实验七和实验八 重组片段亚克隆
DNA的亚克隆综合实验方案
DNA的亚克隆综合实验方案班级：生物科学1班姓名：魏小笛学号：108012011087一、实验学时：3二、实验类型：综合性实验三、实验要求：必修四、实验目的对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等五、实验内容(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。
六、实验过程一、目的DNA片段和载体的制备选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。
根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端、不对称粘性末端、平端。
具体步骤:１．按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。
•DNA 5μl•10×buffer 1μl•无菌水 3.5μl•内切酶0.5μl•总体积：10μl２．将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。
３．Eppendorf管于３７℃水管中反应1小时。
４．反应结束后加入2μl的6XLoading buffer以终止反应。
５．混匀后0.8％琼脂糖凝胶上60伏电泳２小时。
载体的制备：用碱裂解法制备质粒。
（PUC18质粒载体DNA）具体步骤：1挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，于37℃振荡培养14～18 h。
-培养时间不能太长，否则细菌老化，代谢产物太多。
影响质粒质量。
2取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心12000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。
4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解,DNA变性。
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置3-5min。
基因工程习题+答案
第一章绪论名词解释：1.基因操作：将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。
2.间断基因：序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。
我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。
3.启动子：DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。
4.亚克隆：当初始克隆中的外源DNA片段较长，含有许多目的基因以外的DNA片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA找出来，这个过程叫“亚克隆”。
填空题：1.基因操作的核心部分是基因克隆，基因克隆的基本要点有（克隆基因的类型），（受体的选择）和（载体的选择）。
2.（基因）是遗传物质的基本单位,也是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段。
它可以是连续的，也可以是（不连续的）；可以是（DNA），也可以是RNA；可以存在于染色体上，也可以（存在于染色体之外如质粒、噬菌体）。
3.基因操作并不是一个法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的（表达）、（调控）、（检测）和（改造）等与基因研究相关的内容。
4.启动子是指（基因转录过程中控制起始的部位）。
通常一个基因是否表达，（转录起始）是关键的一步，是起决定作用的。
在转录过程中，启动子还是（RNA聚合酶）的结合位点。
5.原核生物的RNA聚合酶主要由两部分组成：（核心酶）和（σ因子），其中σ-因子并不参与RNA的合成，它的作用主要是（识别要转录的起始位点）。
6.从（启动区）到（终止区）的这一段距离称为一个转录单位，或者一个转录产物，其中可包括一个或者多个基因。
7.转录终止子主要有两种，一种是（依赖ρ因子），另一种是（不依赖ρ因子）。
8.基因的书写方式，通常是写出的DNA序列总是与（mRNA）相同的那条链，方向是从（5'）到（3'）。
对于碱基的位置，一般自转录起始点向两个方向编号，其中转录起始点定为（+1），（在起始点上游第一个碱基）定为-1。
高中生物重组技术实验教案
高中生物重组技术实验教案
实验名称：重组技术实验
实验目的：通过实验，让学生了解重组技术的基本原理和应用，培养学生的实验操作能力和科学思维能力。
实验材料：DNA分子模型、重组酶、DNA片段、载体DNA、PCR仪器、琼脂糖凝胶等。
实验步骤：
1. 首先，讲解重组技术的基本原理和应用，并展示实验所需材料。
2. 学生分组进行实验，每组配备一个老师指导。
3. 将载体DNA和DNA片段分别用重组酶切割成合适的长度，然后将它们混合并利用PCR 技术将其连接起来。
4. 将连接好的DNA转化至细菌宿主中，培养并筛选出带有目标基因的细菌。
5. 最后，将细菌中的目标基因进行提取并通过琼脂糖凝胶电泳进行验证。
实验评估：学生根据实验结果进行分析和讨论，并撰写实验报告，总结实验过程中的操作技能和体会。
拓展延伸：可以邀请专业人士来讲解重组技术在医学、农业等领域的应用，并参观相关实验室，进一步拓展学生的实验技能和知识面。
注意事项：1. 实验中需要小心操作化学药品和实验器材，注意安全防护措施。
2. 实验结束后要及时清理实验台和器材，保持实验现场的整洁。
3. 学生要尊重实验材料和动植物，严禁损坏或滥用。
