单克隆抗体研制最详细步骤
单克隆抗体研制最详细步骤
单克隆抗体研制最详细步骤一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。
因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。
通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。
Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程单克隆抗体是一种由单一克隆的B细胞产生，具有针对特定抗原的高度特异性和亲和力的抗体。
制备单克隆抗体的过程主要包括以下几个步骤：免疫原制备、小鼠免疫、混合细胞瘤制备、细胞筛选与分克隆。
首先，制备免疫原。
根据需要制备一种抗原，可以是纯化的蛋白质、多肽或合成的多肽。
这个抗原通常具有特异性，可用于激发B细胞产生特异性抗体。
其次，选择小鼠免疫。
通常选择小鼠作为免疫动物，因为小鼠的免疫系统较为适合。
给小鼠注射免疫原，激发其免疫反应。
为了增强免疫效果，通常在小鼠体内使用佐剂，如完全弗氏佐剂。
然后，制备混合细胞瘤。
在小鼠接种一段时间后，从其脾脏或骨髓中取出淋巴细胞。
然后通过融合淋巴细胞和骨髓瘤细胞，如骨髓瘤SP2/0，获得混合细胞瘤。
接下来，细胞筛选与分克隆。
将混合细胞瘤悬浮液均匀地滴于含有选择性培养基的平板上，通过稀释法，保证每个细胞得到充分的空间生长。
经过适当的培养时间后，细胞形成单个克隆。
最后，对每个克隆细胞进行培养与鉴定。
收集克隆细胞，经过一段时间的培养，获得充足的抗体。
而后，对培养液中的抗体进行鉴定，采用ELISA和免疫组化方法来确认是否产生了特定抗原的单克隆抗体。
在单克隆抗体制备的过程中，需要注意以下几点：首先，免疫原的制备应保证其纯度和有效性；其次，小鼠对免疫原的免疫应注意适当的剂量和接种时机；再者，混合细胞瘤的制备要控制好融合细胞的比例，避免细胞瘤的过度生长；最后，细胞的培养与鉴定是确保获得高质量单克隆抗体的关键环节，要进行仔细的监测和筛选。
总之，单克隆抗体的制备过程是一个复杂而精细的过程，需要在实验操作中严格控制各个步骤，以确保获得高质量、高特异性的单克隆抗体。
这些单克隆抗体不仅可以应用于科学研究领域，还可以用于临床诊断和治疗。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。
制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。
以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。
步骤一：抗原免疫1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合适的抗原。
2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。
选择适合的动物后，根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。
3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。
通常先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。
步骤二：细胞融合1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。
2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培养基中培养，以供细胞融合使用。
3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。
将其培养至对数生长期。
4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。
步骤三：细胞筛选与扩展1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择杂交瘤细胞。
2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其实现单克隆化。
3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。
步骤四：单克隆抗体鉴定1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，检测其抗原特异性。
2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其在特定细胞或组织中的反应。
3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。
步骤五：单克隆抗体生产与纯化1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。
2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。
3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体进行纯化和浓缩。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程单克隆抗体是一种来源于单一B细胞克隆的抗体，具有高度的特异性和亲和力，被广泛应用于生物医药领域。
