液质联用分析重组人白细胞介素-11的肽图

去溶剂气体为氮气； 去溶剂气体温度 )F* Q ； 源温度 ;* Q ； 飞行管电压 F <C* V， G/. 电压 )N C AV， 去溶 W7% 源流速 "* !&・956 O " 。 剂气体流速 +** &・$ O " ； 设置当 X.&/ 洗脱的肽段在 W7%!H!-L= Y G7 中的离 子强度达到 F* 以上就进入 G7 Y G7 状态。
・ ,F,・
重组人白细胞介素!"" （ #$%&!"" ） 为血小板生长 因子， 可刺激造血干细胞和巨核细胞母细胞的增殖， 并诱导巨核细胞的成熟， 从而增加血小板的生成。 本文在文献 ［"］ 的基础上， 用液质联用技术对重组 人白细胞介素!"" 经胰蛋白酶裂解后的肽图进行研 究， 可以更快速、 直接和准确地判断出每个洗脱峰的 肽段归属， 而不仅仅是对 ’ 端的判定， 为其质量分 析和控制提供了依据。
［ +］
同位素峰的间距为 " 个 ! " #。同时由于分子在 W7%! H!-L= Y G7 中易产生多电荷， 所以还可以观察到双 电荷峰， 如图 )T 所示， 其相邻两个同位素峰的间距 为 *N F 个 ! " #， 说明其带有两个电荷 （ 电荷数 \ " Y 相 邻两个同位素峰的 ! " # 值之差） 。通过分析这样的 特征峰可得出肽段的相对分子质量为 " )"<N ;* ， 与 理论值对比， 可判定此肽段为 -C 。 2" $%&’()*+(,(-./(1* 0 1* 对肽段氨基酸序列 的测定 液相色谱与电喷雾电离串联质谱仪联用能够在 线、 快速灵敏地测定蛋白质酶切后不同肽段的部分 氨基酸序列， 使得肽段的确认更为可靠。图 C> 是 ! " # BF,N ,C 的肽段的双电荷峰， 由于双电荷峰的丰 度一般比较高且容易进行碰撞诱导解离 （ /%S） 而形
[ 峰见图 ) 。图 )> 是单电荷峰 ［ G [ X］ ， 相邻两个
材料和方法
材料( #$%&!"" （ 供试品， 批号 )**+*,*" ） ， -./0 处理的胰蛋白酶 （ -./0!1#23456， 7589: -;<+) ） ， 甲酸 （ =>， =?@A: B+C"; ） ， 三氟乙酸 （ -=>， -DE5: -7+)BF ） ， 色谱纯乙腈 （ >/’， 7589: 公司） ， 实验用水为 G5??5!H 超纯水， 其他试剂均为分析纯。 仪器和设备( 美国 I:1D#4 >??5:6JD 高效液相系 统 )<BF 型 和 二 极 管 阵 列 检 测 器 )BB< 型， 英国 G5J#K9:44 公司的 H!-L= 95J#K 质谱仪， 美国 I:1D#4 G:44?26M +N * 液 质 联 用 分 析 软 件，美 国 I:1D#4 7299D1#2 C** /"; 色谱柱。 胰蛋白酶酶切条件 ( 参 照 文 献 ［"］ 报道的方 法， 取质量浓度为 C 98 ・ 9& O " 的 #$%&!"" 样品 +** 对 "P 碳酸氢铵溶液进行充分透析， 然后取透析 !&， O" 样品 )F* !&， 加入 " 98・9& -./0 处理的胰蛋白 酶 C !&， C, Q 水浴 )* $ 进行酶解。"** Q 煮沸 C 956 终止酶解反应， 离心收集上清液作为肽图测定 的样品溶液。 色谱条件 ( 采用 I:1D#4 7299D1#2 C** /"; （ "F* 99 R CN B 99 %S， F !9 ） 色谱柱， 流动相 > 液为含 *N "P 三氟乙酸的水溶液， T 液为含 *N "P 三氟乙酸 的乙腈溶液， 洗脱梯度
收稿日期： >##$%">%#6@ 基 金 项 目：国 家 高 技 术 研 究 发 展 计 划 （ =?: 计 划） 资助项目 （ >##:99>A:<=# ） @ ! 通讯作者! 0BC： =? ; "# ; ?6#5$$=? ， 2DE： =? ; "# ; ?6#$"5"> ， -%FDGC：HIHGJKI66L HD’MM@ NMF@ NJ
［ :］ 结果 。此外， 近年来发展的串联质谱仪 （ 4. 3 4.） ，
使质谱用于生物分子结构分析的功能进一步增强， 它能快速灵敏地测定肽段的部分氨基酸序列， 使得 肽段的确认更加准确， 极大地提高了蛋白质鉴定的
［ <］ 。 准确性
万方数据
杨( 英等： 液质联用分析重组人白细胞介素!"" 的肽图
/34567 ! ( >956K :J5E 4D]@D6JD J$:56 K^ #$%&!"" :6E 3D315ED ^#:89D614 _2 1#23456 E58D415K6
万方数据
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药学学报 2&8’ O.’/$’&-38*&’ >*(*&’ KFFS ， EN （T） ： ;:S W ;SF
［ "］ 析， 工作量较大 。采用液质联用技术， 就可以很 ［ >］ 。电喷雾电离质谱 （ -.( 3 4. ） 好地解决这些问题
