噬菌体的分离与纯化优化版
噬菌体的分离与纯化
大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化【实验目的】1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。
2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。
3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。
4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。
5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。
【实验原理】1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。
粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。
2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；（3）将样品内的细胞进行富集培养；（4）制备噬菌体裂解液；（5）检测噬菌体是否存在；（6）噬菌体的纯化及效价测定。
3.培养基的配制（配方）与灭菌（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（2）牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。
（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。
封好做好标记于121℃灭菌20min备用【实验材料及器皿】1.菌种：大肠埃希氏菌。
2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。
4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。
噬菌体分离纯化的原理和步骤
噬菌体分离纯化的原理和步骤1. 噬菌体简介好啦，大家，今天我们来聊聊一个有趣又神奇的东西，叫做噬菌体。
听起来像是外星人发明的玩意儿，其实它是一种专门攻击细菌的病毒，简直是细菌界的“灭霸”。
它们在微观世界中偷偷摸摸地工作，悄无声息地解决那些惹人烦的细菌问题。
咱们身边的细菌可不少，有的对我们有益，但有的却是个十足的“败类”。
这时候，噬菌体就像是细菌的天敌，真是太酷了！2. 分离纯化的意义2.1 为何要分离纯化噬菌体？那么，为什么我们要把噬菌体分离和纯化呢？首先，想象一下，如果你在一个大杂烩中找一颗珍珠，那可是相当困难的。
所以我们得把这些小家伙从杂乱的环境中“捞”出来，单独让它们站到聚光灯下。
这样一来，我们就可以更好地研究它们，了解它们是怎么攻击细菌的，有助于开发新的治疗手段，像是抗生素的替代品。
2.2 纯化的重要性再者，纯化的过程就像是给噬菌体洗澡，洗去那些多余的脏东西，只留下最纯粹的样子。
这样才能确保我们研究的数据准确，不然的话，可能会被一些“干扰分子”搞得一团糟。
想想，如果你的咖啡里多了一勺盐，那可就毁了整杯了，不是吗？3. 分离纯化的步骤3.1 收集样本接下来，我们来说说具体步骤。
第一步，得收集样本。
你可以从土壤、水源，甚至是一些腐烂的食物中找到细菌和噬菌体。
这可不是随便捞的，咱得选那些“鱼塘”丰富的地方。
想象一下，像在一片荒野中寻找“金矿”，可是比喻中的“金矿”得小心翼翼，别让细菌给我们添乱。
3.2 培养细菌收集好样本后，我们要把这些细菌培养起来。
通常用一些培养基，就像细菌的“自助餐”。
让它们在温暖的环境中肆意生长，像是细菌的“欢乐派对”。
可是咱可不能忘了，噬菌体也会趁机来“捣乱”，所以这时得时刻盯着它们的动态。
3.3 噬菌体分离一旦细菌培养得差不多了，就可以进行分离了。
这里可以用过滤的方法，把细菌和噬菌体分开。
想象一下，像是在过筛子，把沙子和金子分开，真是一场“筛沙子”的大比拼。
然后把留下来的液体提取出来，这里就大功告成了，噬菌体终于登场了。
细菌的噬菌体分型
细菌的噬菌体分型实验二细菌的噬菌体分型第一部分肠杆菌科噬菌体的分离、纯化与增殖噬菌体广泛存在于自然界。
凡是有细菌存在的地方，一般都能找到相应的噬菌体。
例如，土壤、肥料、腐烂有机物、粪便和阴沟污水等常是各种细菌的栖息地，从中能分离到相应的噬菌体。
从自然界分离某一噬菌体需要经过以下步骤:培养宿主菌(或叫做敏感菌);采集含噬菌体的样品;噬菌体富集培养;制备噬菌体裂解液;验证噬菌体的存在;噬菌体的纯化;噬菌体的增殖;噬菌体的效价测定和保存。
下面以大肠杆菌噬菌体为例详细介绍噬菌体的分离和纯化方法。
1( 噬菌体的分离(1)制备菌悬液:取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
(2)增殖培养:于10ml三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶(1支5ml吸管)中，加入污水样品20ml(1支5ml吸管)与大肠杆菌悬液0.2ml(1支1ml吸管)，37?培养12h,24h以增殖噬菌体。
(3)制备裂解液:将以上增殖的混合培养液2500r/min离心15 min(1支5ml吸管)。
将上清液倒入无菌平皿，针管抽取液体，在针栓式滤器上过滤除菌。
所得滤液倒入灭菌瓶内，取少量滤液作无菌试验，即将它接入牛肉膏蛋白胨培养液中(1支5ml吸管、1支1ml吸管、1支无菌带帽华氏管)，置于37?培养过夜，以作无菌检查。
(4)噬菌体确证试验:滤液经37?培养过夜，若无细菌生长则表明已经彻底除菌。
需进一步证明噬菌体的存在。
于已烘干的肉膏蛋白胨琼脂平板(平皿1个)表面加一滴大肠杆菌悬液(1支1ml吸管)，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。
放置数分钟，待琼脂表面干燥，在菌层的表面布点5个,7个，每点滴加上述滤液1小滴(1ml枪1把和枪头10个)，同时选择其中一点不加滤液只滴加一小滴生理盐水为对照，再放置数分钟，使液滴被琼脂吸干。
倒置平板，37?培养过夜。
次日观察结果，若平板上滴加滤液的部位出现噬菌斑，而在对照滴中处无噬菌斑，则表明该滤液中肯定含有大肠杆菌相应噬菌体。
噬菌体作为载体的使用流程
噬菌体作为载体的使用流程1. 简介噬菌体是一种可以感染细菌的病毒，它可以被利用作为生物学研究和生物工程领域的载体。
在使用噬菌体作为载体时，有一系列的流程需要遵循以确保实验的成功进行。
本文将介绍噬菌体作为载体的使用流程。