其制备流程主要包括免疫原制备、动物免疫、细胞融合、筛选和鉴定等步骤。
下面将详细介绍单克隆抗体制备的流程。
1. 免疫原制备。
首先需要准备纯化的抗原蛋白，可以是蛋白质、多肽、细胞膜蛋白等。
抗原蛋白的纯度和活性对单克隆抗体的制备至关重要，因此需要进行严格的纯化和活性检测。
通常采用亲和层析、离心、电泳等方法进行抗原蛋白的提取和纯化。
2. 动物免疫。
将纯化的抗原蛋白注射到小鼠或兔子等动物的体内，诱导其产生特异性抗体。
在免疫过程中，需要注意控制免疫程序，监测抗体滴度，以及合理调整免疫方案，以提高单克隆抗体的产量和质量。
3. 细胞融合。
从免疫动物中获取脾细胞或骨髓细胞，与骨髓瘤细胞（如SP2/0、NS-1等）进行融合，得到杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有较高的产抗体能力，能够长期稳定地分泌单克隆抗体。
4. 筛选和鉴定。
通过ELISA、免疫印迹、细胞免疫荧光等方法对杂交瘤细胞培养上清液进行筛选和鉴定。
筛选出特异性较强的单克隆抗体阳性杂交瘤细胞，并进行亚克隆的鉴定，最终获得单克隆抗体细胞株。
5. 扩大培养和纯化。
将筛选出的单克隆抗体细胞株进行扩大培养，获得大量的单克隆抗体上清液。
然后采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法对单克隆抗体进行纯化，获得高纯度的单克隆抗体制剂。
总结。
单克隆抗体制备流程是一个复杂而又精细的过程，需要在每个环节都严格控制条件，确保单克隆抗体的产量和质量。
通过上述步骤的实施，可以获得高效、高纯度的单克隆抗体，为生物医药领域的研究和应用提供有力支持。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程
一、抗体cDNA克隆
2、结合分离：抗体和抗原之间采用免疫学方法，进行亲和结合分离，在病理学中，可以采用细胞亲和免疫电泳或者细胞色素紧缩技术来进行识
别性结合分离抗体。
3、mRNA提取：使用RNAsy Plus Kit根据操作说明提取亲和结合分
离后的抗体的mRNA，用于cDNA合成。
4、cDNA合成：使用双链cDNA合成试剂盒，根据说明书操作，将mRNA合成双链cDNA。
5、克隆：将双链cDNA进行克隆，经过构建的一系列步骤，最终将cDNA克隆到载体上，构建出抗体cDNA克隆库。
二、抗体cDNA克隆抗体制备
1、选择克隆体：选择抗体cDNA克隆库中的抗体表达克隆，采用PCR
技术进行选择，并检测克隆体具有良好的免疫特性，可以快速确定最佳克
隆体。
2、表达载体构建：将最佳克隆体插入到表达载体中，构建出属于克
隆体的表达载体，以此保证克隆体的正确表达。
3、表达系统筛选：利用多种表达系统，筛选出最佳的表达系统，以
此来达到最佳的表达效果。
4、表达调控：对于最佳的表达系统，根据cDNA克隆体的特性，进行
最佳的表达调控，以此达到最佳的抗体表达效果。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
单克隆抗体技术操作流程
单克隆抗体技术操作流程一、免疫原制备免疫原是制备单克隆抗体的关键，它可以是蛋白质、多肽、病毒、细胞表面分子等。
首先需要获得纯度高的免疫原，并进行适当的处理，如去除杂质、进行修饰等。
接下来，将免疫原与适当的佐剂混合，以增强免疫原的免疫原性，如将免疫原与完全佐剂混合，然后注射到小鼠等实验动物体内。
二、免疫动物免疫将制备好的免疫原注射到实验动物体内，激发其免疫系统产生抗体。
通常情况下，需要多次免疫以增强免疫效果。
在每次免疫后，需要采集动物的血清样本，检测抗体的产生情况。
可以使用酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法对血清中的抗体进行检测。
三、细胞融合与筛选当动物产生了满意的抗体效价后，需要从其脾脏等淋巴组织中获得抗体产生的细胞。
将脾脏细胞与骨髓瘤细胞（如NS-1细胞）进行融合，形成杂交瘤细胞。
融合后的细胞具有双亲细胞的优点，既能产生抗体，又具有无限增殖的能力。
为了筛选出产生特异性抗体的杂交瘤细胞，通常需要进行限稀稀释、酶标记法、细胞毒性试验等步骤。
其中，限稀稀释法是最常用的筛选方法，通过将杂交瘤细胞逐级稀释，最终得到单个细胞的克隆。
然后，将这些单克隆细胞扩大培养，并对其产生的抗体进行筛选和鉴定。
四、抗体纯化与鉴定通过培养和扩增单克隆细胞，可以得到大量的单克隆抗体。
接下来，需要对抗体进行纯化和鉴定。
纯化可以使用各种离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等技术，去除杂质，得到纯度较高的抗体。
鉴定抗体的特异性和亲和力是非常重要的步骤。
特异性可以通过免疫印迹、免疫组化等方法进行检测，判断抗体是否能够特异性地结合目标抗原。
亲和力可以通过表面等离子共振（SPR）等技术进行测定，评估抗体与抗原的结合强度。
五、应用和保存经过纯化和鉴定后，单克隆抗体可以应用于多个领域，如医学诊断、生物学研究、药物开发等。
在应用过程中，需要根据具体需求对抗体进行合适的标记和修饰，以提高其应用效果。
为了保存单克隆抗体，可以将其冻存于低温下，如-20°C或-80°C。
