双标记免疫荧光染色
免疫荧光双标操作方法及注意事项
免疫荧光双标操作方法及注意事项以下是免疫荧光双标操作方法及注意事项的详细介绍：方法：1.样品制备：a.细胞：将培养皿中的细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，并以适当浓度悬浮于PBS（磷酸盐缓冲液）中。
b.组织：从动物体内取出组织样本，用PBS洗涤并切成适当大小的块。
2.固定：a.细胞：用适当浓度的乙醛在室温下固定细胞。
b.组织：用适当浓度的乙醛固定组织样本，然后在PBS中冲洗。
3.渗透：a.细胞和组织：将样本浸泡在PBS-T（含0.2%的肌凝蛋白酶）中，进行渗透处理，以增强抗体的渗透性。
4.阻断：a.使用几何草酸或明胶作为非特异性蛋白质的抗原来阻止非特异抗体的结合。
5.主抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的一抗（特异抗体），孵育样本，可以在室温或4°C条件下进行。
6.洗涤：a. 用PBS-T或TBST（含0.1%的Tween 20）进行多次洗涤，以去除未结合的一抗。
7.次抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的二抗（荧光标记的抗体），与一抗结合后，通过固定区域与目标蛋白进行特异结合。
8.洗涤：a.用PBS-T或TBST进行多次洗涤，以去除未结合的二抗。
9.核染色/细胞膜染色：a.加入DNA染色剂（如DAPI）或细胞膜标记（如细胞膜标记染料），用于定位目标蛋白。
10.显微镜观察：a.将样本放置在玻片上，用荧光显微镜观察并拍照或记录图像。
注意事项：1.温度控制：孵育和洗涤过程中，适当控制温度可以提高抗体结合的特异性和效率。
2.抗体稀释倍数：需要根据实验要求和试剂手册推荐的稀释倍数来使用抗体。
3.阻断剂的选择：根据实验要求选择适当的非特异性蛋白质抗原来阻断非特异抗体的结合。
4.试剂保存：将抗体和荧光标记物保存在适当的低温条件下，避免暴露在光和高温下。
5.孵育时间：一抗和二抗的孵育时间需要根据试剂手册推荐的时间来进行。
6.具体细胞/组织类型的处理：不同的细胞或组织在样品制备和处理过程可能需要略微不同的方法，可以参考试剂手册或已发表的方法。
免疫荧光双染和细胞化学DAB染色步骤
制备细胞爬片1、在无菌培养皿或6孔细胞培养板中铺上灭菌后的盖玻片，在每片盖玻片上滴一滴计数后的细胞悬液（细胞密度为2×105/ml）。
再在每片盖玻片上滴加培养液至刚好覆盖满盖玻片。
将培养皿（6孔细胞培养板）置于37℃，含5% CO2及饱和湿度的CO2培养箱中培养。
2、4小时后将培养液加量至覆盖整个培养皿的底面。
3、倒置显微镜下观察，当细胞增殖到合适的密度后取出培养皿中止培养（一般为1-3天）。
4、倾去培养液，加PBS（PH 7.2～7.4）洗涤细胞爬片2 次，每次1 min。
5、加10%中性多聚甲醛（或-20℃预冷的丙酮）固定10～15min。
6、吸除固定液，加PBS 再洗涤细胞爬片3 次，每次5 min。
7、置于室温下干燥1小时，如暂不染色，先放在-20 冰箱中保存。
8、取出盖玻片时注意盖玻片的正反面（有细胞的为正面）。
将硅化玻片放入饭盒（金属），排好顺序，一定要放平，消毒，将消化好的细胞滴在硅化玻片上，可一片滴两滴，放入培养箱2小时，待细胞贴片，2小时后取出加培液至没过玻片，放培养箱过夜，取出后即丙酮固定，偶做过，效果不错的。
免疫荧光双染用两个不同的物种的原始抗体的双免疫荧光染色基本方案1)冰冻切片，晾干，4%多聚甲醛固定10～15min。
（细胞爬片固定后，以下步骤一样）2)漂洗和稀释：在10 mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，150mM NaCl（PBS）中漂洗切片，3×5分钟。
PBS液是用来漂洗和稀释的。
其他缓冲液如Tris缓冲碱（TBS）也可用。
3)在细胞爬片上加0.03%-1% Triton X-100溶液处理15min。
（若是要检测的抗原表达于胞膜，此步可考虑省略），PBS液洗3×5分钟4)阻断步骤：用含5%的正常二度抗体物种来源血清的PBS孵化切片60分钟。
（37℃）（一抗前不洗，只甩干）5)原始抗体：在切片上吸干多余的阻断液，在室温下孵化60分钟或在4℃下相应地用稀释的两个物种（如鼠和兔）的未标记的一度抗体混合一起孵化过夜。
免疫荧光双标操作方法及注意事项【范本模板】
