固相亚磷酰胺法——简易讲解模板 共18页
引物的合成原理
1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种,主要都是由ABI/PE公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman1000M和PE8909DNA 合成仪，引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC,PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
亚磷酰胺单体合成路线
亚磷酰胺单体合成路线
亚磷酰胺是一种重要的化学品，广泛应用于化工、医药、农业等领域。
其单体合成路线主要有以下几种：
1. 氨基膦酸酯法：以氨基膦酸酯为原料，经过加热反应生成亚磷酰胺单体。
该方法简单易行，但是反应条件较为苛刻，产率较低。
2. 氨基膦酸酐法：以氨基膦酸酐为原料，通过加热反应生成亚磷酰胺单体。
该方法反应条件较为温和，产率较高，但是原料价格较高。
3. 氨基膦酸法：以氨基膦酸为原料，通过加热反应生成亚磷酰胺单体。
该方法反应条件较为温和，产率较高，但是需要使用催化剂。
4. 氨基氰化物法：以氨基氰化物为原料，经过加热反应生成亚磷酰胺单体。
该方法反应条件简单，但是产物纯度较低。
总的来说，亚磷酰胺单体的合成路线有多种选择，不同的方法有其优缺点，需要根据具体情况选择合适的方法。
DNA合成原理及操作
3. 氨解脱保护 合成完毕后取出载体进行切割并且脱保护。
一般40bp以内至少需要2小时，链越长需要 时间越长。
4. 纯化: 目前惯用的纯化方式主要有4种： OPC纯
化、 PAGE 纯化、脱盐纯化、 HPLC纯化
4.1 OPC纯化
利用OPC柱芯对DMT寡核苷酸特殊的亲和 力，将不带DMT的短片段用低浓度的有机溶剂洗 脱，吸附在柱芯里的DNA用酸除去DMT后用1ml 的20%乙腈洗脱。
缺点：不能批次生产，比较费时，有时样品接 收不好也不能有效分离。
5. 样品定量分装 样品纯化后洗脱在1ml的20%乙腈溶液
里，260紫外波长下测值，根据客户要求分 装，一般所有合成公司基本都会按1.2-1.5 倍放大给量。分装的样品干燥，经PAGE抽 样检测合格后交给市场。
合成时效：批次引物（按24条计算）在24小时之内可 以出货
DNA合成作业流程
1. 接收订单安排合成
合成部根据合成实际情况合理安排订单， 依次安排加急-测序-内部-外部，同一客户尽 量同批次安排合成，部分长链、G含量高、 合成量大的引物比较难合成，时间上可能会 有所延缓
2. 上机合成
不同型号的合成仪合成通量和合成时间均 不同，公司预定的仪器批次合成96条引物， 20bp长度合成需要2-3小时。
④氧自由基伤害 细胞代谢副产物O2-、H2O2等会造成碱基损伤，产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿 嘧啶等碱基修饰物，引起碱基配对错误。
三、 碱基插入或缺失 吖啶类分子带正电呈扁平状，易于嵌入DNA碱 基平面间，导致在复制或重组过程中缺失或插 入一个碱基。 DNA聚合酶在复个碱基的缺 失或插入。聚合酶在模板链上滑动易于造成缺 失，在生长链上滑动易于造成插入。 插入或缺失会导致读码框改变。
引物篇(引物合成及各种问题总结)
引物篇1.引物是如何合成的?目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基;第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3'端被活化,5'-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些,如何选择?◆C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。
固相亚磷酰胺法——简易讲解模板共19页文档
2.引物是如何合成的 ．生物 帮．2019-04-01[引用日期2019-0123]
3.《环球科学》杂志：组装生命的生 物工厂
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谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
特点：
具有高效、快速的偶联以及 起始反应物比较稳定的特点。
详细步骤：
第一步：将预先连接在固相载体
CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三 氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基 团DMT，获得游离的5'-羟基。（DMT： 二甲氧基三苯甲基）
DTMHP
将核苷酸 固定在载 体上
A 在团5在脱羟‘某被三去基端反D氯D的MM应T乙T羟取产下酸基代生，作以游磷用保离酸下护的基，
DMT，重复以上步骤，
直到所有要求合成的碱
基被接上去。
1
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下
来，通过OPC,page等手段纯化引物，成品引物用
C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，
测定OD260定量，根据定单要求分装。
3
参考资料
1.亚磷酰胺法 ．全国科学技术名词审 定委员会[引用日期2019-01-23]
13、遵守纪律的风气的培养，只有领 导者本 身在这 方面以 身作则 才能收 到成效 。—— 马卡连 柯 14、劳动者的组织性、纪律性、坚毅 精神以 及同全 世界劳 动者的 团结一 致，是 取得最 后胜利 的保证 。—— 列宁 摘自名言网
DNA合成仪
N1 HO
O
乙酸酐和N-甲基咪唑
CPG
O C H 3C O N1
O
CPG
5.氧化：连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（磷为三 价）与CPG上相连的寡核苷酸链连接，此亚磷酯键不稳定， 易被酸、碱水解，因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。常 用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。此步反应速度亦很快。应 注意最后一个循环时，氧化步骤不可省略。此外亦可用其他 氧化剂来完成氧化，从而得到各种符合实验需要的寡核苷酸。 Oxidiser (0.1M) (ABI) 0.1M Iodine in THF/pyridine/water
