补体检测及其应用安徽理工大学

安徽理工大学医学院（教案续页）基本内容辅助手段和时间分配备注第一节补体系统的性质与活化途径一、补体系统的组成与性质补体(complement，C)是存在于人和脊椎动物血清及组织中的一组具有酶样活性、不耐热和功能上连续反应的球蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，故称为补体系统。

补体并非单一成分，而是由补体及其调节因子和相关膜蛋白以及补体受体共同组成的补体系统。

补体系统广泛参与机体的抗感染防御反应，具有介导细胞溶解、调理吞噬、免疫黏附以及参与炎症反应引起机体免疫损伤等作用，是体内具有重要生物学功能的免疫效应和放大系统。

补体系统由30多种活性成分组成，按其性质和功能可以分为三大类：①补体系统的固有成分；②以可溶性或膜结合形式存在的补体调节蛋白；③结合补体片段或调节补体生物学效应的补体受体受体(complement receptor，CR)。

由于由于补体系统组成和功能的复杂性，其命名较为复杂，一般有以下规律可循：参与补体经典邀活途径的固有成份，按其被发现的先后次序命名为C1、C2、……C9，其中Cl由Clq、Clr、Cls三种亚单位组成；补体系统的其他成分以英文大写字母表示，如B因子、D因子、P因子、H因子；补体调节蛋白多以功能命名，如Cl抑制物、C4结合蛋白和膜协同因子蛋白等；补体活化后的裂解片段，以该成分的符号后面附加小写英文字母表示，如C3a、C3b等；具有酶活性的成分或复合物，在其符号上划一横线表示，如Ci、C—3bB—b等；灭活的补体片段，在其符号前加英文字母i表示，如iC3b。

补体性质不稳定，易受各种理化因素影响，加热、紫外线照射、机械振荡或某些添加剂等理化因素均可能破坏补体。

在0-10℃补体活性可保持3～4天，冷冻干燥可较长时间保持其活性，加热56℃30 min即被灭活，所以补体活性检测标本应尽快进行测定。

补体多为糖蛋白，且多属于B球蛋白，少数为7球蛋白或a球蛋白，其中Clq分子量最大，D因子最小。

正常血清中补体各组分含量相差较大，以C3含量最多，D因子最少。

二、补体活化途径补体系统各组分通常以非活性的酶前体形式存在，只有在某些活化物的作用下，补体各组分便产生连锁酶促反应，又称级联反应，才表现出生基本内容辅助手段和时间分配备注物活性。

补体激活过程依据其起始顺序的不同可分为三条途径：①经典途径(classical complement pathway)；②甘露聚糖结合凝集素(mannan binding lectin MBL)途径；③旁路途径(alternative pathway)。

三条激活途径具有共同的末端通路，即膜攻击复合物(membrance attack complex，MAC)的形成及其溶解细胞效应。

(一)经典激活途径补体经典途径的激活物质主要是IgGl、IgG2、IgG3和IgM类抗体与相应抗原形成的免疫复合物(immunecomplex，IC)，激活过程从Clq开始，一个Clq分子必须同时有两个以上的球形头部与Ig分子的补体结合点结合后，才能被激活。

IgG为单体，必须要有两个以上的IgG分子才能激活Clq，而IgM分子为五聚体，含5个补体结合点，故一个分子IgM与抗原结合后即可激活Clq。

整个激活过程可分为两个阶段：识别阶段和活化阶段。

1．识别阶段在抗原抗体形成复合物后，抗体发生构象改变，使Fc段的补体结合位点暴露，与Clq结合后，进一步激活Clr和Cls，Cls具有酯酶活性。

识别阶段即指C1识别免疫复合物至C1酯酶即Cls形成的阶段。

2．活化阶段活化的Cls依次裂解C4和C2，形成具有酶活性的C3转化酶(C4b2b)，后者进一步裂解口并形成C5转化酶(C—4b2—b3b)，C5转化酶可裂解C5，引起共同的末端效应。