2. 噬菌体的培养和扩增在使用噬菌体作为载体之前，首先需要培养和扩增噬菌体。
以下是噬菌体的培养和扩增流程：•准备培养基：根据实验需求，选择适合噬菌体生长的培养基，并准备好所需的培养基。
•制备噬菌体接种物：选择适当的宿主细菌，如大肠杆菌等，并将其在培养基中进行培养，直至细菌达到适当的生长状态。
•加入噬菌体：将培养好的噬菌体加入到宿主细菌培养物中，使其与细菌发生感染。
•培养噬菌体：将噬菌体和宿主细菌混合物在恰当的条件下进行培养，如温度、pH等。
•扩增噬菌体：通过适当的培养时间和培养条件，使噬菌体扩增至所需的数量。
3. 分离和纯化噬菌体在培养和扩增噬菌体后，需要对其进行分离和纯化，以获得纯净的噬菌体溶液。
以下是噬菌体的分离和纯化流程：•离心分离：将培养物进行离心，以分离噬菌体颗粒和残留的细菌细胞。
•滤过分离：通过使用合适的孔径滤膜，将噬菌体溶液进行滤过分离，去除杂质。
•超速离心：利用超速离心技术进一步分离噬菌体颗粒和溶液中的其他组分。
•超滤：通过使用适当的分子量切割膜，将噬菌体颗粒从溶液中分离出来。
•冻干与储存：将纯化的噬菌体溶液进行冻干处理，并储存于适当的条件下。
4. DNA插入纯化的噬菌体作为载体可以用于DNA插入。
以下是噬菌体的DNA插入流程：•DNA准备：从源中提取目标DNA，并进行适当的处理，如限制性酶切。
•DNA连接：将目标DNA与噬菌体载体DNA进行连接，通过适当的连接酶进行连接。
•转化：将连接好的DNA转化到适当的宿主细菌中，使其得到插入噬菌体的DNA。
•选择与筛选：通过选择性培养基或筛选方法，选出携带目标DNA的宿主细菌。
5. 噬菌体的扩增和提取将DNA插入噬菌体后，需要对其进行扩增和提取，以获得足够的目标DNA量。
大肠杆菌噬菌体的分离纯化及效价的测定
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
噬菌体的分离与纯化优化版
噬菌体的分离与纯化优化版SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#噬菌体的分离与纯化实验用具及材料1.菌种：大肠杆菌2.试剂：氯仿3.培养基：1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌；4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴锅，离心机等实验步骤1.噬菌体的分离（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置37℃培养过夜。
/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混合后置37℃振荡培养12～24h。
（3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中。
（4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用。
（5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上。
待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，置37℃培养过夜。
如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。
噬菌体的分离与纯化
大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化【实验目的】1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。
2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。
3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。
4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。
5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。
【实验原理】1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。
粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。
2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是：（1）培养寄主细胞（大肠杆菌）；（2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）；（3）将样品内的细胞进行富集培养；（4）制备噬菌体裂解液；（5）检测噬菌体是否存在；（6）噬菌体的纯化及效价测定。
3.培养基的配制（配方）与灭菌（1）3×牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（2）牛肉膏蛋白胨培养液：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4.（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。
（4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基：牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。
封好做好标记于121℃灭菌20min备用【实验材料及器皿】1.菌种：大肠埃希氏菌。
2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。
4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。
噬菌体的分离
按前面方法制备噬菌体裂解液
6.计数（效价测定） 计数（效价测定） 计数 在平板中倒入50℃下层培养基10-15mL,冷凝 用0.9mL无菌肉汤将噬菌体裂解液做10倍系列稀释 在4mL 48℃上层培养基中加入0.1mL噬菌体稀释液和菌液 0.9mL，用双手前后搓动 使混匀，立即倒入下层平板上 将平板倒置于37℃培养12-16h,统计噬菌斑数目
37℃，24h
3.制备噬菌体裂解液 制备噬菌体裂解液
方法1：离心法： 离心3000转/分，15min. 氯仿（0.5mL/10mL上清液） 振荡5min 离心3000转/分，15min.
