿素提取液时，看到的是叶绿素分子受激发后所产生的发射光谱。

当叶绿素分子吸收光子后，就由最稳定的、能量最低的基态提高到一个不稳定的、高能量的激发态。

由于激发态不稳定，因此发射光波(此光波即为荧光)，消失能量，迅速由激发态回到基态。

叶绿素分子吸收的光能有一部分用于分子内部振动上，辐射出的能量就小。

由“光子说”可知，光是以一份一份光子的形式不连续传播的，而且E=hv= hc/λ，即波长与光子能量成反比。

因此，反射出的光波波长比入射光波的波长长，叶绿素提取液在反射光下呈红色。

叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象叫做荧光现象。

由实验现象及观察结果得出结论：观察叶绿素提取液时，对着光源将看到试管内提取液呈绿色；背着光源将看到试管内提取液呈红色。

磷光现象：是指在激发源停止作用之后可感觉到的具有特征衰减率的发冷光现象。

当去掉光源后，叶绿素溶液还能继续辐射出极微弱的红光，它是由三线态回到基态时所产生的光，这种发光现象称为磷光现象。

人或动物的尸体在腐烂的过程中，磷就会以联磷或磷化氢气体形式钻过土壤，钻出地面。

磷在空气中缓慢氧化，当表面聚集热量达40摄氏度时，引起自燃，部分反应能量以光能的形式放出，这就是磷在暗处能发光的原因，叫“磷光现象”。

分子发光—荧光、磷光和化学56页PPT

39、没有不老的誓言，没有不变的承诺，踏上旅途，义无反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识的人，决不会坚韧勤勉。
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分子发光—荧光、磷光和化学
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只在愚人的字典破，不要嫉妒要欣赏，不要托延要积极，不要心动要行动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要素。(注意：传统观念认为勤奋和机会是成功的要素，但是经过统计学和成功人士的分析得出，乐观是成功的第三要素。

第七章分子发光荧光与磷光

共振光散射
瑞利散射
二级共振光散射
拉曼光
三级共振光散射
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
l
三. 分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系
1. 荧光强度(磷光)与浓度的关系
光吸收定律（Lambert – Beer Law）
电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为 S1→ S0
跃迁），发射波长为 l’2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长
长； l’2 > l 2 > l 1 ；
磷光发射：激发态分子经过系间跨跃达到激发三重态后，并经过迅速的振动弛豫达到第一激发三重态(T1)的最低振动能级上，从T1态分子经发射光子返回基态。此过程称为磷光发射。
❖ 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由 Jette和West提出了第一台荧光计。
一、荧光与磷光的产生过程
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。
如S1到T1跃迁就是系间跃迁的例子，即单重态到三重态的跃迁。即较低单重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠。这种跃迁是“禁阻”的。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
辐射能量传递过程
荧光发射：当分子处于第一激发单重态S1的最低能级时，分子返回基态的过程比振动弛豫和内转化过程慢得多。分子可能通过发射光子跃迁回到基态S0的各振动能级上，这个过程称为荧光发射。