高效液相色谱技术培训
高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训
改变α是改变后一组分相对于前一组分的保 留时间。α的改变可以选择不同的固定相或
流动相来实现。但改变固定相在液相色谱 中比较麻烦。如在一个色谱系统中,用二根 不同固定的柱子,则又必须考虑到流动相的
适应性。比较行之有效的办法是改变流动 相的极性,如采用连续改变流动相极性的梯
度洗脱或温度程序等方法来提高分离选择 性。
k’= tR/tM-1= tR’/tM 可见,容量因子就是调整保留时间与死时间的 比值。在液相色谱中，k’只与固定相、流动相性 质及柱温有关,而与流速和柱尺寸无关。
理论塔板数n和塔板高度H
理论塔板数n是反映物质在固定相和流动相 中动力学特性的重要色谱参数,它是代表色 谱柱分离效能的指标。
计算公式为:
n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR为保留时间, W为峰宽， Wh/2为半高峰宽 塔板高度H计算公式为： H=L/n L为色谱柱长度。
分离因子(α)及分离度（R）
1.分离因子(α) α= k2’/k1’=tR2’/tR1’ α代表了二个物质在相同的色谱条件下的分 离选择性。物质的化学性质或结构上的差 异,反映在与固定相和流动相之间作用力也 有所差异上。这就是色谱分离的基础。
中保留程度的参数,并作为色谱定性的指标。 其表示方法有保留时间、保留体积、调整 保留时间和调整保留体积。
保留时间和保留体积
一般认为,当进样量很小 时,样品从柱中流出呈高斯曲 线分布。从进样开始到峰极 大值所需时间时间称为保留 时间,以tR表示。由于流出时 间与流动相流速成反比,因此 又可用保留体积作为保留值 参数,以VR表示。VR=tR・FC 式中, tR为保留时间(min), FC 为流动相流速（ml/min)。
分类
化学键合相的分类可以有不同的依据。按 键合相的表面结构为单分子键合和聚合键 合；按性质分为Si-O-C,Si-O-Si-N,Si-O-S-C； 按键合有机硅烷的功能团分为极性键合相、 非极性键合相和离子性键合相三种。
液相培训试题
高效液相色谱仪培训检测一、选择题1、以下属于光学性质检测器的就是( )A、紫外-可见光检测器B、荧光检测器C、电导检测D、光声检测器2、HPLC流动相对溶剂的要求有( )A、纯度高、化学稳定性好B、对待检测样品具有合适的极性与选择性C、用于紫外检测时,溶剂在检测器的工作波长下不能有紫外吸收D、分析纯级别即可以被用来作为流动相3、高效液相色谱的流动相常见的脱气方法有( )A、超声波脱气B、抽真空脱气C、在线真空脱气D、加热脱气4、液相使用过程中若发现有盐析出导致压力较高,应该选择用哪种流动相进行冲洗( )A、水B、甲醇C、乙腈D、缓冲盐5、不可以用来对泵头进行冲洗的试剂就是( )A、异丙醇B、甲醇C、水D、缓冲盐6、在高效液相色谱流程中,试样混合物在( )中被分离。
A、检测器B、记录器C、色谱柱D、进样器7、液相色谱流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜( )A、0、5μmB、0、45μmC、0、6μmD、0、55μm8、在液相色谱法中,提高柱效最有效的途径就是( )A、提高柱温B、降低板高C、降低流动相流速D、减小填料粒度9、在液相色谱中,不会显著影响分离效果的就是( )A、改变固定相种类B、改变流动相流速C、改变流动相配比D、改变流动相种类10、在高效液相色谱仪中保证流动相以稳定的速度流过色谱柱的部件就是( )A、贮液器B、输液泵C、检测器D、温控装置二、判断题11、液相色谱柱没有方向区别,所以接色谱柱时无需根据流路方向来接。
( )12、液相色谱仪使用完后,如果管路中有缓冲盐,需要用水冲洗。
( )13、不建议使用乙醇代替甲醇作为常用的流动相,但可以作为低含量改性剂使用。
( )14、脱气后的溶剂放置时间长了,又会溶解新的气体,使用时需要重新处理。
( )15、乙腈作为流动相时,其体积浓度比例最好不超过75%。
( )16、液相使用人超过申请使用时间后,若后续无其她人使用,可以不用申请,继续使用。
( )17、流动相必须贴有配制标签,用水做流动相时需要每天进行更换。
HPLC培训教程
HPLC培训教程HPLC（High Performance Liquid Chromatography）是一种高效液相色谱技术，被广泛应用于化学、生物化学、药学等领域中的分析和纯化过程。
HPLC培训教程旨在向初学者介绍HPLC的原理、仪器组成、样品制备、方法开发以及常见问题解决等方面的知识。
一、HPLC原理HPLC是一种基于色谱原理的分析方法，通过在固定填充物（固定相）上进行流动相（液相）与样品之间的相互作用，实现对样品的分离和定量分析。
其主要原理包括分配作用、吸附作用和离子交换作用。
二、HPLC仪器组成HPLC仪器主要由流动相系统、分离柱、检测器和数据处理系统组成。
流动相系统包括溶剂供应部分和混合部分，用于供给流动相。
分离柱是药物分离的关键，通常由填料柱和色谱柱两部分组成。
检测器用于检测分离柱出口的组分，并生成相应的信号。
数据处理系统将检测器信号转化为可读取的结果。