此即经典途径的活化阶段。

(二)甘露聚糖结合凝集素(MBL)激活途径MBL激活途径的激活物是在病原微生物感染早期体内炎症反应诱导肝细胞产生的急性期蛋白，如甘露聚糖结合凝集素(MBL)和C反应蛋白，而不是抗原抗体形成的免疫复合物。

正常人血清中MBL水平极低，炎症急性期反应时，其水平明显升高，MBL在结构上与Clq类似。

MBL先与细菌的甘露糖残基结合，然后与丝氨酸蛋白酶结合，形成MBL相关的丝氨酸蛋白酶(MBL-associated serine protease，MASP)，MASP具有与活化的Clq同样的生物活性，可水解C4和C2，继而形成C3转化酶，其后的反应过程与经典途径相同，依次激活其他成分。

(三)旁路激活途径在旁路途径中C1、C4和晓不参与，而是从激活C3开始，故又称为C3途径或替代途径。

旁路途径的激活物质主要是细菌细胞壁的脂多糖、酵母多糖和凝聚的IgA和IgG4，主要通过为补体的活化反应提供固相接触界面而实现其激活作用。

这种激活方式不依赖于特异性抗体的形成，从而在感染早分配备注期为机体提供有效的防御机制。

1．旁路C3转化酶的形成C3是启动旁路途径并参与其后级联反应的关健分子。

在经典途径中产生或自发产生的C3b可与B因子结合，血清中的D因子将结合状态的B因子裂解成Ba和Bb，Ba释放入液相，Bb仍附着于C3b，形成C—3bB—b复合物即旁路途径的C3转化酶。

C3转化酶具有酶活性，可裂解C3，但它极不稳定，极易被H因子和I因子作用而灭活，血清中备解素(properdin，P因子)可与之结合，使其稳定。

2．C5转化酶的形成旁路途径的激活物如细菌的脂多糖或酵母多糖出现时，C3转化酶裂解C3产生的C3b分子可与C3转化酶结合形成新的复合物C—3bn—Bb或C—3bnB—bP，即C5转化酶，C5转化酶裂解C5，至此以后的过程与经典途径相同，引起共同的末端效应。

3．C3正反馈循环补体活化过程中形成的C3转化酶不断使C3裂解，生成大量的C3b，新产生的C3b又可与B因子结合，扩大进一步的活化，构成了一个正反馈的循环圈，放大了补体的激活作用。

由于经典途径产生的C3b也能触发旁路途径，故旁路途径C3转化酶对经典途径补体活化也是一种放大机制。

(四)补体激活的共同末端效应三条补体激活途径形成的C5转化酶均可将C5裂解为C5a和C5b，C5b与细胞膜结合，继而结合C6和凹形成C5b67复合物，该复合物吸附C8，又形成C5b678复合物，当12～19分子的C9加入后，便形成C5b6789复合物，即膜攻击复合体(MAC)，MAC最终导致细胞内渗透压降低，细胞溶解。

在体内生理条件下三条途径密切相关，都以C3活化为中心。

第二节补体总活性测定一、血清补体总活性测定(CH50试验)(一)实验原理绵羊红细胞与相应抗体即溶血素结合的复合物可激活血清中的补体导致红细胞肿胀而发生溶血，溶血的程度与补体的活性呈正相关，但非直线关系。

在一个适当的、稳定的反应系统中，溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线。

以溶血百率为纵坐标，相应血清量为横坐标，可见有轻微溶血和接近完全溶血时，补体量的变化不敏感，但在30％～70％之间两者近似直线关系，此阶段对补体量的变化非常敏感，故实验中常以50％分配备注溶血作为最敏感的判定终点，以引起50％溶血所需要的最小补体量为一个CH50 U，可计算出待测血清中总的补体溶血活性，以CH50 U／ml表示。

