第六章 核酸扩增 学习小结

第六章核酸扩增

一、学习目标

掌握 PCR的概念、原理、体系组成、反应程序和结果分析；PCR-FRLP和逆转录PCR、多重PCR、定量PCR等PCR衍生技术的概念原理；实时荧光定量PCR中引物和探针的设计以及结果的分析。

熟悉各类核酸扩增技术在临床分子生物学检验中的应用。

了解 PCR-ASO的概念原理。

二、重点和难点内容

（一）PCR

（1）基本原理和过程：与细胞内DNA的复制相似，由变性、退火和延伸构成PCR的一个循环，每一个循环完成后，一个分子的模板双链DNA被复制为两个分子。经过30次循环的扩增，理论上即可得230个拷贝产物。

（2）反应体系：主要包括模板、引物、dNTP、Taq DNA 聚合酶和缓冲液等成份。

模板为要复制的核酸片段（靶核酸），其来源可以是基因组DNA、RNA、质粒DNA或线粒体DNA等。如果模板是RNA，需要先逆转录成cDNA，然后以cDNA作为扩增的模板。模板DNA的纯度、结构和数量是影响PCR的重要因素。

引物为化学合成的两条寡核苷酸，决定PCR产物的特

异性。引物的设计是获得良好扩增反应的先决条件和重要步骤。设计引物时应遵循有关原则：引物的长度一般为20～30nt；二条引物自身或引物之间（尤其在3'-OH末端）一般不应存在互补序列；引物的四种碱基应随机分布、组成平衡、C+G碱基含量在引物中的比例一般为40%～60%；二条引物的Tm值不能差别太大；引物的3'端应与模板严格配对、避免重复的CG碱基序列、最后一个碱基最好不落在密码子的第三个碱基、尽可能选择A或T而非G或C；引物的5´端可加修饰成份。

反应体系中四种核苷酸的浓度必须一致。

DNA聚合酶为耐热Taq DNA聚合酶，无校正功能，会导致PCR产物的序列发生错误。

缓冲液中盐离子影响DNA变性和退火温度以及酶活性。

（3）反应程序：变性温度一般为95℃～97℃，退火温度取决于引物的Tm，通常低于引物Tm 5℃左右，延伸温度为72℃。每个步骤的时间取决于所扩增片段的长度。循环次数一般为20～40次。

（二）PCR产物分析

主要有PCR-RFLP、PCR-ASO、PCR-SSCP等，用于分析PCR产物有无点突变。

（三）PCR衍生技术

（1）逆转录PCR是以细胞内总RNA或mRNA为材料进

行核酸扩增的技术。首先在逆转录酶的作用下，将RNA进行逆转录反应生成cDNA，然后再以cDNA作为模板进行PCR 扩增，得到所需的目的基因片段。RT-PCR在临床上主要用于RNA病毒的检测，此外还被广泛用于cDNA克隆、cDNA 探针合成及基因表达分析等。

（2）多重PCR是在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中同一靶DNA或不同靶DNA的多个不同序列片段。临床上常用于分型或鉴定，如个体识别、病原体分型或法学鉴定。

此外还有巢式PCR、转录依赖扩增系统、序列特异PCR、任意引物PCR（随机扩增多态性DNA）、全基因组扩增、微乳液扩增和锚定扩增、长片段PCR等靶序列扩增技术。

（3）实时荧光定量PCR 指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

1. 概念：

荧光阈值（threshold）指在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上。一般来说，将 PCR反应前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，因此，荧光域值一般设置为3～15个循环的荧光信号标准差的10倍，但在实际应用时需结合PCR反应扩增效率、线性回归系数等参数来综合考虑。

循环数（cycle threshold value, Ct）指PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经过的循环次数。

2. 数据分析

1）标准曲线法的绝对定量原理是将预先已知含量的标准品稀释成不同浓度的样品并作为模板与待测样本同时在实时荧光定量PCR仪进行扩增，所得结果根据经系列稀释的并且已知含量的标准品经扩增后得出的标准曲线（横坐标为标准品的起始拷贝数的对数，纵坐标为Ct值）。对待测样本进行定量时，根据待测样本的Ct值，即可从标准曲线方程中计算出待测样本的起始拷贝数。

2）相对定量

标准曲线法的相对定量: 同时扩增待测样本中目的基因和内参基因，然后根据各自标准曲线计算待测样本中初始表达量，然后通过公式：F=（待测样本目的基因浓度/待测样本内参基因浓度）/（对照样本目的基因浓度/对照样本内参基因浓度），即可计算出不同样本或不同处理条件下目的基因的表达量差异

比较Ct法的相对定量: △Ct目的基因= Ct（目的基因）- Ct（同一样本的内参基因）；△△Ct目的基因=实验组△Ct目的基因-对照组△Ct目的基因相对表达量（实验组/对照组）=2-△△Ct目的基因