单克隆抗体研制最详细步骤

单克隆抗体研制最详细步骤

作者：时间：2008-05-15 15:54:24 来源: 生物谷浏览评论

1、单抗的标记

目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断（盒）的形式提供，其中核心为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。

（1）酶标记

A、辣根过氧化物酶（HRP）标记

辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。

程序一：

a. 将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。

b. 加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。

c. 加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。

d. 称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4℃过夜。

e. 用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时（或4℃过夜）。

f. 将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）层析纯化，分管收集第一峰。

g. 酶结合物质量鉴定：

克分子比值测定

酶量（mg/ml）=OD403×0.4

IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62

克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。标记率=OD403/OD280

酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。

h. HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。

程序二：

1. 将5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的α和ε氨基。

2. 再加1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30分钟，溶液呈黄绿色；随后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，轻搅1小时，中止氧化反应。

3. 移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。

4. 吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅2-3小时，避光；加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小时或过夜，或换用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用7小时。

5. 再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小时，更换三次缓冲液。

6. 用3000r/min离心30分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。

7.8. 步骤同程序一。

B、碱性磷酸酶（AP）标记

碱性磷酸酶（AP）用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合，制备成结合物。该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。其程序如下：

1. 将5mg AP加入1ml抗体溶液（2mg/ml）中溶解，装入透析袋，于4℃对0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小时，换液三次。

2. 加入2.5%戊二醛20ul，室温作用1-2小时，4℃对PBS透析过夜，其间换液三次。

3. 换用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。

4. 取出标记抗体，用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AP标记物原液。

5. 每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。

C、 PAP、APAAP的制备

PAP（过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术）、APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术）的制备对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔PAP、APAAP供应，只要配以相应的桥抗体，即可非常便利地应用单抗。因为PAP法和APAAP法不用任何化学交联剂处理酶和抗体，它们的活性均不受化学因素的影响，提高了敏感性和特异性。PAP和APAAP的制备方法常采用先将HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水，过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应，调PH至2.3，随后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯化PAP或APAAP。

根据需要还可将PAP和APAAP先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断，这样，单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。

（2）荧光素标记

A、异硫氰酸荧光素（FITC）标记

FITC标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC 的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合，形成IgG与荧光素的结合物。FITC是最常用的荧光素，其次选用TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）。FITC和TRITC是常用的双标记组合。其标记步骤如下：

a. 以碳酸盐缓冲液（PH9.3，Na2CO3 8.6g，NaHCO3 17.3g，蒸馏水1000ml）调整抗体浓度至10mg/ml。

b. 取5ml抗体溶液置于10ml小烧杯中。

c. 称取1mg FITC溶于0.2ml DMSO中，待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内，边加边轻搅；其后室温避光作用2小时。

d. 将交联物经Sephadex G25或G50柱层析除去游离的荧光素；分管收集第一峰为标记的抗体。

e. FITC的结合物质量鉴定

IgG量（mg/ml）=（OD280-OD495×0.35）/1.4

F/P=2.87×OD495/（OD280-OD495×0.35），一般说，FITC对抗体的摩尔比为3：1时适合于组织切片染色，为5-6：1时适合于细胞悬液染色。以标记抗体染色各种抗原，测定其特异性染色滴度和非特异染色的程度。

f. 标记抗体的保存：宜保存于4℃，加NaN3防腐。

B、异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记: 基本与FITC标记相同。

（3）同位素标记

必须强调的是在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前，应掌握同位素操作和防护知识。正常情况下应包括避免物理的接触和对γ-射线照射的有效保护，操作和使用同位素标记抗体时，应利用防护装置，并合理处置含放射性的废料。

A、碘标记

用碘标记抗体是一种有效的标记方法。125I衰变产生低能的γ和Χ射线，很容易被检测出来，而其60天的半衰期保证足够的有效使用期，且能很方便地处理放射废料。最常用的碘标记方法是氯胺T法，即将氧化剂