单抗制备的详细步骤
单抗制备的详细步骤单抗（monoclonal antibody）是由单一细胞母克隆细胞系产生的抗体，具有高度特异性和一致性。
单抗制备的过程通常包括免疫原的选择、动物免疫、细胞融合、克隆筛选和克隆扩增等步骤。
下面将详细介绍这些步骤。
第一步，免疫原的选择。
免疫原是制备单抗必不可少的关键组成部分。
免疫原的选择应基于目标抗体的特异性和重要性。
常用的免疫原包括蛋白质、多肽、多糖、细胞表面分子等。
为了提高免疫原的免疫原性，可以将免疫原与佐剂混合，以增强其免疫原性。
第二步，动物免疫。
将选择的免疫原注射到合适的动物体内。
常用的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子等。
在免疫过程中，通常需要多次免疫，在每次免疫之间有一定的间隔时间，以增强免疫效果。
在免疫的过程中，可以通过采血检测免疫反应的进展，并决定最佳的免疫时间点。
第三步，细胞融合。
在免疫过程中，免疫细胞会产生针对免疫原的抗体。
为了制备单抗，需要将这些抗体产生的免疫细胞与癌细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
常用的癌细胞包括骨髓瘤细胞、葡萄膜炎细胞等。
第四步，克隆筛选。
将细胞融合密度适宜的细胞悬浮液均匀分配到培养皿中，使单个杂交瘤细胞分布在不同的培养皿中。
培养皿中含有特定选择性培养基，使只有杂交瘤细胞能够存活和生长。
在适当的条件下，杂交瘤细胞会形成一个细胞克隆。
然后，可以通过ELISA、细胞培养和动物注射等方法对克隆的细胞上清液进行筛选，以检测是否含有特定的抗体。
第五步，克隆扩增。
通过继续培养和传代，可以扩增含有特定抗体的细胞克隆。
克隆扩增的时间可能需要数周或数月，具体取决于细胞系的生长速度和特性。
最后，可以将克隆扩增的细胞培养液进行纯化和浓缩，以获得高纯度的单抗。
通常使用亲和层析、离心、电泳等技术进行单抗的纯化。
单抗制备的最终产品可以用于医学研究、诊断和治疗等领域。
尽管以上步骤可以概括标准的单抗制备过程，但实际制备中可能因为不同的实验目的和具体需求而存在一些变化。
制备单抗是一个复杂而耗时的过程，需要专业的实验技术和丰富的经验。
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程
抗体制备实验一般分为抗体克隆、筛选、纯化和表征四个步骤，其中
抗体克隆是抗体制备实验的前提步骤，克隆抗体是从雌配子小鼠体内得到
其对抗原的单克隆抗体，是抗体制备的关键步骤。
1. 合成抗原或者从天然资源中获取抗原：合成抗原包括多肽抗原
（如biotin-GSH等）和糖蛋白抗原（如活性细胞皮质激素等）；从天然
资源中获取抗原则包括病毒样本和免疫原，比如结核分枝杆菌的血清浆及
其他微生物。
2.接种抗原：根据抗原的不同，采用不同的接种方法，比如多肽抗原，可以采用皮下或肌肉注射的方法将抗原接种于雌配子小鼠身上，以致于小
鼠体内产生对抗原的抗体。
3.分离抗体：通过血液和胸腺组织中抗体的分离筛选，获取单克隆抗体。
4. 抗体克隆：从抗体分离所获得的抗体，经过细胞学的方法进行抗
体克隆。
克隆过程中，可以利用多肽抗原，利用细胞杂交的方法进行对单
克隆抗体的从cloned。
5.筛选单克隆抗体：利用免疫染色的方法进行抗体筛选和确认，以确
定抗体株。
6.抗体纯化：经过单克隆抗体筛选和确认后，可以利用离子交换柱等
方法进行抗体纯化，从而获得高纯度的抗体制剂。
生物制药中的单克隆抗体生产方法
生物制药中的单克隆抗体生产方法单克隆抗体是生物制药领域中重要的工具和药物，用于治疗多种疾病，包括癌症、自身免疫性疾病和传染病等。
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度的特异性和亲和力，能够针对特定的抗原或分子结构进行有效的识别和结合。
生物制药中的单克隆抗体生产方法主要分为以下几个步骤：1. 免疫兔子或小鼠：首先，将目标抗原注射到兔子或小鼠体内，刺激其免疫系统产生抗体。
这一步骤通常需要多次免疫，并进行适当的免疫增强。
2. 建立细胞株：采集免疫兔子或小鼠的淋巴细胞或骨髓细胞，并与肿瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞具有淋巴细胞的抗原结合能力和肿瘤细胞的不限制生长特性，能够长期产生单克隆抗体。
3. 筛选单克隆抗体：使用细胞培养技术将杂交瘤细胞培养扩增，并进行单克隆抗体筛选。
通常，可以利用特定的抗原结合试验或酶联免疫吸附试验来鉴定单克隆抗体的特异性和亲和力。
4. 生产大量单克隆抗体：通过将筛选得到的单克隆抗体细胞株进行大规模培养，可以获得大量的单克隆抗体。
细胞培养通常在生物反应器中进行，提供适当的培养基和生长条件，以促进细胞生长和抗体产生。
5. 抗体纯化和研发：对培养产生的细胞上清液进行纯化，去除其他蛋白质和杂质，获得纯度较高的单克隆抗体。
然后，可以对单克隆抗体进行进一步的研发和改良，如修饰抗体结构、提高亲和力等。
需要注意的是，单克隆抗体的生产是一个复杂和漫长的过程，需要耗费大量的时间和资源。
此外，还需要严格的质量控制和合规性要求，以确保生产的单克隆抗体符合相关的规定和标准。
除了传统的小鼠抗体生产方法外，近年来也出现了一些新的技术和方法，提高了单克隆抗体的生产效率和质量。
例如，可以利用转基因动物（如转基因小鼠或兔子）产生人源化的单克隆抗体。
