固相亚磷酰胺法——简易讲解模板共18页

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第四步：在氧化剂碘的作用
下，亚磷酰形式转变为更稳定
第的一磷酸个三酯循。 环结束
后期处理
经过以上四个步骤，一
个脱氧核苷酸被连接到 固相载体的核苷酸上。 再以三氯乙酸脱去它的 5'-羟基上的保护基团
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合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合 成效率。
DMT，重复以上步骤，
直到所有要求合成的碱
基被接上去。
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通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下
来，通过OPC,page等手段纯化引物，成品引物用
C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，
测定OD260定量，根据定单要求分装。
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参考资料
1.亚磷酰胺法 ．全国科学技术名词审 定委员会[引用日期2019-01-23]
可以开始了
CP G
第二步：合成DNA的原料，
亚磷酰胺保护核苷酸单体，与 活化剂四氮唑混合，得到核苷 亚磷酸活化中间体，它的3'端 被活化，5'-羟基仍然被DMT保 护，与溶液中游离的5'-羟基 发生缩合反应。
DTMP
A
核苷酸与亚磷酰
胺，和活化剂四 氮唑混合，核苷
亚P
酸3’上的氢被
亚磷酰胺取代形
成核苷亚磷酰胺
2.引物是如何合成的 ．生物 帮．2019-04-01[引用日期2019-0123]
3.《环球科学》杂志：组装生命的生 物工厂
Thank you!
谢谢！
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特点：
具有高效、快速的偶联以及 起始反应物比较稳定的特点。
详细步骤：
第一步：将预先连接在固相载体
CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三 氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基 团DMT，获得游离的5'-羟基。（DMT： 二甲氧基三苯甲基）
DTMHP
将核苷酸 固定在载 体上
A 在团5在脱羟‘某被三去基端反D氯D的MM应T乙T羟取产下酸基代生，作以游磷用保离酸下护的基，
学院院士。
原理：
将核苷3'固定在固相载体（如CPG，可控微 孔玻璃珠）上,并在5'上连接一个保护基团DMT,使 合成的方向由待合成引物的3'端向5'端合成的。
相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
每个循环过程中都经过高效率且化学 性质活泼的核苷酸3′-亚磷酸酰胺中间体， 其氧化后成为稳定的五价磷酸三酯。
活化中间体
PDM
T
A
P 之后产生的
核苷亚磷酸酰
H亚P
A
胺活化中间体
3’端的亚磷酸
基团与第一步
制好的固相载
体的5’端活化
CPG
的羟基缩合
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第三步，带帽(capping)反应，
缩合反应中可能有极少数5'-羟 基没有参加反应(少于2%)，用 乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继 续发生反应，这种短片段可以在 纯化时分离掉。
发明者： Marvin H. Caruthers
背景：
（马文·H·卡拉瑟斯）
美国国家科学院院士，美国
科罗拉多大学化学及生物化
学系教授。
1968年，在西北大学获得博
士学位。现主要从事核酸化
ห้องสมุดไป่ตู้
学和生物化学，利用DNA自身
的化学性质，研发出一种单
链DNA合成法。
1987年，发明“固相亚磷酰
胺法”。
1994年，被授予美国国家科