三、样品制备样品制备是HPLC分析的关键步骤，正确的样品制备可以确保分离柱正常工作并获得准确的结果。
常见的样品制备包括溶解、过滤、稀释和净化等。
溶解样品时要选择适当的溶剂，并根据样品性质进行必要的处理。
过滤可以去除杂质颗粒和减少背景噪声。
稀释可以使样品浓度适合分析要求。
净化可以去除干扰物，保证仪器的稳定性和分析结果的准确性。
四、方法开发HPLC方法开发是为了针对特定的分析目标选择适当的仪器参数和操作条件。
方法开发的关键是选择分离柱和优化流动相组成与流速，以获得较好的分离效果和分析结果。
在方法开发过程中，应该考虑分析目标、样品矩阵、仪器性能以及分析时间等因素，进行试错实验，根据实验结果进行参数调整，直到得到满意的分析方法。
五、常见问题解决在HPLC分析过程中，常常会遇到一些问题，需要及时解决。
常见问题包括峰形异常、峰分离不佳、信号漂移、背景噪声等。
为了解决这些问题，需要对仪器进行校准和维护，检查和修复分离柱，优化操作条件等。
此外，还可以通过尝试不同的分析方法或更换试剂等方法进行排除。
安捷伦高效液相色谱工作站高级操作培训
安捷伦高效液相色谱工作站高级操作培训作为一种重要的分析技术，高效液相色谱（HPLC）在实验室中被广泛应用于各种化学、生物和环境领域的分析。
而安捷伦高效液相色谱工作站作为常用的HPLC设备，其高级操作技巧的掌握对于提高实验效率和结果的准确性至关重要。
以下是安捷伦高效液相色谱工作站高级操作培训的主要内容：1.仪器介绍：详细介绍设备的基本结构和主要部件，包括进样器、分离柱、检测器等，并对各个部件的功能和操作方法进行说明。
2.方法开发：介绍如何根据实验需求选择合适的柱和流动相，调整流速、梯度程序、温度等参数，以达到最佳的分离效果和分析结果。
3.样品处理：讲解样品的前处理方法，如提取、净化、稀释等，以及常用的样品制备技巧，如固相萃取、离心等，以确保样品的准确性和稳定性。
4.数据处理：教授如何使用工作站软件进行数据采集、分析和处理，包括峰识别、峰面积计算、定量分析等，以及如何导出和保存数据结果。
5.故障排除：介绍常见的仪器故障及其解决方法，如柱堵塞、泵压不稳定、峰形不对称等，提供具体的故障诊断和维修指南。
6.方法验证：讲解常用的方法验证和质量控制技巧，包括标准曲线的建立和验证、精密度和准确度的评估等，以确保实验结果的可靠性和准确性。
该培训旨在使参与者掌握安捷伦高效液相色谱工作站的高级操作技巧，提高实验效率和分析结果的准确性。
通过实践操作和案例分析，培训参与者将能够熟练使用工作站进行方法开发、样品处理、数据处理和故障排除，并能够进行方法验证和质量控制。
总结：安捷伦高效液相色谱工作站高级操作培训是一项重要的培训活动，对于提高实验效率、保证实验结果的准确性和可靠性具有重要意义。
通过该培训，参与者将能够全面掌握安捷伦高效液相色谱工作站的操作技巧，并能够独立开展高效液相色谱分析实验。
最新安捷伦高效液相色谱工作站高级操作培训ppt课件
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自动积分
•检查开始和结束区域，确定噪音。 •赋予初始Slope Sensitivity和Height Reject值. •对第一次积分赋予一个临时峰宽值。 •设置Area Reject为0。 •执行测试性积分，有可能重复几次。 •基于较早洗脱出的色谱峰宽计算峰宽值。 •优化Slope Sensitivity和Height Reject。 •从初始的峰宽和噪音水平计算Area Reject。
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泵的辅助功能
选择Instrument More Pump Auxiliary…菜单，即 可弹出下图窗口。
在该窗口可以设置泵 的最大升流速率、泵 冲程大小以及设置溶 剂的压缩补偿因子。
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自动进样器的扩展功能
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色谱柱信息的输入
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VWD停泵扫描采集光谱
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Peak width: (半峰宽)
如果没有设置半峰宽的时间积分表，半峰宽在整个积分过程中自动变化，变化 遵从0.75×exiting peak + 0.25×current peak。
Timed Events :(时间性积分事件)
•Area Sum ON or OFF:设定某一时间段内进行峰面积加和，加和后保 留时间被分配到第一个峰的保留时间上。
使用VWD停泵扫描的功能，可以采集样品的吸收光谱， 主要操作步骤如下： 1.在Online工作站界面的View菜单下打开VWD Scans窗口； 2.按照正常的进样方式采集样品色谱数据，并保证能够在
Online Signal窗口中观测到色谱信号； 3.进样后，色谱图上出现基线时，扫描空白吸收光谱
安捷伦1260高效液相色谱培训
（l）可变波长测器 （2）荧光检测器