分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解
一、扩增1、LB培养基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。
种类根据细菌抗性决定；3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。
二、纯化质粒DNA1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。
取三次；3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。
目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；*备注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。
重复一遍；9、空管离心12000xg，1min；10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。
（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）四、跑胶回收：sost回收失败1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。
插入：配胶方法大块胶60ml；小块胶25ml；需要配置大块胶、大孔胶；Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；倒入槽里。
2、跑胶：单位厘米/5-10v。
所以大槽25cm，150v即可。
小槽100v即可。
3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；10、空离心2min，弃废液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；五、连接体系：六、转化1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震动；3、加500ul LB培养基；4、37℃，150转摇床，45min；5、铺板子七、检测1、细菌长势良好，对照组不长；2、酶切检测：（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）5.5ul water1ul上游引物1ul下游引物（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；显示4°/4°时，结束。
克隆和亚克隆-唐靖
242 g Tris, 57.1 ml 冰乙酸, 100 ml 0.5mol/L EDTA(PH 8.0)
Tis-磷酸盐和EDTA缓冲液（TPE）： 10×
108 g Tris, 15.5 ml 磷酸(85%, 1.67 g/ml), 40 ml 0.5mol/L EDTA(PH 8.0)
Tis-硼酸盐和EDTA缓冲液（TBE）： 5× 54 g Tris, 27.5 g 硼酸, 20 ml 0.5mol/L EDTA(PH 8.0)
DNA的构象
凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 所用的电压 琼脂糖种类 电泳缓冲液
DNA在琼脂糖凝胶中迁移率的影响因素
DNA分子的大小：
双链DNA分子在凝胶基质迁移的速率与其碱基对数的 常用对数成反比
琼脂糖浓度：
lg = lg’ Kr
：DNA电泳迁移率；：凝胶浓度； Kr：阻滞系数
DNA在琼脂糖凝胶中迁移率的影响因素
基因克隆与亚克隆
目的基因与载体的连接及后 续的转化过程习惯上称之为 克隆
基因的克隆与亚克隆技术基因克隆基因组cDNA人工合成
基因亚克隆
带有目的基因的载体
亚克隆技术步骤
获取目的片断
双酶切载体和目的片断
纯化回收载体和目的片断 连接载体和目的片断 转化E.Coli 鉴切
双酶切载体和目的片断
• 酶的总量不能超过反应体系的1/10体积 • 酶切buffer的选择
• 酶切PCR产物需要保护碱基，在设计引物时需要注意
• 酶切时间要适中，防止新活性产生 • 在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注 意酶切顺序
切胶回收和连接
琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过(1-3)和(1-4)糖苷 键交替构成的线装聚合物。通常情况下琼脂糖链形成螺 旋纤维，进而再聚合成半径20~30nm的超螺旋结构。 琼脂糖凝胶可以构成一个直径从50nm到略大于200nm 的三维筛孔的通道
实验八 重组克隆筛选(酶切鉴定)
实验八重组克隆筛选（酶切鉴定）【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理；2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。
【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。
不同的克隆载体和相应的宿主系统，其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。
从理论上说，重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。
常用的筛选方法有两类。
一类是针对遗传表型改变筛选法，以－半乳糖苷酶系统筛选法为代表。
另一类是分析重组子结构特征的筛选法，包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落（或噬菌斑）原位杂交等方法。
1．－半乳糖苷酶系统筛选法（蓝白斑筛选法）使用本方法的载体包括M13噬菌体、pUC质粒系列、pGEM质粒系列等。