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色.双重免疫荧光标记法（double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法.(1）直接法双重免疫荧光标记:将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B）以适当比例混合，滴加在标本上孵育,然后洗去未结合的荧光抗体,在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察,即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠,但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察,从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属,且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下:1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定.3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS （1：1）。
条件许可,建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久.5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光.6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照.二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照:（1) 阳性对照:阳性血清+荧光标记物；(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物；(3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit—FITC(绿）和donkey anti—rat-Tex-Red(红）.2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
免疫分析中常用的荧光染料与标记染色
（⼀）免疫荧光标记最常⽤的荧光染料
最常⽤的染料有FITC和藻红蛋⽩类（PE）及罗丹明等。
FITC（异硫氰酸荧光素）：绿⾊530nm
PE（藻红蛋⽩）：橙黄⾊575nm
PerCP（多甲藻黄素叶绿素蛋⽩）：深红⾊675nm
PI（碘化丙啶）：橙红⾊620nm
488nm波长的氩离⼦激光激发
APC（别藻青蛋⽩）：红⾊660nm
630nm波长的氦氖激光或红⾊⼆极管激光激发
（⼆）免疫荧光标记
常⽤的标记染⾊为直接免疫荧光染⾊和间接免疫荧光染⾊。
在进⾏双参数或多参数分析时，常常需要进⾏荧光抗体的组合标记，⽬前已经有双⾊、三⾊以及四⾊标记。
（三）细胞⾃发荧光
⾃发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会⼲扰对特异荧光信号的分辨和测量。
在免疫细胞化学等测量中，对于结合⽔平不⾼的荧光抗体来说，如何提⾼信噪⽐是个关键。
⼀般说来，细胞成分中能够产⽣⾃发荧光的分⼦（例如核黄素、细胞⾊素等）的含量越⾼，⾃发荧光越强；培养细胞中死细胞／活细胞⽐例越⾼，⾃发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的⽐例越⾼，⾃发荧光越强。
免疫荧光双染
免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS 后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
免疫荧光(单标和双标)注意事项及具体方法
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
免疫荧光单标记和双标记的方法
免疫荧光单标记和双标记的方法l免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1)所需材料与试剂(1)培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60％一70％的细胞。
(2)一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
(3)4％多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃预冷20min)。
(4)封闭液。
(5)0．01mol／LPBS缓冲液。
2)染色方法(1)取出培养有细胞的盖玻片或glass—bottom培养皿，用0．01MPBS洗2—3遍。
(2)加入0．3％的TritonX—100，37℃，30rain。
(3)加入4％多聚甲醛室温固定30min或冷丙酮4℃固定10min。