此外，还可以利用体外合成抗体技术，通过基因工程方法合成和生产单克隆抗体，避免了动物的使用和伦理道德问题。
总之，单克隆抗体的生产方法是生物制药领域的重要研究内容之一。
单克隆抗体的制备标准流程
单克隆抗体旳制备流程（一）动物旳选择与免疫1．动物旳选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝旳活动范畴小，体弱，食量及排污较小，一般环境干净旳实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术旳实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适旳免疫方案对于细胞融合杂交旳成功，获得高质量旳McAb 至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原旳特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不适宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是某些弱抗原）旳免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原旳免疫原性，另一方面可减少抗原旳使用量。
②变化抗原注入旳途径，基本免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂，提高机体旳免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原旳反映性。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得较好旳免疫效果。
以细胞性抗原为例，免疫时规定抗原量为1～2×107个细胞。
初次免疫1×107/0.5ml ip↓2～3周后第二次免疫1×107/0.5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv↓取脾融合（二）细胞融合1．细胞融合前准备（1）骨髓瘤细胞系旳选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散旳细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞，则可增进这些细胞生长繁殖，所加入旳这种细胞数被称为饲养细胞。
单克隆抗体的制备技术
单克隆抗体的制备技术单克隆抗体是一种特定的抗体，由同一种克隆的B细胞产生，并具有相同的抗原结合特异性。
这种抗体制备技术是通过将B细胞与瘤细胞融合而形成的杂交瘤细胞来实现的。
以下是关于单克隆抗体制备技术的详细解释。
1. 免疫原制备：要制备单克隆抗体，首先需要准备免疫原。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖脂或其他小分子化合物。
免疫原的选择基于所需抗体的特异性。
一般来说，免疫原应具有较高的纯度，并且能够激发免疫系统产生特定的抗体。
2. 免疫动物免疫：接下来，将免疫原注射到实验动物体内，以激发其免疫系统产生抗体。
常用的实验动物包括小鼠、大鼠或兔子。
在注射过程中，免疫原通常与佐剂混合以增强免疫反应。
注射免疫通常在一段时间内进行多次，以确保充分激发免疫系统产生抗体。
3. B细胞的筛选和融合：在动物免疫后，从其脾脏或骨髓中收集B细胞。
这些B细胞是产生抗体的主要细胞类型。
通过在培养基中培养，可以增加B细胞的数量。
然后，将这些B细胞与一种名为骨髓瘤细胞的癌细胞融合。
这种骨髓瘤细胞有着无限增殖的能力，而B细胞则提供了抗体生产所需的特定性。
4. 杂交瘤细胞的筛选：融合后的细胞形成了杂交瘤细胞。
这些细胞具有两个来源的特性，具有骨髓瘤细胞的无限增殖能力和B细胞的抗体产生能力。
为了筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞，可以使用细胞培养基中的特定抗原进行筛选。
只有与特定抗原结合的杂交瘤细胞才能存活和增殖。
5. 克隆的建立：经过筛选后，单个杂交瘤细胞被分离并单独培养，以建立纯化的单个细胞克隆。
这些克隆细胞会持续产生与免疫原结合的特定抗体。
这些单克隆抗体可以通过培养细胞并收集培养上清液来获取。
6. 单克隆抗体的纯化和特性分析：单克隆抗体的纯化是将其从其他细胞产物和杂质中分离出来。
这通常包括离心、过滤和亲和层析等步骤。
纯化后的抗体可以进行各种特性分析，如亲和性测定、特异性测定和功能性分析等。
这些测试可以验证抗体的特异性和效能。
总结：单克隆抗体的制备技术是一种通过将免疫的动物B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞的方法。
【原创】单克隆抗体研制最详细步骤!!!
【原创】单克隆抗体研制最详细步骤5、杂交瘤细胞的冻存与复苏（1）杂交瘤细胞的冻存在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故，如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难，通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子，以免遭到不测。
在杂交瘤细胞建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。
