GST pull-down原理及方法

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GST pulldown实验技术

➢ 2、将过夜培养物按1:100比例接入200ml LB(Amp＋) ，220rpm， 30℃培养至OD600=0.4-0.6;
➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清（如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
GST pull-downFra bibliotek示意图Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备

GSTpulldown的原理以及具体操作流程

实验目的:体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。

用于验证两个已知蛋白的相互作用,或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase)融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。

因此,当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

试剂:NaCl, KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分装)，PMSF（Amersco),Cocktaier（Merck 539134)，Immobilized Glutathione（PIERCE 15160)实验操作程序：材料及试剂探针蛋白与GST融合的原核蛋白,裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS及PBS+1％Triton-100PBS （1L)NaCl： 8gKCl： 0。

2gNa2HPO4： 1。

44gKH2PO4: 0。

24g加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7。

4，最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌！4℃保存备用！PMSF(苯甲基磺酰氟) MW：174。

19 工作浓度0。

1-1mM，这里使用1mM,储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20℃或者4℃（以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用）1：原核融合蛋白A的获得1。

1：将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21（DE3)菌株1。

2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp）的10ml试管里，37℃培养过夜1。

3：将培养菌液转移到含有500ml LB（+100ug/mlAmp）的1L锥形瓶中，37℃,225rpm培养至OD600≈1.0—1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整）。

GST pull-down实验技术

Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
GST pull-down 示意图
Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性

gst pull down原理

gst pull down原理Gst Pull Down原理Gst Pull Down是一种视频处理技术，用于将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频。

这种技术可以提高视频的平滑度和流畅度，使观看体验更佳。

本文将详细介绍Gst Pull Down的原理。

一、什么是Gst Pull Down？Gst Pull Down是一种视频处理技术，用于将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频。

在电影制作中，通常使用24帧/秒来拍摄和编辑电影。

但是，在播放时，大多数电视和显示器都以30帧/秒的速度播放视频。

因此，如果直接播放24帧/秒的电影，则会出现画面抖动或不流畅等问题。

二、为什么需要Gst Pull Down？在播放24帧/秒的电影时，由于每个画面之间存在较长时间间隔，因此画面会出现抖动或不流畅等问题。

而将24帧/秒转换为30帧/秒，则可以使画面更加平滑流畅，提高观看体验。

三、Gst Pull Down原理1. 3:2 Pulldown在进行Gst Pull Down时，通常采用3:2 Pulldown方法。

这种方法利用了电影制作中使用的24fps（frames per second）与NTSC （National Television System Committee）制定的30fps之间的差异。

具体来说，将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频，需要将每个电影画面分成两个半画面，然后再将其转换为三个NTSC画面。

2. 操作步骤具体来说，Gst Pull Down的操作步骤如下：（1）将24fps的电影分成两个半画面（Odd Field和Even Field）；（2）将Odd Field插入到第一帧和第二帧之间，形成一个新的NTSC 画面；（3）将Even Field插入到第三帧和第四帧之间，形成另一个新的NTSC画面；（4）重复以上步骤，直到所有24fps电影画面都被转换为30fps视频。

3. 效果通过Gst Pull Down处理后，原本24fps的电影就可以以30fps的速度播放，并且画面更加平滑流畅。

分子生物学常用实验方法原理介绍

分子生物学常用实验方法原理介绍一、GST pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

此方法简单易行,操作方便。

注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。

其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA 序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。

三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。

染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA 片段沉淀下来。

染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。

四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。

GST-pull-down实验原理与步骤

GST pull down实验原理与步骤GST pull down（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，可验证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。

此方法操作方便，简单易行。

GST pull down实验原理GST pull down的主要原理是利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合，而融合蛋白通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）亲和结合。

简单来说，我们假定a蛋白和b 蛋白可能存在互作，将纯化的融合GST的a蛋白和纯化的b蛋白以及能特异性结合GST 的Sephrose 4B beads混合在一起孵育一定时间，然后洗去未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳。