增值混合液
方法2：过滤法：P142
离心4000转/分，15min.
上清液
离心4000转/分，15min.
0.22µm无菌过滤器过滤
大肠杆菌噬菌体分离 枯草芽孢杆菌噬菌体分离
大肠杆菌斜面 4mL无菌水
枯草芽孢杆菌斜面 4mL无菌水
大肠杆菌菌悬液
枯草芽孢杆菌菌悬液
2.增殖噬菌体 增殖噬菌体 污水200mL 大肠杆菌菌悬液2mL 感染噬菌体发酵液200mL 枯草芽孢杆菌菌悬液2mL
3倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基100mL
增值混合液
计算噬菌体效价 噬菌体效价=pfu数×稀释倍数×10 噬菌体效价 数 稀释倍数×
报告要求 1、P143：1.结果 2、 P143：思考题（2）、（3）、（4）、 （5）、（6） 3. P145：1.结果 4.P145：2.思考题 （1）、（2）（3）、（4）
步 祝 你 进
三、技术路线
配制3倍料培养基、 配制 倍料培养基、制备菌悬液 倍料培养基 无菌试验
制备噬菌体裂解液 检验噬菌体 纯化 增值
双层平板法
噬菌体的分离与纯化(整理优化版)
噬菌体的分离与纯化实验用具及材料1.菌种：大肠杆菌2.试剂：氯仿3.培养基：1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6 g，NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏 0.9g，NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌；4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴锅，离心机等实验步骤1.噬菌体的分离（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置37℃培养过夜。
/取大肠杆菌斜面一支，加4ml 无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖培养：在盛有10mL 3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混合后置37℃振荡培养12～24h。
（3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中。
（4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用。
（5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上。
待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，置37℃培养过夜。
如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。
2.噬菌体的纯化（1）取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀；（2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃（可预先溶化后置45～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37℃培养12~24h；（3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。
噬菌体的分离与纯化优化版
噬菌体的分离与纯化优化版SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#噬菌体的分离与纯化实验用具及材料1.菌种：大肠杆菌2.试剂：氯仿3.培养基：1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌；4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴锅，离心机等实验步骤1.噬菌体的分离（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置37℃培养过夜。
/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混合后置37℃振荡培养12～24h。
（3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中。
（4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用。
（5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面上。
待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，置37℃培养过夜。