可与液相色谱直接联用， 在线检测 *+), 分离出的 每一肽段的相对分子质量， 将其与所得肽段的理论 值比较， 就能确定 *+), 上的洗脱峰代表了蛋白质 中的哪个肽段， 从而得到完整而精确的肽质量图谱
!"#$%& ’ ! "##$ %&’( #) %*$+,- &.’/0-1 *#(（ 2）’(1 1#34,- &.’/0-1 *#(（ 5 ）#) 67
!"#$%& ( ! "##$ %&’( #) 1#34,- &.’/0-1 *#( ’8 ! " # 9:;< ;7（ 2）’(1 &#,,*%*#( *(13&-1 1*%%#&*’8*#( #) ! " # 9:;< ;7（ 5） 成碎片离子，所以通常选择肽段中高丰度的双电荷 分子离子作为母离子进行 => ? => 测序。母离子在 质谱仪的碰撞室经高流速惰性气体碰撞解离， 沿肽 链在酰胺键处断裂并形成子离子。肽键断裂时， 会 产生 ’， 4， & 型系列离子 （ 保留肽链 @ 末端， 电荷留 在 A 端） 和 B， C， D 型系列离子 （ 保留肽链 A 末端， 电 荷留在 @ 端） 。ຫໍສະໝຸດ Baidu 75 是 ! " # 9:;< ;7 的母离子的碎 片离子峰的 => ? => 图。利用 =’%%,C(B E< F 软件通 过分析 C 系列离子的 ! " # 之差， 可以获得氨基酸的 相对分子质量， 从而得到肽段的氨基酸序列。图 75 是用此种方法标记出了这个肽段的部分氨基酸序 列： G*%H2,’HI-3HI-3HJ,CHJ,CHI-3HG*%HI-3H6./HI-3H 2%+ （ @ 端HA 端） 。这条肽段序列的特点是亮氨酸 （ I-3） 所占比例较大， 而在组成蛋白质的 KF 种常见 氨基酸中， 亮氨酸和异亮氨酸 （ L,- ） 是较特殊的一 对， 由于它们是同分异构体， 相对分子质量完全相 同， 所以质谱序列分析软件不能进行分辨。为防止 同分异构体的误判， 将这条序列中的亮氨酸与异亮 氨酸互换后上网在 =2>AM6 数据库中检索， 发现经 软件所标记的第 7 个氨基酸应为异亮氨酸 （ L,- ） ， 而 这个肽段就是 6N9 。 万方数据 对于高精度的质谱仪， 匹配了分子质量就可以 较好地进行分子的确认， 但如果出现两种肽或蛋白 有相同或极为相近的分子质量， 还可以通过 GOIAH P>LHQH6MR ? => ? => 分析肽段氨基酸序列并结合数 据库检索的方法来进行判断， 这对于判定已知蛋白
结果和讨论
!" 理论酶切结果分析 经 -./0 处理的胰蛋白酶专一性酶切位点在肽 链中赖氨酸 （ 0， &24 ） 和精氨酸 （ Z， >#8 ） 的羧基端。 #$%&!"" 理论氨基酸全序列见图 " ， 共有 ",, 个氨基 酸， 胰蛋白酶完全水解后理论上可以产生 )) 个肽段 或氨基酸。图 " 中 -" U -)) 为 )) 个肽段的编号及 所在位置， 标在每个肽段的羧基端。 #" $%&’()*+(,(-./ 0 1* 对肽段相对分子质量的 测定 胰蛋白酶酶切过的肽段， 经过 X.&/ 的分离后 依次进入质谱进行检测。每一个洗脱峰均可获得相 应组分的相对分子质量信息。例如色谱洗脱时间为 )CN <+ 956 的肽段在 W7%!H!-L= Y G7 中产生的特征
#$%&’($ )*%%’+, *+*-./’/ 01 2$30)4’+*+& 56)*+ ’+&$2-$67’+!"" 8’&5 9#:;!<=>!?!@AB C D= /%$3&20)$&2.
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液质联用分析重组人白细胞介素 !"" 的肽图
杨! 英，饶春明，王! 威，韩春梅，王军志 !
（ 中国药品生物制品检定所，北京 "###$# ） （ &’()%"" ） 的肽图。方法 ! 用胰蛋白酶酶解 &’()% 摘要：目的 ! 用液质联用技术分析鉴定重组人白细胞介素%"" "" ， 采用 *+), 测定肽图， 用电喷雾%四极杆%飞行时间质谱 （ -.(%/%012 3 4.） 技术分析肽段的精确相对分子质量， 通过 串联质谱 （ 4. 3 4.） 测定肽段的氨基酸序列。结果! 根据肽段的色谱保留时间、 相对分子质量及对其碰撞诱导解离 质谱的解析结果， 归属出肽图中各肽段所在的色谱峰， 已检出肽段的总覆盖率为 567 。结论 ! 液质联用研究肽图是 验证和分析蛋白质结构的高效准确的方法。 关键词：液相色谱%质谱联用；重组人白细胞介素%"" ；相对分子质量；肽图；氨基酸序列 中图分类号：85"6! ! ! 文献标识码：9! ! ! 文章编号： #$": ; <=6# （ >##? ） #= ; #6$? ; #$
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