通过Western blot检测结果，我们可以看到GST-a蛋白和b蛋白所对应的条带，即表明了a蛋白和b蛋白因发生相互作用而被GST-a pull down（GST对照只显示一个条带）。

GST pull down实验步骤一、GST-a融合蛋白的制备1．GST-a融合蛋白的表达(1)将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中；(2)挑取单克隆到含有5ml LB培养基（加入5ul氨苄）的10ml试管里，37℃恒温振荡培养箱中培养过夜；(3)将培养菌液转移到含有500ml LB（含500ul氨苄）的1L锥形瓶中，37℃，200rpm培养数小时；(4)测定OD600值，当OD600达到0.6左右时，加入适当浓度的IPTG，在20℃，200rpm 条件下培养10-16h（通常需要进行预实验以确定最佳IPTG浓度、诱导温度和时间）；(5)诱导适当时间后，将菌液分次倒入50ml离心管中，4℃4000rpm离心10分钟，然后弃去上清，收集管底菌体，如暂时不用，可将菌体保存于-80℃冰箱中；(6)先加入少量PBS于离心管中，离心5-10min后弃去上清，再按每10ml菌液沉淀1ml PBS 的量加入相应的PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于PBS溶液中；(7)把混合菌体置于冰水浴中，用超声仪进行破碎。

GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）

GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）1、⽤GST-PAK-CRIB融合蛋⽩载体转化BL21感受态细菌，37℃培养过夜，12-16h之后出现菌
落；
2、挑取阳性单克隆，接种到含有抗⽣素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中剧烈振摇⾄菌
液OD600值在0.4-0.6之间时，加⼊IPTG 0.1mmol/L诱导，继续孵育3-4h，离⼼，收集菌体（可
以-70℃保存备⽤）；
3、加⼊2 ml细菌裂解液（含蛋⽩酶抑制剂），重新悬浮菌体，冰上振荡15 min；
4、12000 rpm离⼼10 min，取上清；
5、向上清中加⼊100 µl的含有⾕胱⽢肽的琼脂糖磁珠（⽤之前需⽤washing buffer洗涤3
次），4℃旋转混合⾄少30min，再⽤washing buffer洗3次；
6、从培养的细胞中提取全蛋⽩，取蛋⽩200µg，与上述琼脂糖磁珠混合，⽤washing buffer 补
⾜300 µl，4℃旋转孵育⾄少1 h，⽤于沉淀细胞中的⽬的蛋⽩，（注：此步反应的温度和孵育时
间均需根据不同的的蛋⽩进⾏优化，孵育的最后阶段进⾏略微的涡旋震荡能够去掉⾮特异性结
合的蛋⽩，降低背景）；
7、⼩⼼移去上清，⽤400 µl washing buffer 洗3-5次，第⼀次可室温孵育5 min，并在孵育过程
中偶尔进⾏混匀；
8、向琼脂糖磁珠中加⼊30 µl 2×SDS-PAGE加样缓冲液，沸⽔浴5 min，直接加样进⾏SDS-
PAGE蛋⽩电泳；
9、以下实验操作同westernblotting（见前天实验流程）。

GSTpulldown的原理以及具体操作流程

实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。

用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST (Glutathione S transferase)融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH( Glutathione )亲和结合。

因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离试齐U： NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Trit on-100 , IPTG(Merck 分装)，PMSF( Amersco)，Cocktaier ( Merck 539134 ), Immobilized Glutathione ( PIERCE 15160 )实验操作程序：材料及试剂探针蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS 及PBS+1%Triton-100PBS (1L)NaCl : 8gKCl : 0.2gNa2HPO4: 1.44gKH2PO4 : 0.24g加入800ml蒸馏水，用HCI调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌！ 4 C保存备用！PMSF(苯甲基磺酰氟)MW:174.19工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM , 将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20 C或者4C(以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用)1:原核融合蛋白A的获得1.1 :将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37C培养过夜1.3:将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37C, 225rpm培养至OD60B 1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间(诱导条件需要根据不同的蛋白做调整).6000g, 10分钟，4C离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20 C 放置O/N1.4 :室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液 (PBS+1%Triton-100+PMSF ),吹打混匀1.5:冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。

gstpull down实验原理

gstpull down实验原理GSTP（Global Software Test Platform）是一种基于客户端-服务器架构的软件测试平台，它可以实现分布式测试、自动化测试以及测试工具的集成。