细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度（0℃——-20℃，每分钟下降1℃；-20℃——-40℃每分钟下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。
下面介绍我们实验室的细胞冻存方法，经几年来对多种细胞的使用，细胞复苏存活率均在80%以上。
A、材料：a. 带盖吸管筒一只（铝质或洋铁皮制），内壁（包括筒底和盖）衬1-2层石棉纸或石棉布。
b. 含10-20%血清、5-10% DMSO的HT培养基，冰浴降温至0℃左右（用作冻存液）。
c. 灭菌安瓶或带盖小瓶。
d. -70℃冰箱。
e. 液氮及液氮罐。
f. 处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞。
B、方法：a. 将杂交瘤细胞（或其他细胞）离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为106-107左右/ml，分装安瓶，每瓶1ml，置冰浴上；安瓶上标明细胞名称、冻存日期、批号等。
b. 安瓶封口后仍置冰浴上。
c. 将安瓶放入一带收口绳的小布袋内，布袋上标明冻存号、细胞名称等，立即将布袋放入吸管筒内，置-70℃冰箱。
d. 2-4小时后或过夜后从-70℃冰箱取出吸管筒，将盛有细胞的布袋移入液氮罐；在布袋的线绳上作好标记或代码；最后在液氮冻存簿上作详细记录。
e. 液氮罐应定期补充液氮（最好是专人管理）；补充液氮及存取细胞时应带保护眼镜和手套，以免因液氮冻伤等。
（2）杂交瘤细胞的复苏杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。
单克隆抗体的制备流程及基本原理
单克隆抗体的制备流程及基本原理
原理：在体液免疫反应中，一个抗原分子上可能含有许多抗原决定簇（即表位），每个淋巴细胞都会产生针对一个抗原决定簇的特异性抗体，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定簇反应，其专一性极高。
大量培养此细胞株，即可有质量一定、纯度均一的抗体，此即为单克隆抗体。
基本过程：先免疫动物，分离脾细胞，准备骨髓瘤细胞的准备，细胞融合，筛选与克隆融合细胞，最后大量制备单克隆抗体。
单克隆抗体制备流程图
单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具.制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备（一）免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1。
颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0。
5ml ip （腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×10７／0。
5ml ip或iv（静脉内注射）↓取脾融合2。
可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂，常用佐剂:福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。
商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│（一般0.8~1ml 0.2ml／点）↓3周后第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0。
5ml）↓3周后第三次免疫剂量同上,不加佐剂,ip│（5～7天后采血测其效价，检测免疫效果）↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体制备的详细步骤
单克隆抗体制备的详细步骤1.抗原选择：首先，需要选择目标抗原，该抗原可以是蛋白质、多肽或糖等。
抗原的选择应基于其与研究对象或疾病的相关性。
3.免疫动物选择：选择适合的免疫动物进行免疫。
一般常见的选择包括小鼠、大鼠、兔子等。
选择免疫动物的主要考虑因素是抗原的大小、复杂性和保守性。
4.免疫程序：将免疫原与免疫佐剂混合，并注射到免疫动物体内。
免疫的数量和时间应根据具体情况进行优化，以产生充分的免疫应答。
5.细胞融合：在免疫过程完成后，从免疫动物中收集免疫细胞，如脾细胞或骨髓细胞。
然后与髓样细胞瘤（如骨髓瘤细胞线（SP2/0）或骨髓瘤细胞线（NS0）等）融合。
这些瘤细胞是与免疫细胞无限增殖的细胞系。
6.细胞选择：将融合细胞分装到多孔板上，并添加抗生素来抑制非融合细胞的生长。
通常使用杂交瘤选择培养基来选择单个细胞。
7.筛选抗体：通过酶联免疫吸附试验（ELISA）或流式细胞术等方法，筛选和鉴定产生的杂交瘤细胞，以确定其分泌的单克隆抗体。
8.单克隆抗体的扩增：分离和扩增产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。
这可以通过种植细胞到体外培养中进行，或者通过移植至小鼠腹腔来提高抗体产量。
9.抗体纯化：从培养上清液或小鼠腹水中纯化单克隆抗体。
纯化方法可以包括蛋白质A/G亲和层析或亲和层析柱。