这些载体的共同特征是载体上携带一段细菌的基因lacZ。
lacZ编码－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的肽，载体转化的宿主细胞为lacZ△M15基因型。
重组子由于外源片断的插入使肽基因失活不能形成互补作用，也就是说，宿主细胞表现为－半乳糖苷酶失活。
因此，在X-gal平板上，重组克隆为无色噬菌斑或菌落，非重组克隆为蓝色噬菌斑或菌落。
这种筛选方法操作简单，但当插入片断较短（小于500bp），且插入片断没有影响lacZ基因的读框时，有假阴性结果的出现。
2．快速裂解菌落鉴定质粒大小从平板中挑取菌落，过夜培养后裂解，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较，根据迁移率的减小初步判断是否有插入片断存在。
本方法适用于插入片断较大的重组子的初步筛选。
3．限制酶图谱鉴定对于初步筛选具有重组子的菌落，提纯重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割重组子释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。
4．Southern 印迹杂交为确定DNA插入片断的正确性，在限制性内切酶消化重组子、凝胶电泳分离后，通过Southern 印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性同位素或非放射性标记的相应外源DNA片断作为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片断是否是所需的靶基因片断。
分子生物学实验思考题答案
分子生物学实验思考题答案分子生物学实验思考题答案实验一、基因组dna的提取1.构建DNA文库时为什么要使用大分子DNA？答、文库的大小(即数目)取决于基因组的大小和片段的大小，片段大则文库数目小一些也可以包含99%甚至以上的基因组。
而文库数目小则方便研究人员操作和文库的保存。
所以构建文库要用携带能力大的载体克隆尽量大的dna片段.2、如何检测和保证dna的质量？答：凝胶电泳看是否有白质和RNA污染等物质，也可以测量OD，用od260/280确定od260/od280<1.8时，说明od260/od280>2.0时蛋白质含量较高，说明od260/od280=1.8~2时RNA含量较高，说明DNA更纯净。
实验二、植物总rna的提取1.核糖核酸酶的变性剂和灭活剂是什么？哪些种类可以用于总RNA的提取？答、有depc,trizol，氧钒核糖核苷复合物，rna酶的蛋白抑制剂以及sds，尿素，硅藻土等；在总rna提取中用pepc,trizol2.如何从总RNA中分离纯化mRNA。
A.利用成熟mRNA末端Polya尾的特性，合成了一个寡核苷酸（DT）引物。
根据碱基互补配对原理，mRNA可以从总RNA中分离出来实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备1.在活性细胞的制备过程中，我们应该注意什么？答、a）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保储存的细菌被直接转移到用于制备感觉细胞的细菌溶液中。
细胞生长密度应刚好进入对数生长期，这可以通过监测培养基的OD600来控制。
dh5α当菌株的OD600为0.5时，细胞密度为5×约107/ml，此时更合适。
密度过高或不足会影响转换效率。
b）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。
c）在低温条件下，CaCl2处理细胞的转化率随着时间的推移而增加。
D）化合物和无机离子的作用：在Ca2+的基础上，用其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+、DMSO或还原剂）处理细菌，可大大提高转化效率（100-1000倍）；e）使用的器具必须干净。
分子亚克隆实验报告
一、实验目的1. 掌握分子亚克隆的基本原理和方法；2. 学会利用PCR技术扩增目的基因片段；3. 熟悉DNA凝胶电泳、DNA连接、转化等分子克隆技术；4. 提高实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理分子亚克隆是指将目的基因片段插入到载体中，从而构建基因表达载体。
实验原理主要包括以下步骤：1. PCR扩增：利用PCR技术扩增目的基因片段；2. 凝胶电泳：分离PCR产物，确定目的基因片段大小；3. DNA连接：将目的基因片段与载体连接；4. 转化：将连接产物转化到宿主细胞中；5. 阳性克隆筛选：通过PCR、测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
三、实验材料1. 试剂：PCR试剂盒、DNA连接酶、限制性内切酶、DNA标记物、质粒等；2. 仪器：PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、离心机、移液器等；3. 细胞：大肠杆菌DH5α等。
四、实验步骤1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计引物，确保引物长度在18-25bp之间，G+C 含量在40-60%之间。
（2）PCR反应：按照PCR试剂盒说明书进行PCR反应，包括变性、退火、延伸等步骤。
2. 凝胶电泳（1）配制琼脂糖凝胶：按照实验要求配制琼脂糖凝胶。
（2）加样：将PCR产物加入琼脂糖凝胶孔中。
（3）电泳：设置合适的电压和时间进行电泳。
（4）观察结果：通过凝胶成像系统观察电泳结果，确定目的基因片段大小。
3. DNA连接（1）酶切：将载体和PCR产物分别进行限制性内切酶酶切。
（2）连接：按照DNA连接酶说明书进行DNA连接反应。
4. 转化（1）制备感受态细胞：按照大肠杆菌DH5α感受态细胞制备方法进行。