(3) 示差折光率检测器
几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折 光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7g·cm-3。
主要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。
（4）二极管阵列检测器
性能/优点：灵敏度高、有四种类型的DAD模块选择、具有 1024个二极管和可变狭缝、可根据需要选择不同的流动池、 可进行自动峰检索、利用紫外谱图可进行色谱峰定性。
常见色谱故障----鬼峰
常见原因是流动相脏，尤其是水相。要求使用超纯水，最 多两天就
常见色谱故障----双峰
可能原因：a、柱头塌陷或柱床运动 b、柱前滤芯堵塞 c、组分共流出 d、样品量过大 f、进样器的进样流路存在分叉流路
常见色谱故障----峰扩展
可能原因：a、柱效降低或有柱塌陷 b、进样体积过大 c、流动相粘度大
c、毛细管柱（微柱）内径～0.5mm
d、半制备柱，内径>5mm。 e、实验室制备柱，柱长10 ～ 30cm，内径20 ～ 40mm f、生产制备柱，内径可达几十厘米。
注：一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和 分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为 其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中 固定相，保证分离技的性能不受影响。
色谱原理
色谱法的分离原理是：溶于流动相 (mobile phase)中的各组分经过固定相时 (stationary phase)发生作 用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲
。又称为色层法、层析法
高效液相色谱仪
高效液相色谱仪的结构：一般可分为5 个主要部分：高压输液系统、进样系统、色 谱分离系统、检测系统、数据处理系统。其 工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动 相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制 器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流 经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色 谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器， 记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此 得到液相色谱图。
高效液相色谱法基本知识培训-化验员入门培训
某一组分的保留体积就是该组分从柱中流出 所需流动相体积,一般情况下常以ml为单位。细内 径柱和毛细管柱,由于所需流动相流量很小, FC的 单位用μ1/min表示,此时VR可采用为μ1单位。 不保留物质流出时间以tM表示,又称死时间。 而tM・FC即为保留物质死体积,简称死体积(VM)。 死体积不仅与柱结构有关,而且与进样系统、检测 系统的体积有关。只有当柱外体积忽略不计时, tM ・FC才表示柱内流动相所占的体积。以VM表示。 任何色谱过程的基本保留方程式为VR=VM+KVS式 中,K为平衡分配系数, VS为固定相体积,Vm为柱内 流动相所占体积(当柱外体积不容忽略时,Vm表示 柱内空隙及柱外体积之总和)。
无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标 峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外, 待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。
计算公式为：
首先，可以通过增加分离因子（α）值的方法提高分离度，可 通过以下方法实现：（1）改变流动相的组成；（2）改变流 动相的pH值；（3）改变固定相的种类；（4）改变分离温度。 其次，提高理论板数（N）可以提高分离度：（1）柱长增加1 倍，柱效也增加1倍，但相应的分离时间也增加1倍；（2）减 少固定相粒径，可以提高柱效，相应的柱压增高，可进行快 速分离。第三，提高容量因子（k’）方法提高分离度，可通 过以下方法实现：（1）调节流动相极性、pH值、离子强度 等；（2）梯度洗脱。另外，如果k’值过大，会造成分离时间 过长，并且谱带扩散严重，因此，比较适宜的k’值范围为 1≤k’≤10。
极性键合相一般都用作正相色谱,即用非极性或极性 小的溶剂(如烃类溶剂)加入适量的极性溶剂(如三氯 甲烷、醇、乙腈等),以调节控制洗脱液的洗脱强度。 分离组分的出峰顺序与组分的极性大小顺序相同,即 极性弱的先出峰,极性强的后出峰。但对强极性的化 合物,上述极性键合相也可用反相色谱,如在分离糖类 或多肽化合物时,用乙腈-水作洗脱液也可以得到良好 的分离效果。 在极性键合相上的分离机理,有吸附和分配之争。但 一般都认为吸附过程是主要的相互作用过程,通过填 料表面极性基团的偶极诱导,或氢键,或静电作用和溶 质分子发生相互作用,达到混合物的分离目的。
