固相亚磷酰胺法——简易讲解模板共18页

DNA合成原理及操作

3. 氨解脱保护合成完毕后取出载体进行切割并且脱保护。
一般40bp以内至少需要2小时，链越长需要时间越长。
4. 纯化: 目前惯用的纯化方式主要有4种： OPC纯
化、 PAGE 纯化、脱盐纯化、 HPLC纯化
4.1 OPC纯化
利用OPC柱芯对DMT寡核苷酸特殊的亲和力，将不带DMT的短片段用低浓度的有机溶剂洗脱，吸附在柱芯里的DNA用酸除去DMT后用1ml 的20%乙腈洗脱。
缺点：不能批次生产，比较费时，有时样品接收不好也不能有效分离。
5. 样品定量分装样品纯化后洗脱在1ml的20%乙腈溶液
里，260紫外波长下测值，根据客户要求分装，一般所有合成公司基本都会按1.2-1.5 倍放大给量。分装的样品干燥，经PAGE抽样检测合格后交给市场。
合成时效：批次引物（按24条计算）在24小时之内可以出货
DNA合成作业流程
1. 接收订单安排合成
合成部根据合成实际情况合理安排订单，依次安排加急-测序-内部-外部，同一客户尽量同批次安排合成，部分长链、G含量高、合成量大的引物比较难合成，时间上可能会有所延缓
2. 上机合成
不同型号的合成仪合成通量和合成时间均不同，公司预定的仪器批次合成96条引物， 20bp长度合成需要2-3小时。
④氧自由基伤害细胞代谢副产物O2-、H2O2等会造成碱基损伤，产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物，引起碱基配对错误。
三、碱基插入或缺失吖啶类分子带正电呈扁平状，易于嵌入DNA碱基平面间，导致在复制或重组过程中缺失或插入一个碱基。 DNA聚合酶在复个碱基的缺失或插入。聚合酶在模板链上滑动易于造成缺失，在生长链上滑动易于造成插入。插入或缺失会导致读码框改变。

DNA合成仪

N1 HO
O
乙酸酐和N-甲基咪唑
CPG
O C H 3C O N1
O
CPG
5.氧化：连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（磷为三价）与CPG上相连的寡核苷酸链连接，此亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。常用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。此步反应速度亦很快。应注意最后一个循环时，氧化步骤不可省略。此外亦可用其他氧化剂来完成氧化，从而得到各种符合实验需要的寡核苷酸。 Oxidiser (0.1M) (ABI) 0.1M Iodine in THF/pyridine/water
3.连接：亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸碰撞时，与其5’羟基发生亲核反应，发生缩合并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。此步单体相对于CPG所连核苷酸上5’-羟基过量保证了连接的高效率。形成3’，5’－磷酸二酯键。其中，磷为3价。
N2 DMTrO
O P
CH(CH3)2 N1
N
CH(CH3)2
N2 DMTrO
O
O
P
N1 O
O
CPG
OCH2CH2CN
• 上述循环完成之后进行第二个合成循环。每经历一轮循环，接长1个核苷酸。接长的链始终被固定在不溶的固相载体上，过量的未反应物或分解物则通过过滤或洗涤除去。
• 6.切离，脱保护：当整个链达到预定的长
度后，从固相载体上切下，脱去保护基(氨解)。一般用新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉腈乙基、苯甲酰基、异丙基，用三氟乙酸脱5’-DMT。
1
D M T rO
O
T C A
CPG
N1 HO
O
CPG
2.活化：在缩合之前，单体与四唑混合并进入合成柱，此时四唑提供一个质子给3’磷酸上二异丙胺基的N原子，质子化的二异丙胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体。此步四唑过量保证了单体活化充分。