（2）转化：将连接产物与感受态细胞混合，进行热冲击转化。
（3）涂布：将转化后的细胞涂布在含有抗生素的琼脂糖平板上。
5. 阳性克隆筛选（1）PCR检测：对涂布后的平板进行PCR检测，筛选出含有目的基因的克隆。
（2）测序：对阳性克隆进行测序，验证目的基因序列的正确性。
RedET同源重组技术概述
亚克隆 pGB-15A载体抗性基因簇
Red/ET subcloning
直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇
3 mg基因组DNA用EcoR V消化
EcoRV (36739)
EcoRV (664)
p15A ori
Cm
Mx unknown PKS gene cluster (~36kb)
2. 不受靶标DNA分子大小的限制；
3. 不受内切酶切位点的限制；
4. 精确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、
缺失、替换等的几率；
5. 简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩
短实验周期。
三、 Red/ET重组的作用机制
1.链入侵模式
Red/ET重组链入侵模型
2.链退火模型
插入选择标记
插入无选择标记的DNA片段
E. coli染色体上插入抗性基因
传统基因工程技术（A）和Red/ET重组技术（B）修饰E.coli染色体实验步骤比较
3. 亚克隆 （Subcloning）
4. 直接克隆 （Direct cloning）
（A）亚克隆和直接克隆示意图
（B） 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟 基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
6. 重组子筛选
基因克隆原理及实验介绍
基因克隆原理及实验介绍基因克隆是一种将一段特定的DNA序列从一个生物体复制到另一个生物体中的实验技术。
通过基因克隆，科学家们可以研究和分析特定基因的功能以及其在生物体中的作用。
基因克隆的原理主要包括DNA片段的选择、DNA片段扩增、构建载体、插入DNA片段到载体中、转化宿主细胞、筛选并鉴定重组表达体等步骤。
首先，基因克隆的第一步是选择目标DNA片段。
目标DNA片段可以是一个完整的基因、一个局部的基因片段，或者是其他DNA序列。
选择DNA片段通常基于对目标基因的兴趣或研究目的。
接下来，将目标DNA片段通过PCR扩增技术获取足够数量的DNA。
PCR是一种可以在体外扩增特定DNA片段的方法，它使用DNA聚合酶酶和合成的两个引物来扩增特定的DNA序列。
PCR的结果是通过DNA的指数增长，可以获得足够数量的DNA用于后续的实验。
在获得足够的DNA片段之后，下一步是构建载体。
载体是一个DNA分子，可以用来携带和复制目标DNA片段。
最常用的载体是质粒，质粒是一种环状的DNA分子。
构建载体的过程包括选择合适的质粒，将质粒进行消化（通过限制酶切），然后使用DNA连接酶将目标DNA片段连接到质粒上。
之后，构建好的载体需要插入到宿主细胞中。
细菌通常是最常用的宿主细胞，因为它们可以快速增殖并很容易被转化。
一种常用的转化方法是热激转化法，即将含有质粒的细胞和热激转化液一同加热，使得质粒能够进入细菌细胞内。
转化成功后，需要对宿主细胞进行筛选并鉴定是否有重组表达体。
最常用的筛选方法是利用抗生素抗性基因。
在构建载体的过程中，通常会将抗生素抗性基因插入到质粒中，使得只有带有重组表达体的细菌能够在含有抗生素的培养基上存活和生长。
最后，使用一系列的分子生物学方法，如限制酶切、PCR、DNA测序等，对得到的重组表达体进行鉴定和验证。
这些方法可以确定插入的DNA 片段是否正确，并且确认重组表达体是否具有所需的功能。
总之，基因克隆是一种强大的实验技术，可以用于研究和分析特定基因的功能和作用。
107473-分子生物学实验-8DNA重组与转化
9
• 重组质粒转化宿主细胞后，还 需对转化菌落进行筛选鉴定。 利用α互补现象进行筛选是最 常用的一种鉴定方法
• α互补：质粒载体上lacZ’基因 编码的α肽段与失去了正常氨 基端的β-半乳糖苷酶突变受体 菌之间实现互补的现象
• 由α互补而形成的有功能活性 的β半乳糖苷酶，可以用Xgal 显色测定出来
0.5μL 3μL
Ligation Mix* 总体积
ddH2O up to 5μL 5μL 10μL
• 16℃连接反应30min
• 含有X-gal、IPTG、的LB琼脂平板培养基的制备：200mL固体培养基（融 化状态下60度），加入200μL100mg/mL Amp，加400μL X-gal （20mg/mL） 和24μL IPTG（ 200mg/mL）溶液，摇匀，倒制平板。待凝固后避光保存实验分组
• DNA重组连接反应：每组4人，10μL连接产物。全班6组。 • 转化实验：每组2人，全班12组。
– 5μL连接产物加入至200μLDH5α感受态细胞中（实验 组）
– 2μL质粒加入至200μLDH5α感受态细胞中（阳性对照） – 需要2块LB琼脂平板（实验组和阳性对照） • 2μL无菌水加入至200μLDH5α感受态细胞中（阴性对照） （全班一块平板）
4
pMD 18-T (PCR产物克隆载体)
2015年5月
课件作者:蒋华云
5
连接
2015年5月
课件作者:蒋华云
6
• DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶
• DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本 身的自连，可以通过（牛小肠碱性磷酸酶）CIP处理克服
2015年5月
分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解