GSTP的核心技术之一就是GSTPull Down实验原理。

GSTPull Down实验原理是GSTP中的一种测试方法，用于模拟客户端请求与服务器响应的交互过程。

通过这种方法，可以对服务器的性能、稳定性和负载能力进行评估和验证。

在GSTP中，GSTPull Down实验原理的主要步骤包括：构建测试用例、模拟客户端请求、发送请求到服务器、接收服务器响应、分析响应结果。

下面将对这些步骤进行详细描述。

构建测试用例是GSTPull Down实验原理的第一步。

测试用例是为了模拟真实的客户端请求，通常包括请求的类型、参数、路径等信息。

测试用例的设计要尽可能地贴近真实的使用场景，以保证测试结果的准确性。

接下来，通过模拟客户端请求，将测试用例发送到服务器。

在GSTP中，可以使用自定义的脚本或工具来实现请求的发送。

这些工具可以模拟不同的网络环境、请求频率和负载情况，从而对服务器的性能和稳定性进行全面测试。

服务器接收到客户端的请求后，会进行相应的处理，并生成相应的响应结果。

GSTP会将服务器的响应结果返回给测试者，以方便对响应结果进行分析和评估。

在分析响应结果时，可以根据预先设定的评估指标对服务器的性能进行评估。

评估指标可以包括响应时间、并发数、吞吐量等。

通过分析这些指标，可以了解服务器在不同负载下的性能表现，并找出潜在的性能瓶颈。

通过GSTPull Down实验原理，测试者可以对服务器的性能和稳定性进行全面的评估。

它可以帮助测试者发现服务器的性能瓶颈，优化服务器的配置和性能，提高服务器的负载能力。

GSTPull Down实验原理是GSTP中的一种测试方法，通过模拟客户端请求和服务器响应的交互过程，对服务器的性能和稳定性进行评估和验证。

GST pull-down原理及方法

看他是不是没有你不行, 还是可能有其他的新伙伴.
不做对照, 一厢情愿的希望, 并相信蛋白间的关系是幼稚的.
生物实验中, 单一的证据都是薄弱的, 无论他貌似多么正确, 要通过对照和多方取证才能确定真实的事实.
大家交朋友, 搞对象也类似于此. 关乎终身快乐, 幸福, 不可不察.
Coimmunoprecipitatio的自由恋爱问题. 一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白, 但是最终还是会有个最喜欢的, 而在Co-ip中就能发现他的喜好. 这种关系可能是直接的, 也可能是间接的, 是更接近于东方的.
两个蛋白可能在生物体内素昧平生, 一个在头上, 一个在脚上. 也许两者之间或许很合辙, 生来却天各一方. 在GST pull down 的环境中, 他们可能相遇, 吸引在一起. 但在现实生活中, 这样的浪漫关系可能是不现实的. 脚上的蛋白若是跑到头上与情人幽会, 人就要出大问题. 还有的情况是, 两个蛋白即使独处在一起在其他蛋白, 各种因素适当的辅助下, 却有可能形成稳定的搭档关系.
白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。
GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)
所以, 随缘, 就是像蛋白一样单纯, 却不简单.
有关Control和多方取证.
我们做试验, 都要有实验组, 阴性对照, 阳性对照. 即使体外生化实验都达成了, 还要通过多方取证来确定两个蛋白之间确定的生理关系.