3.连接：亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸碰撞时，与其5’羟基发生亲 核反应，发生缩合并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。此步单体 相对于CPG所连核苷酸上5’-羟基过量保证了连接的高效率。 形成3’，5’－磷酸二酯键。其中，磷为3价。
N2 DMTrO
O P
CH(CH3)2 N1
N
CH(CH3)2
N2 DMTrO
O
O
P
N1 O
O
CPG
OCH2CH2CN
• 上述循环完成之后进行第二个合成循环。每经历 一轮循环，接长1个核苷酸。接长的链始终被固 定在不溶的固相载体上，过量的未反应物或分解 物则通过过滤或洗涤除去。
• 6.切离，脱保护：当整个链达到预定的长
度后，从固相载体上切下，脱去保护基(氨解)。 一般用新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉腈乙基、 苯甲酰基、异丙基，用三氟乙酸脱5’-DMT。
1
D M T rO
O
T C A
CPG
N1 HO
O
CPG
2.活化：在缩合之前，单体与四唑混合并进 入合成柱，此时四唑提供一个质子给3’磷 酸上二异丙胺基的N原子，质子化的二异丙 胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷 酰胺四唑这种活性中间体。此步四唑过量保 证了单体活化充分。
固相亚磷酰胺法——简易讲解模板
继续发生反应，这种短片段可以
在纯化时分离掉。
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第四步：在氧化剂碘的作用
下，亚磷酰形式转变为更稳定
第一个循环结束
的磷酸三酯。
后期处理
经过以上四个步骤，一 个脱氧核苷酸被连接到
2
固相载体的核苷酸上。 再以三氯乙酸脱去它的 5'-羟基上的保护基团 DMT，重复以上步骤， 直到所有要求合成的碱
A
可以开始了
CP G
第二步：合成DNA的原料，
亚磷酰胺保护核苷酸单体，与
活化剂四氮唑混合，得到核苷
亚磷酸活化中间体，它的3'端
被活化，5'-羟基仍然被DMT保
护，与溶液中游离的5'-羟基
发生缩合反应。
DM T
P
A
核苷酸与亚磷酰 胺，和活化剂四 氮唑混合，核苷 酸3’上的氢被 亚磷酰胺取代形 成核苷亚磷酰胺 活化中间体
具有高效、快速的偶联以及
起始反应物比较稳定的特点。
详细步骤：
第一步：将预先连接在固相载体
CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三
氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基
团DMT，获得）
DM H T
将核苷酸 固定在载 体上
P
在三氯乙酸作用下， 在某反应下，磷酸基 脱去DMT产生游离的 团被DMT取代以保护 羟基 5‘端的羟基
原理：
将核苷3'固定在固相载体（如CPG，可控微
孔玻璃珠）上,并在5'上连接一个保护基团DMT,使
合成的方向由待合成引物的3'端向5'端合成的。
相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。 每个循环过程中都经过高效率且化学 性质活泼的核苷酸3′-亚磷酸酰胺中间体， 其氧化后成为稳定的五价磷酸三酯。
DNA合成及组装
微矩阵及微流控
Twist 工作流程
1. 全程自动化
2. 实现云服务，与 客户云端交流， 实时跟踪
3. 高通量（100w孔， 9600 gene）， 试剂节省，
4. 操作方便，信息 保密。
5. 开放API，支持用 户自定义编程
寡核苷酸及基因合成服务公司
公司比较
厂家
bioautomatio n
biosearchtec h
hlueheronbio.co m/
https://www.atum.bio
https://www.eurofinsgenomics .eu/
/Techpro/show-
168.html
POLYGEN biolytic twist genscript 赛百盛 通用生物
GENEWIZ Blueheron
atum eurofins
分类
设备+服务
设备+服务 设备 设备
服务平台 服务平台 服务，试剂 服务，试剂
平台 服务 服务 服务平台
扩展服务 试剂，修饰
DEL
高通量微矩阵 技术
生物全系
生物全系 生物全系
优点：高效（99.5%）、快速，精准可控 缺点：1. 内部缺陷，错误率1%。
2. 单突变。 3. 纯化损耗大, OPC与HPLC的得率约为30%～50%，PAGE的得率约为10%～30%
DNA合成仪
Dr.Oligo 96DNA/RNA核酸合成仪 K&A H-64型核酸合成仪
ABI 394合成仪
德国PolyGen公司DNA合成仪
-
工业金标准 高通量，云操作
服务全面
/
https://www.twistbioscience.c om/
d na合成操作流程
d na合成操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!DNA 合成是指在体外通过化学方法合成 DNA 分子的过程。
以下是 DNA 合成的一般操作流程：1. 设计 DNA 序列。
引物-生产及使用详解
引物-生产及使用详解（一）引物的合成和纯化1. 引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
安基生物公司采用的合成仪为最新引进的Dr.Oligo192高通量合成仪，效率高，合成量大，质量稳定。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下：第一步：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基。
第二步：合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步：带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC、PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