一、扩增1、LB培养基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。
种类根据细菌抗性决定；3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。
二、纯化质粒DNA1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。
取三次；3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。
目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；*备注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。
重复一遍；9、空管离心12000xg，1min；10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。
（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）四、跑胶回收：sost回收失败1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。
插入：配胶方法大块胶60ml；小块胶25ml；需要配置大块胶、大孔胶；Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；倒入槽里。
2、跑胶：单位厘米/5-10v。
所以大槽25cm，150v即可。
小槽100v即可。
3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；10、空离心2min，弃废液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；五、连接体系：六、转化1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震动；3、加500ul LB培养基；4、37℃，150转摇床，45min；5、铺板子七、检测1、细菌长势良好，对照组不长；2、酶切检测：（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）5.5ul water1ul上游引物1ul下游引物（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；显示4°/4°时，结束。
王老师组《生物技术大实验》讲义
第一部分 Taq DNA 聚合酶基因的克隆、载体构建和大肠杆菌工程菌的制备【原理和技术路线概述】Taq 酶基因编码框（2500bp ）EcoRIBamHIpUC18Taq EcoRIBglIIEcoRI BglIIN C 端引物 PCR 扩增酶切（EcoRI+HindIII ）酶切（EcoRI+BamHI ）Taq图1 Taq 酶基因基因组序列、编码框（粉红）和扩增引物位置（下划线）(缺失N 端两个氨基酸Met-Arg-...，替换成LacZ前7个氨基酸Met-Asn-Ser-...) *注意Taq 酶基因没有移码实验二 Taq DNA 聚合酶基因的克隆【实验目的】1. 学习利用PCR 技术扩增目的基因编码框的方法2. 学习在PCR 扩增目的片段两端添加限制性内切酶识别位点的方法 【实验原理】 略【仪器与试剂】 1．实验器材PCR 自动扩增仪，离心机，微量移液器，制冰机 0.2ml 薄壁Eppendorf 管（消毒），200μl 枪头（消毒） 2. 试剂10×PCR 缓冲液dNTPs ： dATP ，dCTP ，dGTP ，dTTP 各2.5mmol/L Taq 酶：2.5U/μl 模板DNA ：0.1μg/μl25mmol/L MgCl 2去离子水(ddH 2O)（消毒） 石蜡油（消毒）1、 引物序列(浓度：10μmol/L)引物P1(氨基端引物Taq-T )： 5'-CACGAATTC/GGGGATGCTGCCCCTCTTTGAGCCCAAG引物P2(羧基端引物Taq-R)： 5'-GTGAGATCT/ATCACTCCTTGGCGGAGAGCCAGTC【实验步骤】（一） 准备PCR 反应溶液BamHIBglII1.取薄壁0.2ml Eppendorf管1只，用微量移液器按以下顺序分别加入各试剂:10×缓冲液 2.5μl10×dNTP 2μl引物P1 1μl引物P2 1μl模板DNA 1μlTaq酶0.5μlddH2O xμl总体积25μl2.用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。
目的基因的亚克隆
目的基因的亚克隆所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。
亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。
一、试剂准备1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。
2．1.5%琼脂LB固体培养基: 称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100ml LB，15 lbf/in2 高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。
3．IPTG、X-Gal4．0.1M MgCl2 ：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。
5．0.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。
6．限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶。
二、目的DNA片段和载体的制备选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。