液相色谱培训试题.doc
高效液相色谱培训考核试题姓名：部门：成绩:.一、选择题1.高效液相色谱法分析环境空气中苯酚类化合物时,—般情况下,对于相对干净的样品应采用检测器,检测波长为274nm。
2.高效液相色谱法分析环境空气中苯酚类化合物时,分析色谱柱为流动相为30%乙睛溶液(内含醋酸盐缓冲溶液)。
3.环境空气中的苯酚类化合物主要来源于化工行业及各种燃烧,大多数化合物具有性, 对人体具有危害性。
4.高效液相色谱法分析环境空气中苯胺类化合物时,流动相为乙睛和水混合溶剂,缓冲溶液为。
5.高效液相色谱法测定大气颗粒物中多环芳炷时,可选的检测器为紫外检测器和06. _________________________________________________________________ 高效液相色谱法测定大气颗粒物中多环芳炷时,使用微孔滤膜的规格为孔径__________________ pm07.《环境空气质量标准》(GB 3095—1996 )中的苯并［a］匹是指存在于中的苯并［a］花。
8.在《固定污染源排气中苯并［a］花的测定高效液相色谱法》(HJ/T40—1999 )中,检测器为荧光检测器，激发波长为nm ,发射波长为427nm。
9.高效液相色谱法测定环境空气中醛和酮化合物时,用含有的固体吸附剂吸附空气中的醛酮类化合物。
10.高效液相色谱法测定环境空气中醛和酮化合物中,分离结构相似的醛和酮踪衍生物时,可以通过色谱条件优化使醛和酮化合物互不干扰,包括流动相组成流速和进样量等条件。
二、选择题1•高效液相色谱法测定环境空气中醛酮类化合物时,醛和酮的2,4-"硝基苯踪标样应保存_里。
() A .冰箱 B .避光密闭的冰箱 C .铝箔专用袋2.高效液相色谱法测定环境空气中醛、酮类化合物时，吸附醛、酮类化合物的采样管应在采样后d内完成分析。
( ) A. 1 B . 7 C . 303.高效液相色谱法测定环境空气中醛、酮类化合物时，同一化合物的保留时间在一天内的精密度应在_____ %内。
2024年waters2695现场培训教程
Waters2695现场培训教程一、引言Waters2695是一种高效液相色谱仪，广泛应用于制药、食品、环保、化工等领域。
为了帮助用户更好地了解和掌握Waters2695的使用方法，提高实验技能，我们特此编写了本现场培训教程。
本教程将详细介绍Waters2695的基本原理、操作步骤、维护保养以及常见问题解答，旨在为用户提供全面、系统的培训。
二、Waters2695基本原理1.高效液相色谱（HPLC）简介高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，简称HPLC）是一种以液体为流动相的色谱分离分析方法。
它具有分离效能高、灵敏度高、应用范围广等优点，已成为化学、生物、医药等领域的重要分析手段。
2.Waters2695系统组成（1）输液泵：负责输送流动相，保证流动相的稳定性和准确性。
（2）进样器：用于自动进样，提高实验的准确性和重复性。
（3）色谱柱：用于分离样品中的各个组分。
（4）检测器：检测分离后的组分，获取实验数据。
（5）数据处理系统：用于处理和分析实验数据。
三、Waters2695操作步骤1.开机及初始化（1）打开Waters2695电源开关，启动仪器。
（2）检查仪器自检是否正常，确保仪器处于正常工作状态。
（3）设定流动相比例、流速等参数。
2.色谱柱平衡（1）将色谱柱装在仪器上，连接流动相。
（2）开启输液泵，使流动相缓慢通过色谱柱，直至色谱柱平衡。
3.样品制备与进样（1）根据实验需求，制备样品溶液。
（2）使用进样器自动进样，进样量根据实验需求设定。
4.色谱分离（1）开启输液泵，使流动相携带样品溶液进入色谱柱。
（2）根据实验需求，调整流动相比例、流速等参数，实现样品的分离。
5.检测与数据处理（1）样品分离后，通过检测器获取实验数据。
（2）使用数据处理系统对实验数据进行处理和分析。
6.关闭仪器（1）实验结束后，关闭输液泵和检测器。
（2）排空色谱柱中的流动相。
（3）关闭Waters2695电源开关。
高效液相色谱仪使用与操作规程(学生用PPT培训课件
目录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的安装与调试 • 高效液相色谱仪的使用步骤 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 安全注意事项 • 高效液相色谱仪的发展趋势与展
望
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 广泛应用于化学、制药、食品、 环保等领域。
检测器技术升级
发展高灵敏度、高稳定性和高可 靠性的检测器，提高检测精度和
可靠性。
应用领域拓展
新药研发
高效液相色谱技术在药物分析、药物代谢和药物 动力学等领域发挥重要作用。
环境监测
用于检测水体、土壤和空气中的污染物和有害物 质，为环境保护提供有力支持。
食品安全