如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。
实验十一 从自然环境中分离纯化噬菌体
噬菌体分离和纯化的流程图
取20ml 水样 37℃ 振 荡培养 12-24h 离心收集 2500r/min 15min 上清 过滤
看板
分散滴 37℃ 过夜
加数滴
取 一 环
待 干 37℃过夜 培养 加0.1－0.2ml
EP管中加 0.9ml水
混匀 后取 0.2ml 加0.1ml 加0.1ml
立即倒 平板
③ 制备裂解液：将过夜培养物2500r/min离心15min，上清液用 无菌滤头过滤； ④ 确证实验：确证滤液中含有噬菌体的存在 在含有培养基的平板上加一滴大肠杆菌悬液，用灭菌涂布 器涂布均匀； 待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面， 置于37 ℃培养过夜；如果在滴加处形成无菌生长的透明 的噬菌斑，证明滤液中含有大肠杆菌的噬菌体。
蛋白胨 10g/L
酵母粉 5g/L NaCl 10g/L
琼脂 0.7%
琼脂 2%
四、实验操作步骤
（一）噬菌体的分离
① 制备菌悬液：平板上挑取适量E. coli接入LB摇瓶中，过夜培 养制成菌悬液；
② 增殖培养：于10ml三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基中， 加入20ml污水样品和1ml大肠杆菌菌液，37℃震荡培养 12~24h；
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌，大肠杆菌噬菌体(10-2的稀释液)。 2、培养基： LB琼脂平板(20ml培养基，2%琼脂，作底层培养基用)5个; 含琼脂培养基的试管(5ml，0.7%琼脂，作上层培养基用)5支。 3、仪器与其他用具： 含4.5ml无菌水小试管4支; 灭菌1.5ml Ep管 5个;
3、混合液加入到上层培养基中 (1) 将5管上层培养基溶化，分别标上10-4,10-5, 10-6,10-7和对照。 放置于48℃的水浴锅内。 (2) 分别将4管混合液和对照管加入对应的上层培养基试管中， 每加入一管就要立即摇匀。 4、上层培养基倒入底层平板上 (1)将摇匀的上层培养基迅速倒入相应的底层平板上，放在台面 上摇匀，使上层培养基布满平板。 (2)凝固后，置37℃培养过夜。
噬菌体纯化注意事项
噬菌体纯化注意事项
噬菌体纯化是一种将噬菌体颗粒从细菌细胞中分离出来的过程。
在进行噬菌体纯化时，有一些注意事项需要注意：
1. 无菌操作：纯化过程中需要保持细菌和噬菌体的环境无菌，以防止细菌污染。
2. 保护噬菌体完整性：在离心、稀释和搅拌等操作中要小心，避免破坏噬菌体的完整性。
3. 控制温度：噬菌体纯化过程中，需要控制温度以维持噬菌体的稳定性。
通常，噬菌体纯化在4C下进行，以减少噬菌体降解的可能性。
4. 避免酶活性：噬菌体一般会包含一些限制性内切酶和外切酶，这些酶可能对DNA和RNA有活性。
在纯化过程中，需要避免激活这些酶，以免影响纯化结果。
5. 注意噬菌体寿命：噬菌体具有有限的寿命，因此应该尽快进行纯化过程，以避免噬菌体降解。
6. 合适的缓冲液选择：选择合适的缓冲液可以帮助维持噬菌体的稳定性和纯化效果。
一般情况下，选择pH适宜的缓冲液，并加入适当的保护剂以保护噬菌体。
7. 纯化步骤选择：根据具体的纯化需求，可以选择不同的纯化方法，如离心、过滤、柱层析等。
根据实际情况选择最合适的纯化步骤。
总之，噬菌体纯化是一个复杂的过程，需要注意以上几点，以保证纯化效果和噬菌体的完整性。
噬菌体的分离及其寄主细胞的鉴定
噬菌体的分离及其寄主细胞的鉴定噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，其存在的意义在于调节细菌数量，维持生态平衡。
与其他病毒不同的是，噬菌体的寄主是细菌，而细菌则作为噬菌体的繁殖基质。
因此，了解噬菌体的分离及其寄主细胞的鉴定对于维持微生物群落的稳定，维护人类健康具有重要意义。
一、噬菌体的分离方法噬菌体可以通过两种方法分离：（1）寄主膜破碎法；（2）巨细胞法。
寄主膜破碎法是最常用的噬菌体分离方法，其原理为化学溶解寄主菌的细胞壁和膜，使得噬菌体被释放。
该方法的具体步骤为：（1）将寄主菌接种到培养皿中；（2）加入一定浓度的化学物质，如Tween 80、SDS等，使得细胞壁和膜溶解；（3）离心沉淀，去除寄主菌留下噬菌体。
巨细胞法是一种体外培养细胞法，其原理为在营养缺乏的培养液中，将噬菌体感染到寄主细胞并使其增殖，形成巨细胞，最终分离出噬菌体。
该方法的具体步骤为：（1）通过定量PCR或滴定法测定噬菌体的初始含量；（2）将噬菌体感染到与其适宜的寄主细胞上，培养到合适的时间，直至形成巨细胞；（3）收集巨细胞，离心沉淀，分离出噬菌体。
二、寄主细胞的鉴定方法寄主细胞的鉴定是噬菌体研究中非常关键的一步。
它不仅可以确定噬菌体的寄主范围，还可以研究噬菌体与细菌之间的相互作用和生态响应。