根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。
在亚克隆时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。
但有时目的片段的末端与载体不匹配，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。
（实验操作同前述）三、利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接（一）连接要求和结果带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。
重组实验报告
一、实验名称DNA重组实验二、实验目的1. 理解DNA重组技术的原理和应用。
2. 掌握DNA重组实验的基本操作步骤。
3. 学习质粒载体、外源DNA的制备、酶切、连接、转化等操作技术。
4. 通过实验，了解重组DNA的筛选和鉴定方法。
三、实验原理DNA重组技术是指利用限制性核酸内切酶（限制酶）和DNA连接酶等工具，将不同来源的DNA片段按照一定方式连接起来，形成具有特定遗传信息的重组DNA分子。
这一技术是现代分子生物学研究的重要手段，广泛应用于基因工程、基因克隆、基因表达调控等领域。
四、实验材料1. 质粒载体：PUC192. 外源DNA：含有目的基因的DNA片段3. 限制性核酸内切酶：HindIII4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. 载体DNA：PUC196. 感受态细胞：大肠杆菌DH5α7. 实验试剂：DNA制备试剂盒、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA标记物等五、实验步骤1. DNA制备：分别提取质粒载体DNA和外源DNA。
2. 酶切：将质粒载体DNA和外源DNA分别用HindIII酶切，产生具有相同黏性末端的DNA片段。
3. 连接：将酶切后的质粒载体DNA和外源DNA在T4 DNA连接酶的作用下连接起来，形成重组DNA分子。
4. 转化：将重组DNA分子转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。
5. 筛选：通过蓝白斑筛选法，筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。
6. 鉴定：通过PCR或酶切分析等方法，鉴定重组质粒的大小和序列。
六、实验结果1. 通过琼脂糖凝胶电泳，观察到酶切后的质粒载体DNA和外源DNA均产生了预期的条带。
2. 通过连接反应，得到了与质粒载体DNA和外源DNA大小相近的重组DNA分子。
3. 通过蓝白斑筛选法，筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。
4. 通过PCR或酶切分析，鉴定了重组质粒的大小和序列。
七、实验讨论1. 实验过程中，酶切、连接、转化等操作步骤严格按照操作规程进行，确保了实验结果的准确性。
亚克隆ppt课件
3. 使用移液器吸取酶时，tip头只能刚刚插入液 面吸取
4. 如果有多个反应，酶、buffer、水等应配制
34
成mixture再分装
BamH I：
G▼GATT C C CTAA▲G
Kpn I:
G GTAC▼C C▲CATG G
35
含外源DNA片段的载体(M812) 的限制性内切酶消化 目的 载体（pUC19)
不同的酶对上述因素的敏感程度不同
32
典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括：
氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、 β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT） 牛血清白蛋白（BSA）
33
注意 1. 注意阅读商家提供的产品说明书，了解所使
用工具酶的浓度和最适作用条件，不要用错 了buffer和作用的温度等
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质粒电泳检测
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本科生试验图片
27
利用质粒克隆外源DNA片段的主要步骤
质粒载体的抽提，外源DNA的准备 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量 亚克隆载体与外源DNA的限制性内切酶消化 (目的片段的回收，亚克隆载体的去磷酸化) 载体与外源DNA的连接 感受态细胞的制备 连接子转化感受态细胞 重组子的转化及筛选、鉴定
20
质粒DNA质量检测
1. DNA纯度：吸光值检测：检测260nm、280nm吸光 值，紫外分光光度计A260/A280=1.8－1.9； 1.8 最佳，低于1.6说明有蛋白质，大于1.9说明有 RNA。
2. 质 量 检 测 ： 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ： 一 般 有 三 条 带 （超螺旋、开环、线型三种构型），点样孔附 近无DNA带（无染色体DNA污染）。
6
质粒DNA的提取
基因片段的亚克隆(DNA酶切、回收和连接)
三. 试剂与器材
〈一〉试剂
1. 限制性内切酶EcoRI, HindIII ；10×内切酶缓冲 液
2. T4DNA连接酶；10×连接酶缓冲液
3. 电泳缓冲液（0.5×TBE或1×TAE）
4. 琼脂糖；溴酚兰；溴化乙锭(工作浓度0.5µg/ml)
5. 酚；氯仿；无水乙醇；70%乙醇；灭菌双蒸水
• Note:
2.DNA的酶切反应