gstpulldown实验技术

安全防护
gstpulldown实验涉及一些危险性因素，如化学试剂的使用、高温高压操作等，因此需要进行相应的安全防护措施。例如，穿戴实验室外套、戴手套、避免直接接触化学试剂等。此外，应定期检查实验室安全设施和应急处理设备，确保实验过程的安全性。
04
gstpulldown实验数据分析
数据收集与整理
详细描述
gstpulldown实验技术与基因芯片等技术结合使用，可以用于检测特定条件下细胞中基因表达的变化。这种方法有助于揭示基因表达的调控机制和分子网络，为研究生物发育、疾病发生发展等方面提供重要信息。
应用案例五：其他领域应用介绍
总结词
gstpulldown技术在其他领域也有广泛的应用，如病毒致病机制研究、免疫学研究等。
详细描述
gstpulldown实验技术在病毒致病机制研究中可用于分析病毒与宿主细胞的相互作用；在免疫学研究中可用于研究免疫细胞的活化和信号转导。此外，它还可用于研究细胞凋
亡、自噬等生物学过程。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
对得到的实验结果进行验证，如通过重复实验或使用不同的蛋白质和DNA探针进行验证。
实验注意事项
1. 选择合适的蛋白质和DNA探针
01
选择的蛋白质和DNA探针应具有代表性，能够反映所研究的问
题的本质。
2. 注意实验条件的一致性
02
为了保证实验结果的可靠性，需要在相同的条件下进行重复实
验。
3. 注意数据的分析和解读
未来发展趋势与展望
发展自动化和智能化技术
随着技术的发展，自动化和智能化将成为未来实验室技术的重要发展方向。通过开发自动化和智能化的Gstpull-down实验技术，进一步提高实验效率和结果的稳定性。

gstpulldown实验技术

gstpulldown实验技术汇报人：2023-12-25•实验简介•材料准备•实验操作目录•结果分析•实验结论01实验简介验证已知的蛋白质相互作用gstpulldown实验可以用于验证已知的蛋白质相互作用，例如验证某个蛋白质是否与特定的结合蛋白相互作用。

发现新的蛋白质相互作用通过gstpulldown实验可以发现新的蛋白质相互作用，从而为研究新的生物学过程和疾病机制提供线索。

确定蛋白质之间的相互作用通过gstpulldown实验可以检测到与特定蛋白质结合的其他蛋白质，从而确定蛋白质之间的相互作用。

蛋白质相互作用gstpulldown实验利用GST（谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白作为诱饵，与细胞或组织提取物中的目标蛋白质进行结合，从而检测到与诱饵蛋白结合的目标蛋白。