Oligo DNA合成原理
Oligo DNA 合成
固相亚磷酰胺三酯法是目前最常用的Oligo DNA化学合成方法，它具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。
合成步骤：
1、脱保护：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基；
2、缩合：合成DNA的原料-单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应；
3、带帽(capping)反应：缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应；
4、氧化：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯；
通过上述步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被连接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率；
5、氨解：通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来；
6、纯化：切下来的Oligo粗品根据实验目的不同选择不同的纯化手段进行纯化，OD260定量及抽干后根据定单要求对Oligo进行分装。
DNA合成原理及操作
缺点：纯化成功与否取决于粗品DNA的纯 度，合成不好的样品可能OPC纯化后也不纯，并 且随着碱基数增多，纯化效果降低；由于在纯化 过程中接触到酸，引物容易降解。
4.2 PAGE 纯化 利用DNA不同片段在胶中迁移率不同而分离，
大片段电荷多，分子大，迁移的速度慢。等目的片段 与N-片段分开后切下目的片段，80℃孵育2小时后脱 盐。
DNA通过固相亚磷酰胺三酯法合成：
溶液中的亚磷酰胺单体通过缩合反应形 成3′--5′磷酸二酯键，连接到固相载体 （CPG或树脂）上。并依次延伸，直到 序列的最后一个5′碱基连接上后合成结
束。整个合成过程仪器自动完成，每个 循环分为脱保护、活化、偶合、盖帽（ 封闭）、氧化五个步骤。
第一步：脱保护（Deblocking）:用三氯乙酸（ TCA）去除CPG所链核苷上的DMT保护基团，暴露 5′羟基，供下一步缩合。
①物理因素：电离辐射可引起其它物质产生自由基，从而引起碱基氧化修饰、过氧 化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。 ②化学因素 a. 烷化剂 硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯（MMS）等烷化剂可将烷基加到嘌呤或嘧啶的N或O上 使碱基烷基化。鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻击，形成m7G和m3A烷基化 的嘌呤碱基，导致复制时碱基错配。例如鸟嘌呤N7被烷化后会与T配对，结果会使 G-C转变成A-T。 b. 碱基类似物 5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）等。它们 的结构与碱基相似，进入细胞能替代正常的碱基参入到DNA链中而干扰DNA复制合 成。如5-BU与T结构相似，在酮式结构时与A配对；它更易成为烯醇式结构与G配 对，在DNA复制时导致A-T转换为G-C。
引物篇(引物合成及各种问题总结)
引物篇1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
(完整word版)引物纯化方式选择指南
引物纯化方式选择指南2012-2-16 10:24:14内容导读一、DNA合成的方法和原理二、引物纯化的方法原理及其效果三、纯化方法与应用指南四、常见问题的原因分析及相应的对策一、DNA合成的方法和原理目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行。
基于该方法的DNA合成仪有多种，由ABI/PE 公司生产的高通量DNA自动合成仪得到了广泛的应用。
各合成仪进行引物合成的原理基本相同，主要区别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时等。
生工公司采用的合成仪主要机型为全新的ABI3900高通量合成仪。
固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’ →3’方向延伸，而是由3’端开始，相邻的核苷酸通过3’→ 5’磷酸二酯键连接。
具体的反应步骤如图一。
1、脱保护基(Deblocking)用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。
2、活化(Activation)将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
3、连接(Coupling)亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
4、封闭(Capping)缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
引物纯化方式选择指南
引物纯化方式选择指南2012-2-16 10:24:14内容导读一、DNA合成的方法和原理二、引物纯化的方法原理及其效果三、纯化方法与应用指南四、常见问题的原因分析及相应的对策一、DNA合成的方法和原理目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行。
基于该方法的DNA合成仪有多种，由ABI/PE公司生产的高通量DNA自动合成仪得到了广泛的应用。
各合成仪进行引物合成的原理基本相同，主要区别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时等。
生工公司采用的合成仪主要机型为全新的ABI3900高通量合成仪。
固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’ →3’方向延伸，而是由3’端开始，相邻的核苷酸通过3’→ 5’磷酸二酯键连接。