用于检测食品中的农药残留、添加剂、毒素等有 害物质，保障食品安全。
确保实验室环境干燥、 清洁，避免仪器受潮 或落尘。
操作时应避免剧烈振 动仪器，以防损坏内 部组件。
仪器安全
定期检查仪器管路是否漏液，若 有漏液应及时处理。
仪器应放置在通风橱内，以防气 体泄漏对实验人员造成危害。
仪器使用完毕后应关闭所有电源， 并按照仪器说明书进行保养。
数据安全与保密
操作过程中避免无关人员靠近 仪器，以防误操作导致数据丢 失或损坏。
仪器保养与校正
01
02
03
04
定期对仪器进行全面检查，包 括泵、进样阀、色谱柱和检测
器等部件。
根据仪器使用情况，适时清洗 或更换泵内滤网、色谱柱和检
测器。
按照厂家推荐，使用专用工具 和材料进行保养和校正。
定期对仪器进行性能验证，确 保其准确性和可靠性。
高效液相色谱仪培训测试题
高效液相色谱仪培训测试题一、名词解释1．分离度：相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。
2、保留时间：从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间间隔，即从进样开始到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔。
二、填空题1．高效液相色谱仪一般由输送系统、进样系统、色谱柱系统、检测系统、数据记录处理系统五部分组成。
2．不对称峰有两种：T小于0.95为前延峰、T大于1.05为拖尾峰。
3、流动相使用前必须先脱气。
4．系统适用性试验包括理论板数、分离度、重复性、拖尾因子四个评指标。
5．在色谱条件中，固定相的种类、流动相组成、检测器类型不得改变，其余如流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、梯度洗脱程序中的时间长短、色谱柱的内径、长度、填料粒度、检测器的灵敏度等均可适当改变。
6．梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度、高压梯度。
三、问答题简述提高分离度的几种途径？答：（1）增加塔板数。
（2）增加选择性。
A、改变流动相的组成；B、改变柱温；C、改变固定相。
（3）改变容量因子，主要是改变流动相的配比、PH值、离子强度等，或改用梯度淋洗。
气相色谱仪培训测试题1．气相色谱仪由气路系统、进样系统、柱分离系统、数据采集系统、数据处理系统、控制系统六个系统组成。
2．气相色谱法所能直接分离的样品应是可挥发、热稳定的物质，沸点一般不超过500度。
3、常用的载气有氦气、氮气、氢气或混有甲烷的氩气。
4、我公司的气相色谱仪所安装的检测器有火焰离子化检测器、电子捕获检测器两种。
5、各品种项下规定的条件中色谱柱种类、固定相的极性和检测器类型不得任意修改。
6、气相色谱仪主要是利用物质的沸点、极性、吸附性质的差异来实现混合物的分离。
7、气化温度可比样品中最高沸点组份的沸点高30~40度。
8、色谱柱使用一段时间后，基线会出现波动或鬼峰，解决此问题的办法是老化。
9、新色谱柱安装后，都要在进样前进行老化，具体办法是：先接通载气，然后将柱温从60度左右以5~10度/分钟的速度程度升温到色谱柱的最高使用温度以下30度或者实际分析操作温度以上30度，并在高温时保持30到120分钟，直到所记录的基线稳定为止。
HPLC高效液相色谱法培训解析
进样方式
①部分装液法：注入的样品体 积应不大于定量环体积的50%， 并要求每次进样体积准确、相 同。
②完全装液法：注入的样品体 积应最少是定量环体积的3倍，
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以完全置换定第29量页/共1环12页 内流动相， 消除管壁效应，确保进样准确
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自动进样器
由计算机自动控制进样六通阀、 计量泵和进样针的位置，按预 先编制的进样操作程序工作， 自动完成定量取样、洗针、进 样、复位等过程。
应用范围
适用于任何挥发性小于流动相的 组分的检测
不适于检测挥发和半挥发性的化47
合物
第47页/共112页
其他检测器难以检测的化合物如
HPLC分析基本操作
1．准备：流动相配制、脱气， 样品制备。
2．开机：依次打开计算机、泵、 检测器、柱温箱电源开关，仪 器自检。
3．装柱：将吸液头插入已经过 滤和脱气处理的甲醇中，开启 泵，使液体流第48页出/共11，2页 调流速在 48 0.2mL/min，连接色谱柱（注意
第23页/共112页
进样器
➢ 手动 六通阀
经注射器进样
➢ 自动 六通阀
圆盘式自动进样器 链式自动进样器
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六通阀手动进样器原理示意图
Load
Inject
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六通阀
有6个接口，1和4之间接定量环，2接高压 泵，3接色谱柱，5、6接废液管。
4
第4页/共112页
仪器组成
进112页
数据处理 系统
5
高压输液系统
溶剂贮液瓶 溶剂脱气装置 高压输液泵 梯度洗脱装置