(4)正常阻断血清1：20封闭室温20～30min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
(5)去掉正常血清，直接加入一抗，37C孵育1h或4℃过夜。
抗体以0．01mol／LPBS稀释(理想的抗体浓度需经试验而定)。
(6)0．3％TritonX—100洗5min，0．01mol／IPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01MPBS洗5rain。
(7)加入FITC—二抗或TRITC—二抗，37℃，孵育1h。
(8)0．3％TritonX—100洗5rain，0．01mol／LPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01mol／LPBS洗5mln，用滤纸吸干。
(9)90％甘油(PBS配制)封片。
(10)激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。
2．免疫荧光双标记方法免疫荧光的双标记是指同时标记细胞内两种蛋白质分子，当怀疑某种配体与已知受体结合后可用此方法加以证明。
此方法稍微复杂一些，首先应注意所用的一抗必须是来自不同种属动物的两种特异性抗体(例如：A抗体为多克隆抗体，来自家兔；B抗体为单克隆抗体，来自小鼠)。
免疫荧光 双标
免疫荧光步骤（双标）1.冰冻切片制备将脱水后的脊髓标本放于冰冻托盘上，加OCT使组织被完全包埋，置于冰冻切片机中，调节箱体温度为-22℃，冷冻头温度为-23℃。
观察OCT冻成白色固态状时，将其放置于冷冻头，准备切片。
设置切片厚度为8µm，必要时用刷子辅助将切好的OCT薄片贴附于载玻片上。
室温下晾干载玻片后保存于-20℃冰箱。
2.免疫荧光染色（1）室温下晾干切片15min，待完全晾干后放置于湿盒内，PBS冲洗浸泡5min/次，3次（以除去OGT）。
（2）抗原修复液(1X)（双蒸水稀释），95-100℃加热约20分钟(加热时间可以控制在10-30分钟内)。
20-30分钟内冷却至室温。
PBS冲洗5min/次，3次。
（3）用滤纸吸干玻片上残余PBS，用免疫组化笔在标本周围画一适当大小圆圈，避免接触标本，将配置好的封闭液（5%驴血清=920ulPBS+50ul驴血清+30ul 10%trition）加入圆圈内，室温下封闭1h。
（4）用滤纸吸去封闭液，向标本加入相应一抗：（1%BSA）兔源一标：兔抗IL-33（1：50）小鼠源二标：小鼠抗NeuN（1：500，神经元）小鼠抗GFAP（1：300，星形胶质细胞）小鼠抗OX42（1：100，小胶质细胞）小鼠抗OLIG2（1: 25，少突胶质细胞）一抗于4℃静置过夜孵育。
（5）次日，PBS洗去一抗，10min/次，3次，用滤纸吸干PBS，之后操作均需避光，向标本加入相应二抗：Dylight 488标记驴抗兔IgG（1：300），Dylight 594标记驴抗小鼠IgG（1：300），二抗室温静置避光孵育2h。
（6）PBS清洗二抗，10min/次，3次，清洗后晾干后滴加DAPI封片，加盖玻片后于荧光显微镜下拍摄图片并保存。
计划：1.IL-33组：1）IL-33/NeuN X2个配比浓度2）IL-33/GFAP X23）IL-33/Iba-1 X24）只孵二抗X22.Sham组：1）IL-33/NeuN X12）IL-33/GFAP X13）IL-33/Iba-1 X14）只孵二抗需要购买：Triton-100，驴血清，一抗：小鼠抗RBFOX3/ NeuN、小鼠抗GFAP、小鼠抗OX42，二抗：Dylight 488标记驴抗兔IgG，BSA(牛血清白蛋白)注意：1、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。
免疫荧光双标染色法意义
免疫荧光双标染色法意义在生物医学研究领域，免疫荧光双标染色法是一项重要的实验技术。
该方法通过同时检测两种不同的标记物，帮助科研人员更深入地了解细胞或组织中的复杂生物过程。
本文将详细介绍免疫荧光双标染色法的意义及其在科研中的应用。
一、免疫荧光双标染色法简介免疫荧光双标染色法是一种基于荧光标记的免疫组化技术。
它通过特异性抗原与抗体结合，利用荧光染料标记的抗体来显示细胞或组织中的特定分子。
与传统的免疫组化染色方法相比，免疫荧光双标染色法具有更高的灵敏度和更广的适用范围。
二、免疫荧光双标染色法的意义1.同时检测两种不同的标记物免疫荧光双标染色法最大的优势在于可以同时检测两种不同的标记物。
这在研究细胞或组织中的复杂生物过程时具有重要意义。
例如，在研究肿瘤细胞与免疫细胞相互作用的过程中，可以同时检测肿瘤标志物和免疫细胞标志物，从而更深入地了解两者之间的关系。
2.精确定位细胞内分子免疫荧光双标染色法具有较高的空间分辨率，可以精确定位细胞内分子。
这有助于揭示细胞内分子之间的相互作用和信号传递路径，为疾病发病机制的研究提供有力支持。