常用的寄主细胞鉴定方法有三种：（1）凝胶探针法；（2）PCR法；（3）无基因片段标记法。
凝胶探针法是一种经典的寄主细胞鉴定方法，其原理为将寄主菌接种到寒暖交替的凝胶中，凝胶中形成的细胞克隆呈现不同的形态，通过寻找与噬菌体作用的细胞克隆，识别寄主细胞。
该方法虽然准确性较高，但需要大量耗时和耗材，难以大量应用。
PCR法是一种简便快速的寄主细胞鉴定方法，其原理为针对细胞壁或内质网上的基因间隔区，设计特异的引物，进行PCR扩增，通过扩增产物的测序或分子量鉴别寻找寄主细胞。
该方法的优势在于对样品的要求低，检测速度快，能够大量应用。
无基因片段标记法是一种新型的寄主细胞鉴定方法，其原理为将受噬菌体感染的细胞进行荧光标记或电化学标记，利用仪器检测关键生化分子的变化，直接寻找寄主细胞。
噬菌体的分离与纯化
噬菌体的分离纯化及一步生长曲线的绘制前言噬菌体是以细菌为寄主的一类非细胞微生物。
目前对于噬菌体的研究大多数集中在人和动物传染性疾病的防治方面，在环境的治理方面的研究报道较少，因此我们试图分离纯化污水中的噬菌体，掌握其生物学性质，应用所得噬菌体处理、净化生活污水，减少生活污水中病原性细菌的危害。
本研究以从小鹅中提取的大肠杆菌为宿主菌，从污水中分离噬菌体并进行纯化，最后绘制一步生长曲线。
1材料与方法1.1材料1.1.1菌种及样品菌种：从小鹅中提取的大肠杆菌，由老师提供。
污水来源：主要来自于农大出水口。
1.1.2试剂1mmol/L CaCl2溶液1.1.3试剂的配制(1) 液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨5g，牛肉膏1.5 g，NaCl 2.5g，加H2O至500mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌。
(2) 3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，NaCl 1.5g，加H2O 至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌。
(3) 固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌。
(4) 半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌。
1.1.4主要仪器电热恒温培养箱（SHEL·LAB）、电热恒温水温箱（HHW21·Cu600，XMTD）、恒温摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）、通风柜（M·TFG-A）、医用净化工作台（苏净集团安泰公司）、台式离心机（eppendorf）、台式高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER）、超低温冰箱（Forma Scientific）、YM50全自动不锈钢立式电热蒸汽消毒器、针头式细菌过滤器、0.22μm微孔滤膜（上海市新亚净化器件厂）、微量移液器（GILSON）、UVette(Eppendorf)。
1.2方法1.2.1噬菌体的分离1.2.1.1摇菌老师提供的大肠杆菌液加入5mL1×牛肉膏液体培养基，混合后，37℃振荡（120rpm）14h，此时大肠杆菌达到了对数生长期，取出4℃保存。
大肠杆菌噬菌体的分离_纯化及其特性研究_郭秋菊
图 3 噬菌体的电镜观察照片
a、b. 不经离心、过滤的样品; c、d、e. 经离心、过滤的样品, .f 离心的样品
F ig. 3 The e lectron m icrographs o f the phage
2 76
菌种 具可收缩尾的噬菌体
短尾噬菌体
厦门大学学报 (自然科学版 )
表 2 不同保 存方法的保存效果比较 T ab. 2 T he compare of e ffect between d iffe rent conserva tion w ay s
现在噬菌体在人畜鱼的传染性疾病的防治方面发挥着重要的作用在国内自上世纪50年代应用绿脓杆菌噬菌体治疗大面积烧伤病人继分离了噬菌体研究了它们的生物学特性探讨了它们的应用价值试图应用于鸡等感染性疾病的防治但是这些研究大多数集中在人和动物传染性疾病的防治方面在环境的治理方面的应用研究报道较少因此我们试图分离纯化污水中的噬菌体掌握其生物学性质应用所得噬菌体处理净化生活污水减少生活污水中病原性细菌的危害
收稿日期: 2008 09 30 基金项目: 国家基础科学人才培养基金 ( J0630649) , 2007 年教育部
大学生创新计划项目资助 * 通讯作者: m sshen@ xmu. edu. cn
1 材料与方法
1. 1 菌株来源及培养 菌种: 大肠杆菌 ( E. coli ) CMCC ( B ) 44103( 由厦门
体处理的污水, 总菌数下降了 30% 左右, 大肠杆菌总数下降 90% 以上.