高效液相色谱知识培训测试题
安捷伦液相色谱知识培训试题姓名：成绩：一、选择题（每题至少有一个正确答案）（每题2分，共10分）1．以下哪种溶剂一般不作为反相色谱的流动相使用（）。
A 甲醇；Ｂ正己烷；C 二氯甲烷；D 乙腈2．影响液相色谱分离度的因素有（）。
A 流动相；Ｂ色谱柱；C 进样器；D 检测器3．以下哪种检测器的通用性比较好（）。
A VWD；Ｂ DAD；C FLD；D RID4．以下哪些项目属于色谱的“系统适应性试验”的内容（）。
A. 重复性B. 理论塔板数C. 分离度D.对称因子5．液相色谱适宜的分析对象是（）。
A 低沸点小分子有机化合物B 高沸点大分子有机化合物C 所有有机化合物D 所有化合物二、填空题（每题2分，共20分）1.液相色谱常用的检测器有（至少答出四种）、、、。
2. 目前常用的液相泵有、、。
3.一台完整的液相色谱主要由、、、、组成。
4.液相色谱根据流动相和固定相的极性可分为和。
5.配有自动进样器的一台高效液相色谱仪，其进样量的准确性主要由来决定。
6.泵头密封垫冲洗装置Seal Wash一般用作为溶剂。
7.采用VWD检测中药的有效成分，其检测波长一般设置在。
8.在液相反相色谱中，流动相极性增大，色谱峰保留时间。
9. 不对称峰有两种：T小于0.95为，T大于1.05为。
10. VWD检测器所使用的光源为。
三、是非题：（每题2分，共20分）1.序列属于方法的一部分。
（）2.色谱柱的理论塔板数越多代表柱效越高。
（）3.DAD和FLD均可以采集一个化合物的光谱图。
（）4.温度对液相色谱结果影响较小，因此可以不对液相色谱进行控温。
（）5.四元泵可以同时控制四种不同的溶剂进行梯度洗脱，其性能要优于单元泵和二元泵。
（）6. 流动相使用之前需先脱气。
（）7. 死体积是由进样器至检测器的流路中被流动相占有的空间。
（）8.为能获得较高的柱效，节约分析时间，采用较小的流速，通常内径4.6mm的色谱柱，多用50ml/min 的流量。
高效液相色谱培训(HPLC使用与维护)
常见故障排除
流动相不流动
检查泵密封圈是否磨损或损坏， 管路是否堵塞，流动相是否足够。
峰形异常
检查进样器是否堵塞，色谱柱是否 受损或污染，检测器是否正常工作。
基线漂移
检查流动相是否纯净，检测器是否 正常工作，仪器是否处于良好状态。
仪器保养与校准
01
02
03
定期校准
按照厂商推荐的时间间隔 和校准方法，对HPLC进 行校准，以确保仪器性能 和测量精度。
详细描述
HPLC技术在化学领域中广泛应用于有机化合物、无机化合物的分离和测定。在生物领域，HPLC用于 蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。在医学领域，HPLC用于药物分析、临床检验、毒物分析 等方面，为医学研究和诊断提供重要的技术支持。
HPLC的优点与局限性
总结词
HPLC具有高分离效能、高灵敏度、高选 择性等优点，但也存在一些局限性，如 对样品的前处理要求高、对流动相的纯 度要求高等。
考察学员在遇到问题时能否迅速、准确地 判断并采取有效措施解决问题。
实践操作与考核经验分享
严格遵守操作规程
在实践操作过程中，务必遵循正确的操 作规程和安全规范，确保实验结果的准
确性和可靠性。
团队协作与沟通
积极参与团队协作，与团队成员保持 良好的沟通，共同解决问题，提高工
作效率。
充分准备与复习
在考核前，充分复习理论知识，熟悉 实验操作流程和仪器设备的使用方法。
HPLC仪器操作流程
准备工作
检查仪器各部件是否正常，流动相是否充足 ，确保电源和气源连接正常。
流动相制备
根据实验要求配制流动相，并进行过滤和脱气 。
仪器启动
打开电源和气源，启动仪器，进行系统冲洗和平 衡。
高效液相色谱培训ppt
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
1．梯度洗脱的特点
（1）改善分离, 加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕 量组分的检测； （3）增加峰容量； （4）强烈滞留的组分不容易残留在 柱上, 保持柱性能长期良好； （5）下次分析时, 流动相需要一段平 衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有 差异, 可能会引起基线漂移
用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：
1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
灯的保养：
在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成 后，马上关闭检测器。
样品池要保养
谢谢！
今天用的图片都为 摄影协会 王诏同学所拍摄
H20 with 0.1% TFA
50% ACN with 0.1% TFA
210.00
220.00
230.00
240.00
250.00 nm
260.00
270.00
280.00
290.00
溶剂混合的基线噪音
色谱条件
色谱柱： C18, 5 µm, 3.9x150mm at 35º C.