分离和纯化通过将GST融合蛋白与谷胱甘肽结合的琼脂糖珠结合，可以分离和纯化与目标蛋白结合的复合物。

检测目标蛋白通过Western blot等技术对分离和纯化的复合物进行检测，从而确定与诱饵蛋白结合的目标蛋白。

实验步骤准备GST融合蛋白和谷胱甘肽结合的琼脂糖珠将GST融合蛋白与琼脂糖珠结合，形成用于捕获目标蛋白的诱饵。

细胞或组织提取从感兴趣的细胞或组织中提取蛋白质混合物。

孵育将细胞或组织提取物与GST融合蛋白结合的琼脂糖珠孵育，使目标蛋白与诱饵蛋白结合。

洗脱和检测洗脱与诱饵蛋白结合的目标蛋白，并利用Western blot等技术进行检测和分析。

02材料准备GST琼脂糖珠磷酸化激酶洗涤液抗体01020304用于绑定目的蛋白，是实验的关键试剂。

用于磷酸化目的蛋白，确保实验的准确性。

用于清洗实验中使用的各种仪器和试剂。

用于检测目的蛋白的表达和磷酸化状态。

离心机用于分离和纯化目的蛋白。

摇床用于孵育实验中的各种反应。

超声波破碎仪用于破碎细胞，释放细胞内的目的蛋白。

凝胶电泳仪和电泳槽用于检测目的蛋白的表达和磷酸化状态。

所需样本细胞或组织样本实验所需的生物样本，需确保其质量和活性。

gst pull down原理

GST Pull Down原理1. 什么是GST Pull DownGST拉伸消除（Pull Down）是一种视频处理技术，常见于旧电影转换为数字格式时使用。

它的目的是将常见的24帧每秒（FPS）的电影转换为更高的电视标准（例如30 FPS）。

Pull Down可以实现补偿和时序调整，以确保电影在更高的帧率下播放时没有抖动或重复帧。

2. Pull Down标准在了解GST Pull Down的原理之前，我们先来了解一下电影和电视的帧率标准。

2.1 电影帧率电影一般采用每秒24帧的拍摄速度进行录制。

这种帧率被广泛接受为电影的标准，因为它能够提供良好的视觉效果，并且在大屏幕上播放时不会引起观看者的不适。

2.2 电视帧率电视的帧率标准因地区不同而略有差异。

常见的帧率标准有30 FPS和60 FPS。

30 FPS被广泛应用于美国和其他一些国家的电视系统，而60 FPS则较常见于游戏和高清电视等应用中。

3. Pull Down原理为了将24 FPS的电影转换为电视标准的30 FPS或60 FPS，Pull Down技术通过在电影的每一帧之间插入额外的帧来实现。

这样可以在不改变原始影像的前提下，将电影平滑地转换为电视标准。

3.1 3:2 Pull Down3:2 Pull Down是最常用的Pull Down技术。

它使用一个3帧和一个2帧的模式来转换电影帧。

1.首先，将电影的第一帧复制两次，形成一个3帧序列（AAA）；2.然后，将电影的下一帧复制两次，形成一个2帧序列（BB）；3.重复以上步骤，直到整部电影被转换完毕。

这样，24 FPS的电影就可以按照30 FPS的标准进行播放。

可以按照相同的原理，将电影转换为60 FPS，只需要重复每一帧的处理即可。

3.2 2:2 Pull Down2:2 Pull Down是另一种常见的Pull Down技术，用于将24 FPS的电影转换为60 FPS。

1.首先，将电影的第一帧复制两次，形成一个2帧序列（AA）；2.然后，将电影的下一帧复制两次，形成另一个2帧序列（BB）；3.交替播放AA和BB序列，每秒播放60帧。

gstpulldown实验技术

拓展应用领域与范围的可能性
拓展应用领域
将gstpulldown技术应用于更多生物学领域，如神经科学、免疫学等。
拓展应用范围
将gstpulldown技术应用于更广泛的应用场景，如药物筛选、疾病治疗等。
跨学科合作
加强与其他学科的交叉合作，共同推动gstpulldown 技术的发展和应用。
未来发展趋势预测与展望
化学分析方法开发
01
分析方法建立
通过gstpulldown实验技术可以建立新的化学分析方法，为化学分析领域提供新的工具和方法。
02
分析方法验证
03
分析方法改进
利用gstpulldown实验技术可以对新的化学分析方法进行验证，确保方法的准确性和可靠性。
基于gstpulldown实验结果，可以对现有化学分析方法进行改进，提高分析的灵敏度和特异性。
有机合成反应研究
反应机理研究
通过gstpulldown实验技术可以研究有机合成反应的机理，了解反应过程中各个中间体的变化情况。
反应条件优化
利用gstpulldown实验技术可以筛选出最佳的反应条件，提高有机合成反应的产率和选择性。
合成策略设计
基于gstpulldown实验结果，可以设计新的合成策略，简化合成步骤，提高合成效率。
VS
局限性
然而，GST Pulldown实验也有其局限性，例如可能会受到非特异性结合的干扰，导致结果出现偏差。此外，该技术需要使用特定的标签蛋白和亲和层析介质，增加了实验成本和复杂性。
02
gstpulldown实验技术操作流程
实验材料准备
GST标签蛋白
将目的蛋白与GST标签融合表达，用于亲和层析实验。