10.抗体验证：进行抗体验证以确认其特异性和亲和力。
常用方法包括免疫印迹分析、免疫组织化学分析、免疫荧光染色等。
11.抗体保存：最后，将抗体储存于适当的条件下，以确保其长期保存和稳定性。
总结：单克隆抗体制备涉及到抗原选择、免疫原制备、免疫程序、细胞融合、细胞选择、筛选抗体、单克隆抗体的扩增、抗体纯化、抗体验证和抗体保存等步骤。
这些步骤通常需要耗费时间和精力，但通过精心设计和优化，可以获得高质量和高特异性的单克隆抗体，从而在研究和临床应用中发挥重要作用。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体得制备流程（一）动物得选择与免疫1。
动物得选择纯种ＢALB ／C 小鼠，较温顺，离窝得活动范围小,体弱，食量及排污较小,一般环境洁净得实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术得实验室多选用纯种ＢALA/Ｃ小鼠。
2．免疫方案选择合适得免疫方案对于细胞融合杂交得成功,获得高质量得Mc Ａb 至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原得特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂:福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原１~５0μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0、8~1ml,0 、２mｌ／点）↓３周后第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ip （腹腔内注射）（ip 剂量不宜超过0、5ml）↓３周后第三次免疫剂量同一,不加佐剂,iｐ（5～7 天后采血测其效价）↓2～3 周加强免疫,剂量50～５00μg为宜,ip 或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原（特别就是一些弱抗原）得免疫方案也不断有所更新，如:①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原得免疫原性，另一方面可降低抗原得使用量。
②改变抗原注入得途径,基础免疫可直接采用脾内注射。
③使用细胞因子作为佐剂,提高机体得免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原得反应性。
（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好得免疫效果。
以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1~2×107个细胞。
初次免疫１ ×107/０、5ml ip↓2～３周后第二次免疫1×1０７/0、5ｍl ｉｐ↓3周后加强免疫（融合前三天）１ ×1０7/0、5ｍl ip 或iv↓取脾融合（二）细胞融合1.细胞融合前准备（1）骨髓瘤细胞系得选择: 骨髓瘤细胞应与免疫动物属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量M ｃAb.（2 ）饲养细胞:在组织培养中,单个或少数分散得细胞不易生长繁殖,若加入其它活细胞,则可促进这些细胞生长繁殖，所加入得这种细胞数被称为饲养细胞.在制备ＭcＡb得过程中,许多环节需要加饲养细胞,如在杂交瘤细胞筛选、克隆化与扩大培养过程中，加入饲养细胞就是十分必要得。
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单克隆抗体研制最详细步骤作者：时间：2008-05-15 15:54:24 来源: 生物谷浏览评论1、单抗的标记目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断（盒）的形式提供，其中核心为标记的单抗。
下面将介绍最常用的几种标记技术。
（1）酶标记A、辣根过氧化物酶（HRP）标记辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：a. 将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
b. 加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
c. 加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。
d. 称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4℃过夜。
e. 用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时（或4℃过夜）。
f. 将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）层析纯化，分管收集第一峰。
g. 酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量（mg/ml）=OD403×0.4IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量×体积/，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。