流动相： A: 0.1% TFA in Water. B: 0.1% TFA in Acetonitrile.
采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体 积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再 生。
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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手动进样器－六通阀
Load Inject Sample Syringe To Waste
To Waste
To Column To Column Sample Loop From (Fixed Volume) Pump
From Pump
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1．3 分离系统
分离系统主要是色谱柱。 色谱柱的作用是把样品中的组分分离，是色谱 仪最重要的部件之一。 色谱柱的高效率是现代高效液相色谱仪的一个 显著特点。 为达到好的分离效果，色谱柱的选择尤为重要。
（2）分配色谱法 （液－液色谱法）
在固体颗粒表面涂敷液体作为固定相； 利用不同组分在流动相及固定相中的分配 系数不同而实现分离。 在固定相中分配系数小的组分先被分离出 来，分配系数大的组分后被分离出来，从 而实现混合物样品的分离。
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（3）离子交换色谱法
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DAD - Peak Purity
Graphical and Numerical Results
Spectra
Purity Match 764
Purity Match 999
200
Wavelength (nm)
400
200
Wavelength (nm)
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1．4 检测系统
在高效液相实验中所选用的检测器，必 须满足我们所分析样品中感兴趣组分的 检测要求。也就是说，对我们所关心的 组分有较高的灵敏度和较好的选择性， 有很低的最小检出量，有较宽的线性范 围。常用的检测器有以下几种：
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１.４.１ 紫外及可见光检测器
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（3）二极管阵列检测器
这类检测器是近十几年发展起来的新型检测器。 该检测器采用512～1024个光电二极管作检测，所以 在作色谱分析时，不但能得到分析全过程的色谱图， 同时还可以得到所有组分峰的光谱图 (3D谱图)，而 不必象传统的检测器那样需要停泵扫描。 加上强大功能的色谱软件的支持，可以作光谱检索， 峰纯度分析，还便于我们对感兴趣组分的检测波长 进行优化。 这类检测器比较昂贵，适合于中草药、天然未知物 的分析以及产品与方法的研究开发。
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亲和色谱法
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柱色谱
玻璃柱
重力 洗脱
硅胶 氧化铝 纤维素 糖类粉末
装载 样品
装载 溶剂
滤网
Volume (mL) Time (hr)
150 4.0
100 3.0 2.0
50 1.0
10
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1. 高效液相色谱仪的基本结构和原理
高效液相色谱仪依据分离的原理虽有不同的类 型，如吸附、亲和、分配、离子交换、凝胶色 谱等,但仪器组成并无太大的差异。 仪器结构:一般由溶剂输送系统（泵）、进样系 统（手动和自动进样器）、分离系统（色谱 柱）、检测系统（检测器）和色谱工作站 （系 统控制与数据处理）等构成,如图３－１所示; 根据实验需要还可能配置在线真空脱气机、温 度控制系统（柱温箱）和馏分收集器等。
高效液相色谱仪既是一种分离仪器，又是一 种分析仪器。 它既是纯化蛋白、提取天然化合物的有用工 具，又是对目标化合物进行定性定量分析的 有用工具，因为分离是分析的前提。 广泛应用于制药、食品、化工等行业的品质 控制，以及临床检验和分子生物学研究等领 域。
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2．1 操作方法
高效液相色谱仪的操作方法包括： 实验方案的拟定； 对样品的前处理； 色谱柱的选择； 流动相的准备与配制； 仪器系统的冲洗与平衡，进样预分析， 优化色谱分离条件，使目标组分达到满意的分离； 在定量分析时，需要进不同浓度的标样，计算响应 因子，建立校正曲线，以便对未知样品进行定量。 44
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除以上几种常见的检测器外， 还有电化学检测器，电导检测 器，蒸发光散射检测器，质谱 检测器等。
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检测器使用统计
43.0%
UV-VIS DAD Fluorescence Refractive Index 22.0% 4.0% Electrochemical 1.0% 5.0% 7.0% 10.0% 8.0% Conductivity Mass spec Others
400
Signal
impure
pure
7.6
7.8
8.0
Time (min.)