GST-pull down

一、实验步骤1. 重组蛋白表达与纯化1）将将编码蛋白A的GST标签重组质粒转化到BL21或者Rosetta DE3感受态细胞中。

2）向高压灭菌的锥形瓶中倒入150 ml LB培养基，按照1:1000加入氨苄青霉素储液（工作浓度为50 μg/ml）。

用高压灭菌过的10 μl枪头挑取平板上的单克隆菌落，37℃条件下以200 rpm转速振荡培养约6 h，使OD600为0.6-0.8。

3）每管加入按照1:200-1:500加入IPTG（工作浓度为0.2-0.5 mmol/L），20-25℃条件下200 rpm继续振荡培养过夜。

4）4℃条件下4,000 rpm离心15 min，收集细菌沉淀。

a)尽量倒净上清，每管加入10 ml PBS缓冲液重悬细菌，置于冰上超声。

5）4℃，12,000 rpm离心30 min，留取上清并分装后（混匀）于-80℃保存，即为纯化的原核融合蛋白A。

2. GST-pull down实验1）将编码B蛋白的重组质粒转染入HEK293细胞中，48 h后提取细胞总蛋白。

2）留取50 µl蛋白加入2×蛋白样品缓冲液，混匀后100℃金属浴加热10 min使蛋白变性，室温12,000 rpm离心15 s，-20℃保存，作为Input。

3）用预冷PBS缓冲液洗涤Glutathione Sepharose 4B珠子，然后然后按照1:1的比例向Glutathione Sepharose 4B珠子中加入PBS缓冲液并混合均匀。

吸取珠子时应减掉枪尖部分，避免破坏珠子。

4）取适量纯化的原核融合蛋白A（SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色调整各个融合蛋白的蛋白量，如果有验证多个蛋白，比如截短蛋白，保证加到另一个蛋白里的蛋白量一样），加入30-40 µl预处理过的Glutathione Sepharose 4B珠子，4℃颠倒混匀4-6 h。

5）于4℃条件下12,000 rpm离心15 s，弃上清。

GSTpulldown实验技术ppt

详细描述
通过运用gstpulldown技术，科学家们可以研究特定蛋白质在药物作用过程中的变化情况，进而发现新的药物作用靶点。同时，该技术还可用于研究特定疾病过程中蛋白质的变化情况，为疾病的治疗提供理论依据。
gstpulldown技术在生物医药领域的应用
该技术在其他领域也有着广泛的应用，如环境保护、农业科学等。
总结词
通过运用gstpulldown技术，科学家们可以研究特定蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用，进而揭示细胞生命活动的内在机制，为研究疾病的发生机制、药物作用靶点等提供了重要支撑。
详细描述
gstpulldown技术在基础研究中的应用
总结词
该技术在生物医药领域具有广泛的应用前景，为药物研发、疾病治疗等提供了新的思路。
数据分析的挑战
GST Pulldown实验产生的数据量庞大且复杂，需要专门的数据分析技术和工具进行处理。然而，目前数据分析的难度较大，限制了该技术的应用和发展。
随着生物学和医学研究的不断发展，GST Pulldown技术正在不断拓展应用领域。例如，该技术在研究疾病发生机制、药物筛选和生物技术等领域的应用正在不断增加。
加样
将蛋白样品加入到含有GST标签蛋白和Glutathione beads的试管中。
洗涤
将沉淀用水洗涤多次，以去除未结合的蛋白。
孵育
将加样后的试管在室温下孵育1hr左右。
裂解
向沉淀中加入适量的裂解液，将结合的蛋白从beads上解离下来。
离心
将孵育后的试管进行离心处理，分离出沉淀和上清液。
检测
对裂解后的蛋白进行Western blot检测。
总结词
通过运用gstpulldown技术，科学家们可以研究环境中特定蛋白质的变化情况，进而探讨环境污染对人类健康的影响。此外，该技术还可用于研究植物耐受逆境胁迫的机制，为提高作物抗逆性提供理论支持。