关键词: 大肠杆菌; 噬菌体; 分离; 纯化; 特性
中图分类号: Q 939. 48
文献标识码: A
文章编号: 0438 0479( 2008) S2 0273 05
鲍曼不动杆菌烈性噬菌体的分离与纯化
Purification of Acinetobacter baumannii bacteriophage
LIANG Li，YANG Hongjiang，JIN Xin
（ Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology， Tianjin University of Science ＆ Technology，Tianjin 300457 ， China）
88
生 物 学 杂 志 Vol． 27 No． 4 Aug， 2010 JOURNAL OF BIOLOGY
第 27 卷第 4 期 2010 来自 8 月体制剂 。本文以一株鲍曼不动杆菌噬菌体 AB1 为研 Sepharose 4B 究对象， 分析比较了聚乙二醇 6000 沉淀 、 DEAE52 凝胶过滤和 阴离子交换等方法提纯噬菌体 的效率 。 1 材料和方法 1． 1 材料 鲍曼不动杆菌 KD311 （ A． baumannii 311 ） ， 为临床 。 AB1 KD311 （ A． baumannii 分离 菌 株 噬 菌 体 是以 311 ） 为指示菌， 从渤海湾淤泥中分离的烈性噬菌体 。 实验中， 聚乙二醇 6000 （ PEG6000 ） 用于沉淀噬菌 体； Sepharose 4B （ 预 溶 胀 颗 粒 ） 用 于 凝 胶 过 滤 层 析； DEAE52 用于阴离子交换层析 。 1． 2 方法 （ 1 ） 噬菌体的扩增 。 以 KD311 为指示菌， 制备含 有 AB1 噬菌斑的双层平板 。 用无菌牙签挑取单个噬 40℃ 保温 1h 活化噬 菌斑悬于 1mL LB 液体培养基中， 菌体 。过滤 除 菌 后 的 上 清 液， 与对数生长期的菌株 KD311 混 合， 35℃ 振 荡 培 养 至 澄 清， 10000r / min 离 心 20min 去除细胞 碎 片， 获 得 粗 的 噬 菌 体 扩 增 液。 （ 2 ） PEG 沉淀 噬 菌 体 。 向 噬 菌 体 扩 增 液 中 加 入 PEG6000 固体， 终 浓 度 为 10% （ w / v ） ， 混 匀 溶 解 后 4℃ 过 夜， 10000r / min 离心 20min ， 弃掉上清， 沉淀用 pH 值 7. 4 ， 0. 1mol / L 的磷酸盐缓冲液溶解 。 （ 3 ） 样品透析 。 上述 选择 pH 值 样品置于透析袋 （ 截留分子量 10000 ） 中， 7. 4 ， 0. 1mol / L 的磷酸盐缓冲液作 为 透 析 液， 4℃ 透 析 24h， 去除样品中的 PEG。 （ 4 ） Sepharose 4B 凝胶过滤 层析。用蒸馏水洗涤预溶胀的 Sepharose 4B 凝胶颗粒 0. 1mol / L 的磷酸盐缓 至无乙醇味， 然后用 pH 值 7. 4 ， 脱气后装柱 （ 1. 0 × 70. 0cm ） 。 用磷酸盐缓 冲液处理， 冲液 充 分 平 衡 后， 取 1mL 经 透 析 的 样 品 上 样 。 以 0. 2mL / min 流速洗脱， 2mL / 管收集 。 采用紫外吸收法 测定 A280 值， 计算蛋白质含量， 同时采用双层平板法计 。 （ 5 ） DEAE52 阴离子柱层析 。 DEAE数噬菌体滴度 52 树脂用 蒸 馏 水 溶 胀 后， 按 照 碱酸碱 顺 序， 分别用 0. 5mol / L 的 NaOH 溶 液 和 0. 5mol / L HCl 溶 液 处 理 30min， 0. 1mol / L 蒸馏水洗至中性， 最后用 pH 值 7. 4 ， 的磷酸盐缓冲液处理， 脱气后装柱（ 2. 6 × 30cm ） ， 用磷 5mL 酸盐缓冲液充分平衡后， 取 凝胶纯化后样品 上 用极限浓度为 1mol / L NaCl 的缓冲液进行梯度洗 样， 脱， 流速为 1mL / min 。5mL / 管收集， 采用紫外吸收法测 定 A280 值， 计算蛋白质含量， 同时采用双层平板法计数 噬菌体滴度 。（ 6 ） 噬菌体滴度计数 。 将噬菌体溶液系 与 对 数 生 长 期 的 菌 株 KD311 混 和， 吸附 列稀 释 后， 15min 后与 5mL 半固体培养基（ 50℃ 保温） 混合， 倒在 底层固体培养基上， 凝固后倒置 35℃ 培养 3 ～ 4h ， 噬菌 斑计数 。（ 7 ） 蛋白质浓度测定 。 采用紫外分光光度计
大肠杆菌噬菌体的分离纯化及效价的测定
噬菌体的分离纯化及效价的测定1 目的1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2 学会检查噬菌体的方法。
1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2 原理噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，其个体形态极其微小，用常规微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清，或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，快速检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）。
为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，约需12h左右，因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染，以采取必要的防治措施。
根据正常发酵（培养）液离心后菌体沉淀，上清液蛋白含量很少，加热后仍然清亮；而侵染有噬菌体的发酵（培养）液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加热后发生蛋白质变性，因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。
此法简单、快速，对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。
噬菌体的效价即１mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。
效价的测定一般采用双层琼脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
3 材料3.1菌种敏感指示菌（大肠杆菌）、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。
3.2培养基二倍肉膏蛋白胨培养液，上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管５mL），下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基（含琼脂2%），1%蛋白胨水培养基。