(二)实验方法取新鲜血清标本进行检测，按表19-2的要求在各管中加入试剂和反应物，与配制的50％溶血的标准管一起放入37℃水浴箱温育30 min后2 500 r／min离心5 min，选择溶血程度与标准管最为相近的两管，在分光光度计上检测(波长542 nlTl、0．5 ClTI比色杯)OD值，以最接近标准管OD值的一管为终点管，然后按公式计算CH50值：CH50(U／m1)=(1／血清用量)×稀释倍数。

50％溶血标准管的配制：2％绵羊红细胞悬液2 r11l加8 ml蒸馏水，混匀，即为全溶血管，取全溶血管12 nll加巴比妥缓冲液2 ml即为50％溶血管。

(三)方法评价及临床意义方法简便快速，但敏感性较低，主要反映补体经典激活途径的溶血功能，所反应的是补体Cl～C9成分的综合水平。

CH50正常参考值50～100 U／ml。

①增高见于急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等；②降低见于急性肾小球肾炎、SLE活动期、RA、亚急性细菌性心内膜炎、严重肝病。

二、旁路途径溶血活性(APH50)测定(一)实验原理未致敏的家兔红细胞可激活血清中的B因子，引起旁路途径活化，导致兔红细胞溶解。

当红细胞量一定时，在规定反应时间内，溶血程度与血清中参与旁路激活的补体量及活性呈正比。

与CH50测定相似，以引起50％溶血所需要的最小补体量为一个APH50 U，可计算出待检血清中补体旁路激活途径的溶血活性，以APH50 U／ml表示。

(二)方法评价本法主要反映旁路激活途径的溶血功能，其结果与C3、B因子、P因子、D因子及C5～C9各组分量及活性有关。

第三节单个补体成分的测定根据世界卫生组织和国际免疫学会报告，在30多种补体成分中，主要检测C3、C4、Clq、B因子和C1酯酶抑制物。

测定方法可分为溶血法和免疫化学法。

一、免疫溶血法溶血法主要根据抗原与其特异性抗体结合后可激活补体的经典途径，导致细胞溶解。

该方法中抗原为SRBC、抗体为兔或马抗SRBC的抗体，即溶血索。

将两者组合作为指示系统参与反应。

试验中有两组补体参与，一组分配备注是作为实验反应系统的补体，选用或制备缺少待测成分的试剂，此类试剂，选用先天缺乏某单一补体成分的动物或人血清，也可利用化学试剂人为灭活正常血清中某种成分制备缺乏该成分的补体试剂；另一组为待测血清中的补体，当加入待测血清，使原来缺乏的成分得到补偿，补体成分齐全级联反应恢复，产生溶血。

溶血程度与待测补体成分活性有关，仍以50％溶血为终点。

免疫溶血法检测的是某补体的活性，而不是具体的含量。

检测待测标本中某一单个补体成分是否缺乏，可以帮助诊断补体某个成分缺失或其含量正常但无溶血活性的先天性补体缺陷。

该法无需特殊仪器设备，快速，但敏感性较低，影响因素多。

二、免疫化学法免疫化学法分为单向免疫扩散法、火箭免疫电泳、透射比浊法和散射比浊法。

前两种方法多用手工操作，匆响因素多，结果重复性差，已逐渐淘汰。

后两种方法根据补体与相应的抗体结合形成复合物，仪器通过对复合物产生的光散射或透射信号进行自动检测而得出所测补体的浓度，此法方法简单、重复性和特异性好，可反映所测补体成分的含量，进行标准化流程管理、是目前补体的主要检测方法。

第四节补体结合试验如果反应系统中存在待测的抗体(或抗原)，则抗原抗体发生反应后可结合补体，再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，此为补体结合试验阳性。

如果反应系统中不存夸待测的抗体(或抗原)，则液体中有游离的补体，与加入的指示系统结合出现溶血，此为补体结合试验阴性。