分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶。 它能识别双链 DNA 分子中特定的靶序列（ 4 ～ 8bp),并在该序列内切断DNA，形成特有的粘末 端或平端。
3. DNA的连接
在T4DNA 连接酶的作用下，平端或带有相同粘末 端的DNA分子可以连接上。DNA连接酶的作分三 步： ① T4DNA 连接酶与辅助因子 ATP 形成酶 -AMP 复合 物。 ② 酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’羟基切 口的DNA分子上，使DNA腺苷化。 ③ 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
七.胶回收注意事项
1. 将电泳槽用ddH2O反复清洗干净, 倒入新鲜
配制的灭菌电极缓冲液；
2. 根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板；
3. 切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶； 4. 要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减 少对DNA的损伤；
5. 熔胶要完全 。
Hale Waihona Puke 八．实验安排周四：
熟悉实验原理及步骤，清洗三角瓶、量筒等器皿，装枪头，1.5 / 0.5 ml离心管，装牙签及配溶液等 50×TAE :500 ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0): 500 ml 1mol/L Tris.Cl (pH8.0): 500 ml 0.1mol/L CaCl2: 500 ml ddH2O: 每组100 ml 5 mol/L NaOH: 100 ml 配LB培养基 液体：全班1000 ml
克隆基因制造实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握基因克隆的基本原理和方法。
2. 通过实验操作，克隆特定基因片段。
3. 掌握重组DNA技术的基本步骤，为后续的基因表达和功能研究奠定基础。
二、实验原理基因克隆是指将特定的DNA片段从生物体内提取出来，并将其插入到载体中，使之在宿主细胞中稳定存在和复制的过程。
基因克隆技术是分子生物学研究的重要手段，可用于基因表达、基因功能研究、基因治疗等领域。
三、实验材料1. 待克隆的DNA片段（基因）；2. 载体（如质粒、噬菌体等）；3. 限制性核酸内切酶（如EcoRI、BamHI等）；4. DNA连接酶；5. 宿主细胞（如大肠杆菌、酵母等）；6. PCR引物；7. 其他试剂（如DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等）。
四、实验步骤1. 提取待克隆的DNA片段采用酚-氯仿法提取待克隆的DNA片段，具体操作如下：（1）将待克隆的DNA样品加入等体积的酚-氯仿溶液，充分混匀；（2）12,000 r/min离心10分钟；（3）吸取上清液，加入等体积的氯仿，充分混匀；（4）12,000 r/min离心10分钟；（5）吸取上清液，加入等体积的75%乙醇，充分混匀；（6）12,000 r/min离心5分钟；（7）弃去乙醇，将DNA沉淀用无菌水溶解。
2. 构建重组DNA分子（1）选择合适的限制性核酸内切酶对载体和待克隆的DNA片段进行酶切，获得相同的粘性末端；（2）将酶切后的载体和待克隆的DNA片段进行连接，构建重组DNA分子；（3）将连接产物转化到宿主细胞中。
3. 筛选、鉴定阳性重组子（1）在含有抗生素的培养基中培养转化后的宿主细胞；（2）提取宿主细胞中的DNA，进行PCR扩增；（3）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果；（4）选取阳性重组子进行进一步的鉴定。
4. 重组子的扩增与表达（1）将阳性重组子转化到表达宿主细胞中；（2）诱导表达重组蛋白；（3）检测重组蛋白的表达水平。
五、实验结果1. 成功提取待克隆的DNA片段；2. 成功构建重组DNA分子；3. 成功筛选、鉴定到阳性重组子；4. 成功扩增并表达重组蛋白。
DNA重组生物实验报告
DNA重组生物实验报告课程名称：_生命科学导论实验课_ 指导老师：______成绩：__________________实验名称：__基因工程实验__ 实验类型：__生物实验_______同组学生姓名：__一、实验目的和要求基因工程实验是生物实验中极具代表性的一部分，在此次实验中有如下目的和要求：1、通过本实验了解和掌握含GFP基因质粒的提取和琼脂糖DNA电泳的等十个小实验组合而成的基因工程实验的原理和技术。
2、了解生物实验的完整流程，对实验室基本操作规范与仪器设备使用方法得到初步了解，从而建立系统、有条理的实验思路。
3、培养实验动手能力，在实践中加强对专业知识的认知与体会，融汇贯通，寓学于用，感受生物学科的魅力。
二、实验内容和原理基因工程又称DNA重组技术，是将不同来源的基因按照预先设计的蓝图，在体外构建成杂种DNA分子（又称重组DNA分子），然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种和生产新产品等。
基因工程技术为生命科学的研究提供了有力的手段，同时为以基因工程技术为核心的现代生物技术产业的建立奠定了扎实的基础。
基因工程技术建立的标志性实验是：①1972年，美国斯坦福大学的伯格(P.Berg)等人将猿猴病毒SV40的DNA和大肠杆菌λ噬菌体DNA分别进行EcoRI酶切，然后用T4DNA连接酶将两个酶切片段进行连接，率先完成了人类历史上第一个DNA分子的体外重组实验，因此荣获了1980年的诺贝尔化学奖。
②1973年，美国斯坦福大学的科恩（S.Cohen）等人在体外构建了含四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒，并将其导入大肠杆菌中，获得了双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。