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噬菌体的分离与纯化实验用具及材料
1.菌种：大肠杆菌
2.试剂：氯仿
3.培养基：
1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，
NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；
2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，
NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭
菌；
3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入
1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌；
4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入
0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌
4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌
过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴
锅，离心机等
实验步骤
1.噬菌体的分离
（1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置
37℃培养过夜。
/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下
菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混
合后置37℃振荡培养12～24h。
（3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一
无菌离心管中。
（4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯
仿，稍作混合，备用。
（5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养
基表面上。
待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，
置37℃培养过夜。
如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明
或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。
2.噬菌体的纯化
（1）取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀；
（2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃（可预先溶化后置45～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的
混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37℃培
养12~24h；
（3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。
此过程制备的裂解液中往往
有多种噬菌体，需进一步纯化；
（4）纯化时，通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一下，蘸取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中，置37℃振荡培
养，直至试管中菌悬液由浑浊变清；培养物经离心后取上清
液，再重复步骤⑵、⑶直到出现的噬菌斑形态一致为止
注意事项
1.使用仪器要保证是灭菌的；
2.注意琼脂的浓度；
3.氯仿是易燃品，应远离火焰
一、生物测定法
1、双层琼脂平板法
1）倒下层琼脂
融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。
2）倒上层琼脂
融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入大肠杆菌菌液0.2mL，上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。
3）恒温培养
30℃恒温培养6～12h观察结果。
4）观察结果
如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑──噬菌斑。
2、单层琼脂平板法
省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%，融化后冷却至45℃左右，如同上法加入大肠杆菌和噬菌体增殖液，混合后迅速倒平板。
30℃恒温培养6～16h后观察结果。
噬菌体效价的测定
1、倒平板
将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。
2、稀释噬菌体
按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有
4.5mL1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6稀释度。
噬菌体与菌液混合
将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。
分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。
接种上层平板
将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基
5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立
即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。
水平静置，凝固后置37℃培养。
观察并计数
观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于实验报告表格内，选取每皿有30～300个噬菌斑的平板计算噬菌体效价。
❖计算公式：N=Y/V×X
（Ｎ：效价值，Ｙ：平均噬菌斑数／皿，Ｖ：取样量，Ｘ：稀释度）
例如：当稀释度为10-6时，取样量为0.1mL/皿，同一稀释度中３个平板上的噬菌斑的平均值为186个，则该样品的效价为：Ｎ＝186
／0.1×10-6＝1.86×109。
结果
1、噬菌体检查
2）绘出平板上的噬菌斑检测结果，指出噬菌斑和宿主细菌。
2、噬菌体效价测定
1）平板上噬菌斑数目
噬菌体稀释度10-410-510-6对照
噬菌斑数（个）/皿
平均每皿噬菌斑数目
2）计算噬菌体效价(即噬菌斑形成单位pfu,plague-formingunit).。