固相亚磷酰胺法——简易讲解模板

继续发生反应，这种短片段可以
在纯化时分离掉。
请在此添加段落内容……
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第四步：在氧化剂碘的作用
下，亚磷酰形式转变为更稳定
第一个循环结束
的磷酸三酯。
后期处理
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到
2
固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的 5'-羟基上的保护基团 DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱
A
可以开始了
CP G
第二步：合成DNA的原料，
亚磷酰胺保护核苷酸单体，与
活化剂四氮唑混合，得到核苷
亚磷酸活化中间体，它的3'端
被活化，5'-羟基仍然被DMT保
护，与溶液中游离的5'-羟基
发生缩合反应。
DM T
P
A
核苷酸与亚磷酰胺，和活化剂四氮唑混合，核苷酸3’上的氢被亚磷酰胺取代形成核苷亚磷酰胺活化中间体
具有高效、快速的偶联以及
起始反应物比较稳定的特点。
详细步骤：
第一步：将预先连接在固相载体
CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三
氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基
团DMT，获得）
DM H T
将核苷酸固定在载体上
P
在三氯乙酸作用下，在某反应下，磷酸基脱去DMT产生游离的团被DMT取代以保护羟基 5‘端的羟基
原理：
将核苷3'固定在固相载体（如CPG，可控微
孔玻璃珠）上,并在5'上连接一个保护基团DMT,使
合成的方向由待合成引物的3'端向5'端合成的。
相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。每个循环过程中都经过高效率且化学性质活泼的核苷酸3′-亚磷酸酰胺中间体，其氧化后成为稳定的五价磷酸三酯。

DNA合成及组装

微矩阵及微流控
Twist 工作流程
1. 全程自动化
2. 实现云服务，与客户云端交流，实时跟踪
3. 高通量（100w孔， 9600 gene），试剂节省，
4. 操作方便，信息保密。
5. 开放API，支持用户自定义编程
寡核苷酸及基因合成服务公司
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分类
设备+服务
设备+服务设备设备
服务平台服务平台服务，试剂服务，试剂
平台服务服务服务平台
扩展服务试剂，修饰
DEL
高通量微矩阵技术
生物全系
生物全系生物全系
优点：高效（99.5%）、快速，精准可控缺点：1. 内部缺陷，错误率1%。
2. 单突变。 3. 纯化损耗大, OPC与HPLC的得率约为30%～50%，PAGE的得率约为10%～30%
DNA合成仪
Dr.Oligo 96DNA/RNA核酸合成仪 K&A H-64型核酸合成仪
ABI 394合成仪
德国PolyGen公司DNA合成仪
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工业金标准高通量，云操作
服务全面
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引物-生产及使用详解

引物-生产及使用详解（一）引物的合成和纯化1. 引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

安基生物公司采用的合成仪为最新引进的Dr.Oligo192高通量合成仪，效率高，合成量大，质量稳定。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下：第一步：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基。

第二步：合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

第三步：带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC、PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀。

沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

Oligo DNA合成原理

Oligo DNA 合成
固相亚磷酰胺三酯法是目前最常用的Oligo DNA化学合成方法，它具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。

合成步骤：
1、脱保护：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基；
2、缩合：合成DNA的原料-单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应；
3、带帽(capping)反应：缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应；
4、氧化：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯；
通过上述步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

再重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被连接上去。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率；
5、氨解：通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来；
6、纯化：切下来的Oligo粗品根据实验目的不同选择不同的纯化手段进行纯化，OD260定量及抽干后根据定单要求对Oligo进行分装。

寡核苷酸的制备与纯化

寡核苷酸的制备与纯化DNA的合成有磷酸三酯法、亚磷酰胺法、氢磷酸法等，现在常用的是固相亚磷酰胺法，它具有快速、方便、偶联效率高等特点。

一般从3′向5′合成，通过下列四个步骤加上一个核苷酸。

第一步，脱保护：用三氯乙酸或二氯乙酸脱去连在固相载体上的核苷酸5′羟基上的保护基团DMT，使它暴露出来进行下一步反应。

第二步，偶联：将亚磷酰胺单体用四唑活化，形成高反应性的亚磷酰四唑，进入合成柱，与连在固相载体上的寡核苷酸5′羟基偶联，这一步效率一般在98％以上。

第三步，封闭：为了防止少量未反应（＜2％﹞的连在固相载体上的5′羟基进入下一循环，用醋酐对其进行乙酰化封闭，大大提高了最后产品的纯度。

第四步，氧化：缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酯转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。

经过上面四个步骤，核苷酸被逐个加到合成的寡核苷酸链上。

最后用浓氨水把寡核苷酸从固相载体上切割下来，脱去碱基和磷酸基团上的保护基团，随后进行纯化和定量。

纯化方法：寡核苷酸的纯化常用的方法有OPC，HPLC，PAGE，C18等方法。

OPC柱中装有对DMT具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5'端最后一个碱基上的DMT，所有合成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有DMT 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有DMT的片段吸附能力弱，被洗脱。

