双标记免疫荧光染色

双标记免疫荧光染色

一、实验目的：

1.检测MT, IGF-1/FGF5与两个目的基因所表达的蛋白的共表达。

2.检测目的基因所表达的蛋白定位。

3.检测褪黑激素或细胞因子对目的基因高表达的影响以及表达规律。

二、实验材料：

1.试剂：多聚甲醛，目的基因一抗，自带荧光的二抗（地高辛－地高辛抗体，生物素－链霉亲和素）细胞核染料DAPI

2. 器材：激光共聚焦显微镜显微镜专用玻片，共聚焦专用培养皿。

三、实验步骤：

1.细胞培养：

取对数期细胞于6孔板培养24小时，放入共聚焦专用玻片，贴壁细胞爬片需要24小时，细胞数目达到4×104个细胞，设置两个以上六孔板分别为对照组和实验组；

2.实验组加药处理：

加入MT或IGF-1或FGF5处理24小时或48小时，72小时。

3.上镜前处理：

将玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15min；PBS洗多次，加0.1%Triton-X100透化10min；PBS洗3次，5%FBS室温封闭一到数小时；PBS洗3次，将MT、FGF-5、IGF-1抗体(1：200)和目的基因(工作液)两两组合，共六组，按体积比1：1混匀，一起加到切片上，4℃过夜；

第二天，PBS洗3次，加入荧光二抗[加入TRITC(罗丹明)标记羊抗兔IgG(1：100)；37℃孵育30 min；加人FITC标记山羊抗鼠IgG(1：100)]，室温避光45min；（之后均为避光操作）PBS洗3次，加入核染料，n分钟；PBS洗3次，灭菌水洗2次；

取处理好的载玻片，写好组别，在正中央滴约30ul防猝灭剂，小心将盖玻片夹起，缓慢放下，不要产生气泡，避光晾干。

以PBs代替一抗作为阴性对照，省略一抗作空白对照。

4.镜检

四、结果预测：

1.共表达：

两个基因分别为阳性红色，绿色。共表达出现红绿重叠而呈现黄色荧光，显示蛋白定位。

2.正负表达：看荧光强弱。