实验七和实验八 重组片段亚克隆

实验七和实验八重组片段的亚克隆

【实验目的】

学习基因克隆技术。

【实验原理】

目的片段经限制性内切酶双酶切形成两个粘性末端。再用相同的限制性内切酶切割表达载体，也形成两个粘性末端。由于所用内切酶相同，载体的粘性末端与目的片段的粘性末端互补配对。之后再在DNA连接酶的作用下，目的片段与载体发生连接反应，形成重组载体。本实验在连接前使用碱性磷酸酶对载体进行处理。碱性磷酸酶的作用是除去DNA5'端的磷酸基，防止载体发生自连环化。

图1pQE80L载体示意图

【实验步骤】

一、原核表达载体双酶切

1）BamH I酶切：在1.5ml微量离心管中配制下列体系（40μl体系），

Component Volume(μl)

质粒DNA34μl

10×QuickCut Green Buffer4μl

QuickCut BamH I2μl

2）轻轻混匀后瞬时离心。

3）30℃保温5min。

4）Hind III酶切：再在上述反应液中加入QuickCut Hind III酶2μl。

5）轻轻混匀后瞬时离心。

6）37℃保温5min。

二、载体脱磷酸

1）在上述离心管中配制下列体系（100μl）

Component Volume(μl)

载体pQE80L42

Alkaline Phosphatase3

10×SAP Buffer10

ddH2O45

2）轻轻混匀后瞬时离心。

3）37℃反应15～30min。

4）使用OMEGA胶回收试剂盒对载体进行回收（参考胶回收实验步骤，具体如下）。

1在上述反应液中加入100μl Binding buffer（若颜色变红则加0.5-1μl3M NaAc），混合液转移至HiBind DNA柱子中，12,000rpm离心1min，弃废液；

2在离心柱中加入700μl SPW wash buffer，12,000rpm离心1min，弃废液；

3重复步骤②；

4空甩，12,500rpm离心1min；

5将离心柱转移至新的1.5ml EP管中，每管加入40μl预热至65℃的ddH2O，室温放置2min；

613,000rpm离心2min

7将DNA从每个管底吸出，重新加入到相应的离心柱里，重复⑦和⑧步骤；

8所得DNA-20℃保存备用

三、目的片段与载体连接

1）在0.2ml微量离心管中配制下列连接体系（30μl）

Component Volume(μl)

目的DNA片段14

载体pQE80L2

10×buffer2

T4DNA连接酶2

2）冰上混匀后瞬时离心，于16℃连接至少4h（过夜）。

3）取2μl连接反应液加入至20μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30min。

4）42℃热激45s后，再在冰中放置1min。

5）加入500μl LB液体培养基，37℃振荡培养45-60min。

6）12000rpm离心1min，弃上清400μl，留100μl。吹打均匀后，吸取50μl用涂布器在含有Amp的LB平板培养基上涂板。

7）37°C温箱倒置培养约24h，形成单菌落。计数单菌落。

【注意事项】

1）碱性磷酸酶和T4DNA连接酶都要在冰上操作，以防高温酶失活。

2）感受态细胞要放在冰上操作，以免影响转化。

3）涂布器使用前一定要先火焰灭菌，之后晾凉了再使用。

【实验报告】

1）实验目的

2）实验原理（简述）

3）实验步骤（交代清楚）

4）实验结果：