上述两大科研成果标志着基因工程技术的诞生。
一个典型的基因工程技术包含以下几个步骤：1.目的基因和载体DNA的获取。
2.目的基因和载体DNA的限制性内切酶的酶切消化。
3.酶切后的目的基因和载体DNA的体外重组连接，以获得重组DNA分子。
亚克隆方法
一、试剂的配制和器皿的灭菌：亚克隆试剂储液配制一览表：1.培养基的配制和保存:1）LB液体培养基的配制和保存：用容积适当的三角锥瓶盛放LB液体培养基，用滤菌膜封住瓶口，高温高压灭菌，冷却后，放置于4℃保存，备用。
2）LB固体培养基的配制和保存：用容积适当的三角锥瓶盛放LB固体培养基，用滤菌膜封住瓶口，高温高压灭菌，冷却后，标记为Amp－，放置于4℃保存，备用。
亦可以稍冷却一段时间至60℃（微烫，尚可以忍受）时，立刻配制平板（培养皿已提前灭菌，烘干）。
在超净工作台中风吹4h，或者在烘箱中烘干。
平板制好后，用灭菌的塑料袋密封，标记为Amp－放置于4℃保存，备用。
3）LB液体培养基（Amp＋）的制备和保存：用预先离心的1.5ml离心管分装800ul－1.0ml左右灭菌的液体培养基，按照1ul Amp /1ml培养基的比例，加入Ampicillin，标记为Amp＋放置于4℃保存，备用。
4）LB固体培养基（Amp＋）的制备和保存：灭菌后的固体培养基，冷却至50℃左右时，分装一部分至另一灭菌备用的三角锥瓶中，按照75ul/100ml加入Ampicillin（100mg/ml），倒入培养皿，制备Amp＋平板，将培养皿盖子打开一点，以避免水珠凝结。
待Amp＋平板凝固，加入适当体积的X-gal和IPTG混合液（用时混合），用涂布棒涂布均匀，放置于超净工作台风吹4h，或者放置于烘箱中烘干。
用已经灭菌的大小合适的塑料袋把做好的平板密封，标记为Amp＋，放置于4℃保存，备用。
2.葡萄糖溶液的配制和保存：配制1mol/L的葡萄糖溶液，经过过滤除菌，分装为1ml，冻于-20℃，备用。
3.X-gal和IPTG溶液的配制和保存：1）X-gal溶液的配制和保存：X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。
用二甲基甲酰胺溶解X-gal，配置成20mg/ml的储存液。
使用玻璃或聚丙烯管保存储存液。
装有X-gal溶液的试管需用铝箔包裹，防止因光照而被破坏，并储存于-20℃。
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实验七和实验八重组片段的亚克隆
【实验目的】
学习基因克隆技术。
【实验原理】
目的片段经限制性内切酶双酶切形成两个粘性末端。
再用相同的限制性内切酶切割表达载体，也形成两个粘性末端。
由于所用内切酶相同，载体的粘性末端与目的片段的粘性末端互补配对。
之后再在DNA连接酶的作用下，目的片段与载体发生连接反应，形成重组载体。
本实验在连接前使用碱性磷酸酶对载体进行处理。
碱性磷酸酶的作用是除去DNA5'端的磷酸基，防止载体发生自连环化。
图1pQE80L载体示意图
【实验步骤】
一、原核表达载体双酶切
1）BamH I酶切：在1.5ml微量离心管中配制下列体系（40μl体系），
Component Volume(μl)
质粒DNA34μl
10×QuickCut Green Buffer4μl
QuickCut BamH I2μl
2）轻轻混匀后瞬时离心。
3）30℃保温5min。
4）Hind III酶切：再在上述反应液中加入QuickCut Hind III酶2μl。
5）轻轻混匀后瞬时离心。
6）37℃保温5min。
二、载体脱磷酸
1）在上述离心管中配制下列体系（100μl）
Component Volume(μl)
载体pQE80L42
Alkaline Phosphatase3
10×SAP Buffer10
ddH2O45
2）轻轻混匀后瞬时离心。
3）37℃反应15～30min。
4）使用OMEGA胶回收试剂盒对载体进行回收（参考胶回收实验步骤，具体如下）。
1在上述反应液中加入100μl Binding buffer（若颜色变红则加0.5-1μl3M NaAc），混合液转移至HiBind DNA柱子中，12,000rpm离心1min，弃废液；
2在离心柱中加入700μl SPW wash buffer，12,000rpm离心1min，弃废液；
3重复步骤②；
4空甩，12,500rpm离心1min；
5将离心柱转移至新的1.5ml EP管中，每管加入40μl预热至65℃的ddH2O，室温放置2min；
613,000rpm离心2min
7将DNA从每个管底吸出，重新加入到相应的离心柱里，重复⑦和⑧步骤；
8所得DNA-20℃保存备用
三、目的片段与载体连接
1）在0.2ml微量离心管中配制下列连接体系（30μl）
Component Volume(μl)
目的DNA片段14
载体pQE80L2
10×buffer2
T4DNA连接酶2
2）冰上混匀后瞬时离心，于16℃连接至少4h（过夜）。
3）取2μl连接反应液加入至20μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30min。
4）42℃热激45s后，再在冰中放置1min。
5）加入500μl LB液体培养基，37℃振荡培养45-60min。
6）12000rpm离心1min，弃上清400μl，留100μl。
吹打均匀后，吸取50μl用涂布器在含有Amp的LB平板培养基上涂板。
7）37°C温箱倒置培养约24h，形成单菌落。
计数单菌落。
【注意事项】
1）碱性磷酸酶和T4DNA连接酶都要在冰上操作，以防高温酶失活。
2）感受态细胞要放在冰上操作，以免影响转化。
3）涂布器使用前一定要先火焰灭菌，之后晾凉了再使用。
【实验报告】
1）实验目的
2）实验原理（简述）
3）实验步骤（交代清楚）
4）实验结果：。