然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去DMT基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。

这种方法的优点是快速，简易。

但是其专一性吸附DMT能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。

特别是对长于25碱基以上的片段纯化效果不好。

利用离子交换或反相HPLC纯化寡核苷酸是国外公司常用的方法，它具有自动化程度高、快速、简便的优点，缺点是需要仪器，对长片段效果不理想。

PAGE纯化是利用长短片段带的电荷不同，电泳迁移率不同来分离不纯物和产品，它的优点是产品纯度高、质量可靠，是国内许多公司推崇的方法，缺点是实验步骤多，费人工。

引物篇(引物合成及各种问题总结)

引物篇1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。

沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。

(完整word版)引物纯化方式选择指南

引物纯化方式选择指南2012-2-16 10:24:14内容导读一、DNA合成的方法和原理二、引物纯化的方法原理及其效果三、纯化方法与应用指南四、常见问题的原因分析及相应的对策一、DNA合成的方法和原理目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行。

基于该方法的DNA合成仪有多种，由ABI/PE 公司生产的高通量DNA自动合成仪得到了广泛的应用。

各合成仪进行引物合成的原理基本相同，主要区别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时等。

生工公司采用的合成仪主要机型为全新的ABI3900高通量合成仪。

固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’ →3’方向延伸，而是由3’端开始，相邻的核苷酸通过3’→ 5’磷酸二酯键连接。

具体的反应步骤如图一。

1、脱保护基(Deblocking)用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。

2、活化(Activation)将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

3、连接(Coupling)亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。

4、封闭(Capping)缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。

引物纯化方式选择指南

引物纯化方式选择指南2012-2-16 10:24:14内容导读一、DNA合成的方法和原理二、引物纯化的方法原理及其效果三、纯化方法与应用指南四、常见问题的原因分析及相应的对策一、DNA合成的方法和原理目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行。

基于该方法的DNA合成仪有多种，由ABI/PE公司生产的高通量DNA自动合成仪得到了广泛的应用。

各合成仪进行引物合成的原理基本相同，主要区别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时等。

生工公司采用的合成仪主要机型为全新的ABI3900高通量合成仪。

固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’ →3’方向延伸，而是由3’端开始，相邻的核苷酸通过3’→ 5’磷酸二酯键连接。

具体的反应步骤如图一。

1、脱保护基(Deblocking)用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。

2、活化(Activation)将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

3、连接(Coupling)亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。

4、封闭(Capping)缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。

引物合成的详解

引物合成的详解.txt这是一个禁忌相继崩溃的时代，没人拦得着你，只有你自己拦着自己，你的禁忌越多成就就越少。

自卑有多种档次，最高档次的自卑表现为吹嘘自己干什么都是天才。

11月13日引物合成的详解1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。

第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。

第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。

沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。

引物合成介绍

引物篇1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。

DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。

亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。

第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。

再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。

合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。

沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。

引物合成 ppt课件

HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高，
以上引物纯化方式我们都可以提供
最长可以合成多长的引物？
引物越长，出现问题的概率就越大。目前能合成的最长引物为120base的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参
加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片
段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
OD值如何换算浓度？
1.OD值如何转化为物质的量（nmole)
粗略地计算：1个OD值的Oligo 的重量约为33 μg，而每个碱基的平均分子量一般按330道尔顿进行计算。因此，合成DNA/RNA的nmol数一般按以下公式
Nmole=（OD*33/碱基数*330）*1000=(OD*100)/碱基数
引物合成过程
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三
氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；
第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四唑混