标记率=OD403/OD280酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。
h. HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。
必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。
程序二：1. 将5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的α和ε氨基。
2. 再加1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30分钟，溶液呈黄绿色；随后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，轻搅1小时，中止氧化反应。
3. 移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。
4. 吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅2-3小时，避光；加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小时或过夜，或换用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用7小时。
5. 再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小时，更换三次缓冲液。
6. 用3000r/min离心30分钟，除去沉淀物。
上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。
7.8. 步骤同程序一。
B、碱性磷酸酶（AP）标记碱性磷酸酶（AP）用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合，制备成结合物。
该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。
其程序如下：1. 将5mg AP加入1ml抗体溶液（2mg/ml）中溶解，装入透析袋，于4℃对0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小时，换液三次。
2. 加入2.5%戊二醛20ul，室温作用1-2小时，4℃对PBS透析过夜，其间换液三次。
3. 换用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。
4. 取出标记抗体，用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AP标记物原液。
5. 每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。
C、 PAP、APAAP的制备PAP（过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术）、APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术）的制备对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。
现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔PAP、APAAP供应，只要配以相应的桥抗体，即可非常便利地应用单抗。
因为PAP法和APAAP法不用任何化学交联剂处理酶和抗体，它们的活性均不受化学因素的影响，提高了敏感性和特异性。
PAP和APAAP的制备方法常采用先将HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水，过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应，调PH至2.3，随后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯化PAP或APAAP。
根据需要还可将PAP和APAAP先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断，这样，单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。
（2）荧光素标记A、异硫氰酸荧光素（FITC）标记FITC标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC 的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合，形成IgG与荧光素的结合物。
FITC是最常用的荧光素，其次选用TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）。
FITC和TRITC是常用的双标记组合。
其标记步骤如下：a. 以碳酸盐缓冲液（PH9.3，Na2CO3 8.6g，NaHCO3 17.3g，蒸馏水1000ml）调整抗体浓度至10mg/ml。