8.2
8.6
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1．4．2 荧光检测器
基本原理和仪器结构与荧光分光光度计相类似。 以滤光片分光为特征的固定波长检测器为第一代产品； 以棱镜分光、只有模拟信号输出为特征的可变波长检 测器为第二代产品； 以光栅分光、由微机控制、同时有数字信号输出和模 拟信号输出为特征的可变波长检测器为第三代产品。 最新产品无论是激发光，还是发射光，均可作波长扫 描，得到所分析组分的激发光谱和发射光谱，增强了 它的定性功能。
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1．2 进样系统
高效液相色谱仪的进样系统要求： 能将样品准确地注入到系统中，而不破坏 在色谱柱和检测器里所建立的流量平衡； 在不同的进样量下具有很宽的线性范围、 很高的重现性、可以忽略的样品残留。 常见的进样器有：手动进样器（六通阀）和 自动进样器。
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基本结构：与紫外－可见分光光度计相同； 遵循的基本原理：朗伯－比尔定律。 这种检测器只能用于在工作波长范围内有吸 收的样品，可分为三个类型。
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紫外－可见检测器
根据Beer定律，通过检测池透射光的强度与溶质浓度成正比。
Detector Cell Io C b I
Log
I0 = 入射光强度 I = 透射光强度 A = 吸光度 a = 摩尔吸光系数 b = 检测池长度 c = 溶质浓度
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试样组分基本上是按其分子大小受到不 同排阻而先后由柱中流出，从而实现分 离的。 对同系物来说，洗脱体积是分子量的函 数。洗脱次序将决定于分子量大小，分 子量大的先流出色谱柱，分子量小的后 流出。
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42 2005-11-25
2.高效液相色谱仪的操作方法与应用
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1．8
色谱分离原理
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（1）吸附色谱法 （液－固色谱法）
固定相是固体吸附剂； 分离是基于吸附剂对混合物中诸组 分的吸附作用力大小不同，在流动 相带着样品各组分流过固定相时其 移动速度有差异而实现分离 。
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33 2005-11-25Biblioteka 21 2005-11-25
Instrumentation
Refractive Index Detectors
Beam Deflection Fresnel Prism Laser Interferometer
Reference Cell
Sample Cell
Photodiodes Sample Reference Sample Reference
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荧光检测器的用途与特点：
用于荧光物质的检测； 选择性和灵敏度均优于紫外及可见 光检测器。
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1.4.3 示差折光检测器
检测原理：由于各种物质具有不同的折射率， 溶剂和样品各组分折射率存在一定差异，所 以通过检测折射率的变化，就可以达到分析 样品组分的目的。 是一种非选择性检测器，基本上对所有被测 对象均有响应，但灵敏度较低，不适合做痕 量分析，也不适合作梯度洗脱。 多用于制备色谱和凝胶色谱，也用于糖类等 无吸收物质的分析。
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（4）空间排阻色谱法
空间排阻色谱法也称凝胶色谱法。 分离机理与其它色谱法不同，它类似于分子 筛的作用； 混合物中各组分按其分子大小不同而被分离。 色谱柱内填充具有三维空间的多孔网状结构 的凝胶。
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试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部 间隙以及凝胶网孔旁流过： 体积大的分子不能渗透到凝胶孔隙里去而 受到排阻，因此较早地被冲洗出来； 中等体积的分子产生部分渗透作用； 小分子可渗透到网孔里去，故流程长，移 动速度慢而较晚被冲洗出来。
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高效液相色谱
(HPLC)
进样器
混合器
色谱柱 检测器 溶剂
色谱图
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1．1 溶剂输送系统
溶剂输送系统主要的部件是输液泵，它的作用是将流 动相稳定地、准确地输送到色谱系统内。 如需梯度洗脱，必须配备两个输液泵或一个多元泵由 色谱工作站或控制器编辑时间程序进行梯度控制。 主要的设置参数是： 流速（mL/min）－流速是一个影响分离效果的参数， 主要是根据色谱柱的类型以及长度、直径、填料的粒 径大小的不同进行设定； 上限压力（bar或psi）－上限压力主要根据色谱柱的 最大工作压力设定，目的是保护色谱柱，避免过压而 使柱子受损。
离子交换色谱是基于离子交换树脂上可电离 的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子 进行可逆交换，依据样品中各组分的离子对 交换剂具有不同的结合力而将它们分离。 凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用 离子交换色谱法来分离。 酸性化合物用阴离子交换柱进行分离； 碱性化合物用阳离子交换柱进行分离。
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I0 I
= A = abc
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（1）固定波长检测器
以滤光片分光，根据所需波长选用 相应的滤光片。 结构简单，价格便宜，一般用于蛋 白纯化方面。
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