3.提高实验效率免疫荧光双标染色法可以在同一实验中同时完成两种标记物的检测，大大提高了实验效率。
此外，该方法操作简便，实验周期较短，有利于科研人员快速获得实验结果。
4.适用于多种样本类型免疫荧光双标染色法适用于多种样本类型，如细胞爬片、组织切片、细胞悬液等。
这为科研人员提供了广泛的实验选择，有助于研究不同类型的生物样本。
5.可视化细胞动态过程通过免疫荧光双标染色法，可以实时观察细胞内分子的动态变化，如细胞迁移、细胞凋亡等。
这有助于揭示细胞在生理和病理过程中的重要作用。
三、免疫荧光双标染色法在科研中的应用免疫荧光双标染色法在生物医学研究中具有广泛的应用，如：1.肿瘤研究：通过检测肿瘤标志物和免疫细胞标志物，研究肿瘤微环境中的相互作用。
2.神经科学研究：揭示神经元之间的联系和信号传递机制。
免疫荧光双染完整版
免疫荧光双染集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
免疫荧光共定位数据处理
免疫荧光共定位数据处理免疫荧光共定位数据处理是一种重要的实验技术，用于研究细胞内蛋白质的相互作用及定位。
本文将介绍该技术的基本原理和常用方法，以及在研究中的一些应用案例。
免疫荧光共定位是一种通过标记不同蛋白质的荧光探针，通过荧光显微镜观察它们在细胞中的共定位情况。
这种方法基于免疫反应的原理，通过特异性的抗体与目标蛋白质结合，再使用荧光标记的二抗标记抗原-抗体复合物来可视化目标蛋白质的位置。
通过观察不同标记的蛋白质在细胞中的共定位情况，可以揭示它们之间的相互关系和功能。
常用的免疫荧光共定位方法包括单色免疫染色和双色免疫染色。
单色免疫染色是指使用一种荧光标记的二抗来可视化目标蛋白质的位置，而双色免疫染色则是同时使用两种不同颜色的荧光标记的二抗来可视化两个目标蛋白质的位置。
通过比较不同染色的结果，可以确定两个蛋白质是否共定位。
在研究中，免疫荧光共定位数据处理是不可或缺的一步。
首先，需要对荧光显微镜图像进行处理和分析，以提取有关蛋白质定位的信息。
常用的处理方法包括图像增强、背景消除、图像分割和定量分析等。
通过这些处理，可以获得蛋白质的定位信息和定量数据，以进一步研究其功能和相互作用。
免疫荧光共定位数据处理在细胞生物学、分子生物学和疾病研究中具有广泛的应用。
例如，研究者可以利用该技术来研究细胞器的分布和动态变化，揭示蛋白质在细胞内的定位和运输机制。
此外，免疫荧光共定位还可以用于研究蛋白质的相互作用网络和信号通路，以及研究疾病的发生机制和治疗靶点。
免疫荧光共定位数据处理是一项重要的实验技术，可用于研究细胞内蛋白质的相互作用和定位。
通过对荧光显微镜图像的处理和分析，可以获得有关蛋白质定位的信息和定量数据，为进一步研究提供基础。
该技术在生命科学研究中具有广泛的应用前景，将为我们深入了解细胞内蛋白质的功能和相互关系提供重要的工具和方法。
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸H37℃温箱等。
试验步骤1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持肯定湿度。
2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全掩盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温肯定时间（参考：30min）。
3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按挨次过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片掩盖。
5、马上用荧光显微镜观看。
观看标本的特异性荧光强度，一般可用"+'表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清晰可见；（++）荧光光明；（+++ --++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达"++'以上，而各种对比显示为（）或（-），即可判定为阳性。
留意事项1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有肯定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观看。
2、染色的温度和时间需要依据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。
Brdu+Neun 免疫荧光双标标记
根据实验室现有的抗体，GFAP只能做红色568，为了和别的抗原区别，选择Brdu做绿色488，Neun 做647蓝色：
Brdu+Neun 免疫荧光双标标记前者绿色488后者蓝色647