GST pull-down质谱分析

百泰派克生物科技GST pull-down质谱分析GST pull-down是利用重组技术将探针蛋白与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白（glutathione-S-transferase，GST）融合，融合蛋白通过GST与固相化在球珠上的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）稳定结合，从而分离出能与融合蛋白相互作用的蛋白的技术。

GST-pull down技术主要在体外验证能和已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质，或者两种蛋白之间是否有相互作用。

其研究对象是已知蛋白质与已知蛋白质的互作验证，或者是已知蛋白质与未知蛋白质的互作验证。

GST pull-down技术可在体外验证并寻找与已知蛋白发生相互作用的潜在未知蛋白，通常需要结合质谱分析鉴定具体的潜在未知蛋白结构或者验证互作蛋白的身份。

具体操作：将GSH固定于琼脂糖珠上，形成GSH-琼脂糖珠，获得带有GST标签的融合蛋白；将带有GST标签的融合蛋白亲和到谷胱甘肽层析柱上获取可能与融合蛋白发生相互作用的蛋白，互作蛋白被亲和到谷胱甘肽层析柱上，切掉标签并洗脱得到互作蛋白。

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并得到含有互作蛋白的胶条；分离后通常质谱检测分析（GST+MS）得到质谱数据，与质谱数据库进行匹配分析从而对互作蛋白进行鉴定，质谱能鉴定到多少蛋白取决于蛋白-蛋白相互结合的强弱、互作蛋白的丰度等。

GST pull-down质谱分析是GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋白互作分析，运用GST pull-down技术验证是否具有相互作用蛋白，联合质谱技术分析鉴定这些潜在互作蛋白的氨基酸序列并结合生物信息学功能预测，可以更深层次的解析蛋白质分子作用机制。

百泰派克生物科技在蛋白互作分析服务及基于质谱的互作蛋白质质谱鉴定分析方面拥有多年经验。

百泰派克生物科技提供Pull-down靶蛋白质谱鉴定服务。

我们以严格的质量控制和较短的检测周期为特色，百泰派克向客户提供可定制的一站式服务，涵盖您项目中从基因合成到数据报告的每个步骤。

GSTpulldown试验方法

GSTpulldown试验方法12.GST蛋白的表达和纯化12.1 GST蛋白的表达（1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。

（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。

（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。

（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。

（5) 加入50μl 100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。

（6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃ 5krpmx5min离心，弃上清。

（7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。

（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。

转移至5ml离心管。

（9) 超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80μl蛋白酶抑制剂(100x)。

破壁参数：Frequency:100～200w 60s，pause 20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。

加100μl 20% TritonX－100，冰上放置30min。

（10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。

（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。

离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。

12.2 准备50%GST Sepharose 4Bslurry（1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀。

（2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。

（3) 加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。

反复5次。

（4) 加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose 4B备用。

12.3 GST融合蛋白的纯化（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%Glutathione Sepharose 4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。

GST-pull-down试验方法(自己总结)

12.GST蛋白的表达和纯化12.1 GST蛋白的表达（1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。

（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。

（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。

（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。

（5) 加入50μl 100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。

（6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃ 5krpmx5min离心，弃上清。

（7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。

（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。

转移至5ml离心管。

（9) 超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80μl蛋白酶抑制剂(100x)。

破壁参数：Frequency:100～200w 60s， pause 20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。

加100μl 20% TritonX－100，冰上放置30min。

（10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。

（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。

离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。

12.2 准备50%GST Sepharose 4Bslurry（1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀。

（2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。

（3) 加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。

反复5次。

（4) 加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose 4B备用。

12.3 GST融合蛋白的纯化（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%Glutathione Sepharose 4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。