DNA合成原理及操作

第十八页，编辑于星期三：五点五十分。
四、嘧啶二聚体 DNA受到紫外线照射时，使DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体。相邻2个T；或2个C；或C与T间都可形成环丁基二聚体；相邻2个T间最易形成TT二聚体。
五、DNA链断裂电离辐射可使DNA链断裂；射线的直接和间接作用都可能使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而致DNA链断裂。烷化剂也可使DNA链断裂；DNA链的磷酸二酯键上的氧易被烷化，结果形成不稳定的磷酸三酯键，在糖与磷酸间发生水解，使DNA链断裂。
第八页，编辑于星期三：五点五十分。
4.1 OPC纯化
利用OPC柱芯对DMT寡核苷酸特殊的亲和力，将不带DMT的短片段用低浓度的有机溶剂洗脱，吸附在柱芯里的DNA用酸除去DMT后用1ml的20% 乙腈洗脱。
优点：方便，快捷，纯化后纯度可达90%，能满足普通PCR反应。
缺点：纯化成功与否取决于粗品DNA的纯度，合成不好的样品可能OPC纯化后也不纯，并且随着碱基数增多，纯化效果降低；由于在纯化过程中接触到酸，引物容易降解。
第九页，编辑于星期三：五点五十分。
4.2 PAGE 纯化利用DNA不同片段在胶中迁移率不同而
分离，大片段电荷多，分子大，迁移的速度慢。等目的片段与N-片段分开后切下目的片段，80℃孵育2小时后脱盐。
优点：分离效果好，纯度能达到98-99%，可以满足测序、克隆等用。引物也很稳定。
缺点：比较费时费力，样品损失很大。
合成2-3小时→ 氨解2小时→ 抽干2-3小时→ 脱盐0.5小时 → 定量分装1小时→ 抽干2-3小时→ 抽检2小时
第十四页，编辑于星期三：五点五十分。
DNA合成中碱基缺失或错误原因分析
一般客户提出异议时，我们首先给客户重新合成，然后再分析原因。从合成机理上分析就可以很清楚的表明：人为的因素不可能造成碱基缺失或个别的碱基错误。如果说某一个碱基由于种种原因(如瓶中溶液没有了，或管道堵塞)，未加入到正在延伸的Oligo上，那么下一个反应Capping将会把Oligo封死，使整个oligo合成立即中止。造成的原因可能是：

d na合成操作流程

d na合成操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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以下是 DNA 合成的一般操作流程：1. 设计 DNA 序列。

固相亚磷酰胺法——简易讲解模板共19页文档

2.引物是如何合成的．生物帮．2019-04-01[引用日期2019-0123]
3.《环球科学》杂志：组装生命的生物工厂
Thank you!
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
特点：
具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
详细步骤：
第一步：将预先连接在固相载体
CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基。（DMT：二甲氧基三苯甲基）
DTMHP
将核苷酸固定在载体上
A 在团5在脱羟‘某被三去基端反D氯D的MM应T乙T羟取产下酸基代生，作以游磷用保离酸下护的基，
DMT，重复以上步骤，
直到所有要求合成的碱
基被接上去。
1
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下
来，通过OPC,page等手段纯化引物，成品引物用
C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，
测定OD260定量，根据定单要求分装。
3
参考资料
1.亚磷酰胺法．全国科学技术名词审定委员会[引用日期2019-01-23]
13、遵守纪律的风气的培养，只有领导者本身在这方面以身作则才能收到成效。—— 马卡连柯 14、劳动者的组织性、纪律性、坚毅精神以及同全世界劳动者的团结一致，是取得最后胜利的保证。—— 列宁摘自名言网

亚磷酰胺单体合成路线

亚磷酰胺单体合成路线
亚磷酰胺是一种重要的化学品，广泛应用于化工、医药、农业等领域。

其单体合成路线主要有以下几种：
1. 氨基膦酸酯法：以氨基膦酸酯为原料，经过加热反应生成亚磷酰胺单体。

该方法简单易行，但是反应条件较为苛刻，产率较低。

2. 氨基膦酸酐法：以氨基膦酸酐为原料，通过加热反应生成亚磷酰胺单体。

该方法反应条件较为温和，产率较高，但是原料价格较高。

3. 氨基膦酸法：以氨基膦酸为原料，通过加热反应生成亚磷酰胺单体。

该方法反应条件较为温和，产率较高，但是需要使用催化剂。

4. 氨基氰化物法：以氨基氰化物为原料，经过加热反应生成亚磷酰胺单体。

该方法反应条件简单，但是产物纯度较低。

总的来说，亚磷酰胺单体的合成路线有多种选择，不同的方法有其优缺点，需要根据具体情况选择合适的方法。