1、2NHCI 漂洗30m
2、PB 洗6*5m
3、硼酸洗3*15m
4、一抗加入大鼠抗Brdu 和小鼠抗Neun 的混合抗体液4°C过夜
5、PB 洗3*30m
6、二抗加入羊抗大鼠—488 和羊抗小鼠—647的混合抗体液常温避光4h或者4°C避光过夜
7、PB 洗6*5m + 2*10m
8、快速裱片封片，荧光显微镜下观察照相
或者
6、二抗加入带有生物素的羊抗小鼠4°C过夜
7、PB 洗3*30m
8、加入三抗SABC—647 避光1h
9、PB 洗6*5m + 2*10m
10、加入羊抗大鼠—488 常温避光4h或者4°C避光过夜
11、PB 洗6*5m + 2*10m 尽量避光
12、快速裱片封片，荧光显微镜下观察照相尽量避光
Brdu+GFAP 免疫荧光双标标记前者绿色488后者红色568
1、2NHCI 漂洗30m
2、PB 洗6*5m
3、硼酸洗3*15m
4、一抗加入大鼠抗Brdu 和兔抗GFAP的混合抗体液4°C过夜
5、PB 洗3*30m
6、二抗加入羊抗大鼠—488 和羊抗兔—568的混合抗体液常温避光4h或者4°C避光过夜
7、PB 洗6*5m + 2*10m 尽量避光
8、快速裱片封片，荧光显微镜下观察照相尽量避光
或者单独加二抗三抗上同。
双重免疫荧光细胞化学标记方法
双重免疫荧光细胞化学标记方法在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色。
一般均采用直接法，将两种荧光抗体(如抗A或抗B)以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素（FITC）标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TM—RITC或RB200标记或PE标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。
在同一标本上有两种抗原需要同时显示(如A抗原和B抗原)，A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗丹明标记，可采用以下染色方法：1．一步法双重染色方法先将两种标记抗体按适当比例混合(A+B)，按直接方法进行染色。
2．二步法双染色方法先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间接法进行。
结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现橘红色荧光。
激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。
由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。
系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。
调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。
主要用途：1．细胞及生物荧光样品观察分析。
2．绿荧光蛋白分析。
3．荧光原位杂交分析。
4．光切片扫描。
5．3D图像处理。
6. 时间序列拍摄成像.。
双抗体免疫荧光法
双抗体免疫荧光法
双抗体免疫荧光法（Double Antibody Immunofluorescence）是现代生物医学领域中常用的一种荧光染色技术。
它可快速、准确地检测
细胞中的特定蛋白质，并在组织、细胞和细胞培养上具有广泛的应用。
这种技术的原理是利用两种特异性不同但互相连接的第二抗体。
第一
种抗体会与待检测分子结合成对，第二种抗体会对第一个抗体的Fc区域（即抗原结合部位）特异性绑定，从而标记出待检测分子。
双抗体免疫荧光法有很多优点，包括能够准确鉴定不同种类的细胞、
检测细胞内蛋白的亚细胞分布以及分析分子相互作用等。
除此之外，
它还可以用于研究许多不同的疾病，包括肿瘤、自身免疫病、感染和
特定细胞功能评估等。
在使用双抗体免疫荧光法时，应特别注意操作步骤，包括样本制备、
抗体选择和标记、染色条件控制等。
同时还应注意对比实验组和空白
实验组，以确保结果的准确性和可重复性。
总之，双抗体免疫荧光法是现代生物医学研究中一种高效而准确的技术。
在实际应用中，可以运用于广泛领域，具有很高的临床应用价值。
对于一些确诊性强、准确性要求高的疾病，该技术将会成为生命科学研究的重要工具。
APC 与 Casepase-3 免疫荧光双标染色
APC 与 Casepase-3 免疫荧光双标染色
1. 主要实验材料：APC 抗体、caspase -3 抗体
2. 实验设置：
八臂迷宫实验结束后，腹腔麻醉大鼠，行心脏灌注，固定结束后取含有胼胝体的脑组织包埋切片，切片厚度为 4μm，切片用 PBS 漂洗，然后滴加封闭液封闭 30 min，组织片孵育APC 一抗 4℃过夜。