b. 取5ml抗体溶液置于10ml小烧杯中。
c. 称取1mg FITC溶于0.2ml DMSO中，待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内，边加边轻搅；其后室温避光作用2小时。
d. 将交联物经Sephadex G25或G50柱层析除去游离的荧光素；分管收集第一峰为标记的抗体。
e. FITC的结合物质量鉴定IgG量（mg/ml）=（OD280-OD495×0.35）/1.4F/P=2.87×OD495/（OD280-OD495×0.35），一般说，FITC对抗体的摩尔比为3：1时适合于组织切片染色，为5-6：1时适合于细胞悬液染色。
以标记抗体染色各种抗原，测定其特异性染色滴度和非特异染色的程度。
f. 标记抗体的保存：宜保存于4℃，加NaN3防腐。
B、异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记: 基本与FITC标记相同。
（3）同位素标记必须强调的是在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前，应掌握同位素操作和防护知识。
正常情况下应包括避免物理的接触和对γ-射线照射的有效保护，操作和使用同位素标记抗体时，应利用防护装置，并合理处置含放射性的废料。
A、碘标记用碘标记抗体是一种有效的标记方法。
125I衰变产生低能的γ和Χ射线，很容易被检测出来，而其60天的半衰期保证足够的有效使用期，且能很方便地处理放射废料。
最常用的碘标记方法是氯胺T法，即将氧化剂氯胺T加入到抗体和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I转化成I2，游离I2可与抗体分子中酪氨酸和一些组氨酸发生卤化反应，用还原剂和游离酪氨酸终止反应，经凝胶过滤将标记的抗体与碘化酪氨酸及还原剂分离开。
其主要操作步骤如下：a. 在进行标记之前，先选用截流分子量为20000-50000的凝胶，制备1ml凝胶柱，然后分别用10倍体积的1%BSA/PBS/0.02%叠氮钠和PBS洗涤柱体，封住柱下口，备用。
b. 加入10ug纯化单抗至含有25ul 2.5mol/L磷酸钠（PH7.5）的1.5ml指形管内。
随后，加入500uCi Na125I 混匀。
c. 加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。
室温放置60秒。
再加入50ul氯胺T终止液（含2.4mg/ml偏重亚硫酸钠，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%环乙烷酰二甲苯的PBS）。
d. 将上述碘标记物上样在凝胶柱表面，小心放开柱体下口，用1.5ml指形管收集。
当碘标记物全部进入柱体，加入0.3ml含0.03%叠氮钠的PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml 0.03% NaN3 PBS，下口收集0.3ml，重复进行，同时用同位素检测仪测定标记与未标记的单抗。
标记抗体大约在第二至第四管出现。
无害化处理柱子和非单抗标记部分。
e. 将标记单抗保存于4℃可使用6周时间。
B、生物合成法标记将杂交瘤在含有放射性前体的培养基中，随着抗体分子的合成、组装，同位素会标记在抗体分子的初级氨基酸链上，本方法不会导致抗体活性的丧失。
其主要步骤是：a. 离心收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，约需2×106个细胞。
以预热37℃不含甲硫氨酸的培养基洗涤上述细胞。
b. 用含2% PBS不含甲硫氨酸的培养基悬浮杂交瘤细胞至106个/ml，加入35S甲硫氨酸（每次加入100uCi可产生105-106cpm的抗体）。
c. 经C02培养箱中培养过夜，离心后，吸出培养上清，分别加入1/20体积的1mol/L Tris（PH8.0）及叠氮钠至浓度0.02%。
该标记抗体可按纯化单抗方法进行。
（4）生物素标记生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。
生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。
其主要步骤是：a. 用二甲基亚砜配制10mg/ml的N-羟琥珀酰亚胺生物素（应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯）。
b. 用硼酸钠缓冲液（0.1mol/L，PH8.0）稀释单抗溶液至1-3mg/ml。
c. 每毫克抗体加入25-250ug的生物素酯，混匀后，室温作用4小时。
e. 按每250ug生物素酯加入20ul 1mol/L NH4Cl终止反应，室温放置10分钟。
f. 以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。
（5）他标记技术适用于蛋白质的其他标记方法也可用于单抗，如金标记、化学发光标记、SPA标记、铁蛋白标记等。
单克隆抗体的标记发布时间： 2009-02-02 新闻来源：目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断试剂（盒）的形式提供，其中核心试剂为标记的单抗。