第 2 d，组织片孵育罗丹明红色荧光标记的二抗 37 ℃烤箱 2 h。
组织片用 PBS 漂洗后，继续孵育 Casepase-3 一抗 4℃过夜。
第 3 d，组织片孵育 FITC 绿色荧光标记的二抗 2 h，0.06% DAPI 复染细胞核 30 s，漂洗晾干，荧光封片剂封片，镜检拍照片。
实验分组：
A. 假手术组；
B. 模型组；
C. ***低剂量组；
D. ***中剂量组；
E. ***高剂量组；。
免疫荧光双标法
免疫荧光双标法免疫荧光双标记在⼼肌⽯蜡切⽚中的应⽤陈绪军肖明第吕志前卢成宝薛松袁忠祥徐根兴作者单位：200080 上海市第⼀⼈民医院⼼⾎管外科细胞性⼼肌塑型术（cellular cardiomyoplasty ）⽤于缺⾎性⼼肌病的治疗受到⼈们越来越多的关注[1]，在证实移植的⼈⼲细胞在缺⾎/ 损伤的环境中分化为⼈⼼肌细胞⽅⾯，免疫荧光技术的运⽤逐渐增多，但多⽤的是新鲜冰冻切⽚，在⽯蜡⼼肌切⽚中应⽤较少，⽽且多是单⼀抗原的荧光标记[2]。
有研究表明，酪胺信号放⼤（ tyramide signal amplifications, TSA）技术可以提⾼反应的灵敏性⼕役为此，我们以⼈⼼肌⽯蜡切⽚标本为例，运⽤TSA-免疫荧光法与常规间接免疫荧光法分别对⼈⼼肌连接蛋⽩（connexin-43 ，Cx-43）蛋⽩及肌凝蛋⽩（myosin ）进⾏标记，旨在为⼼肌⽯蜡切⽚建⽴⼀个免疫荧光双标记的⽅法。
⼀、材料与⽅法1. 主要试剂：兔抗⼈肌凝蛋⽩（myosin ）多克隆IgG 抗体购⾃美国Chemicon 公司，标记异硫氰酸酯荧光素（FITC）的驴抗兔多克隆IgG抗体与标记有辣根过氧化物酶（HRP的驴抗⼩⿏多克隆IgG抗体均购⾃美国Jackson Immunity公司,⼩⿏抗⼈Cx-43单克隆抗体、碘化丙啶（PI）与⽜⾎清⽩蛋⽩（BSA）购⾃美国Sigma公司，酪胺（tyramide）-coumrian 结合物试剂盒购⾃美国PerkinElmer 公司。
2．标本的取材、固定、切⽚及抗原修复: ⼈⼼肌取⾃⼀例6岁先天性⼼脏病⼩孩右房⽿，中性福尔马林固定，4° C过夜固定，梯度酒精脱⽔，⽯蜡包埋，5⼙m⽯蜡切⽚。
⽯蜡切⽚常规脱蜡、梯度酒精浸泡后⾏抗原修复：浸⼊0.01 mol/L 的柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中，95C，浸泡30 min, 室温冷却10 min。
3. Cx-43的免疫荧光标记：采⽤TSA-免疫荧光法⼕4：,按试剂盒说明书进⾏。
免疫荧光双染
免疫荧光双染 Revised by Hanlin on 10 January 2021免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
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双标记免疫荧光染色
一、实验目的：
1.检测MT, IGF-1/FGF5与两个目的基因所表达的蛋白的共表达。
2.检测目的基因所表达的蛋白定位。
3.检测褪黑激素或细胞因子对目的基因高表达的影响以及表达规律。
二、实验材料：
1.试剂：多聚甲醛，目的基因一抗，自带荧光的二抗（地高辛－地高辛抗体，生物素－链霉亲和素）细胞核染料DAPI
2. 器材：激光共聚焦显微镜显微镜专用玻片，共聚焦专用培养皿。
三、实验步骤：
1.细胞培养：
取对数期细胞于6孔板培养24小时，放入共聚焦专用玻片，贴壁细胞爬片需要24小时，细胞数目达到4×104个细胞，设置两个以上六孔板分别为对照组和实验组；
2.实验组加药处理：
加入MT或IGF-1或FGF5处理24小时或48小时，72小时。
3.上镜前处理：
将玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15min；PBS洗多次，加0.1%Triton-X100透化10min；PBS洗3次，5%FBS室温封闭一到数小时；PBS洗3次，将MT、FGF-5、IGF-1抗体(1：200)和目的基因(工作液)两两组合，共六组，按体积比1：1混匀，一起加到切片上，4℃过夜；
第二天，PBS洗3次，加入荧光二抗[加入TRITC(罗丹明)标记羊抗兔IgG(1：100)；37℃孵育30 min；加人FITC标记山羊抗鼠IgG(1：100)]，室温避光45min；（之后均为避光操作）PBS洗3次，加入核染料，n分钟；PBS洗3次，灭菌水洗2次；
取处理好的载玻片，写好组别，在正中央滴约30ul防猝灭剂，小心将盖玻片夹起，缓慢放下，不要产生气泡，避光晾干。
以PBs代替一抗作为阴性对照，省略一抗作空白对照。
4.镜检
四、结果预测：
1.共表达：
两个基因分别为阳性红色，绿色。
共表达出现红绿重叠而呈现黄色荧光，显示蛋白定位。
2.正负表达：看荧光强弱。