具体的反应步骤如图一。
1、脱保护基(Deblocking)用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。
2、活化(Activation)将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
3、连接(Coupling)亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
4、封闭(Capping)缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
引物合成的详解
引物合成的详解.txt这是一个禁忌相继崩溃的时代，没人拦得着你，只有你自己拦着自己，你的禁忌越多成就就越少。
自卑有多种档次，最高档次的自卑表现为吹嘘自己干什么都是天才。
11月13日引物合成的详解1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。
第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
引物合成 ppt课件
以上引物纯化方式我们都可以提供
最长可以合成多长的引物？
引物越长，出现问题的概率就越大。目前能合 成的最长引物为120base的引物，但是产率很低。 除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按 照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（ 还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续 处理还有丢失很多，最后的产量是很低。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参
加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片
段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三 氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合 成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
OD值如何换算浓度？
1.OD值如何转化为物质的量（nmole)
粗略地计算：1个OD值的Oligo 的重量约为33 μg，而每 个碱基的平均分子量一般按330道尔顿进行计算。因此， 合成DNA/RNA的nmol数一般按以下公式
Nmole=（OD*33/碱基数*330）*1000=(OD*100)/碱基数
引物合成过程
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三
氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；
第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四唑混
引物篇——精选推荐
引物篇1.引物是如何合成的？⽬前引物合成基本采⽤固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司⽣产，⽆论采⽤什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的⾼低，试剂消耗量的不同和单个循环⽤时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA⽚段，具有⾼效、快速的偶联以及起始反应物⽐较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的⽅向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸⼆酯键连接。
第⼀步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯⼄酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第⼆步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发⽣缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，⽤⼄酸酐和1-甲基咪唑终⽌其后继续发⽣反应，这种短⽚段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作⽤下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，⼀个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯⼄酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜⾊判定合成效率。
通过氨⽔⾼温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等⼿段纯化引物，成品引物⽤C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物⽤⽔悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化⽅式有哪些，如何选择？◆ C18柱脱盐：有⼈称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被⽔洗脱，所以能有效地去除盐分。
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固相亚磷酰胺法
演讲：某某某 PPT: 某某某
资料查找：某某某 某某某
发明者： Marvin H. Caruthers
背景：
（马文·H·卡拉瑟斯）
美国国家科学院院士，美国
科罗拉多大学化学及生物化
学系教授。
1968年，在西北大学获得博
士学位。现主要从事核酸化
每个循环过程中都经过高效率且化学 性质活泼的核苷酸3′-亚磷酸酰胺中间体， 其氧化后成为稳定的五价磷酸三酯。
特点：
具有高效、快速的偶联以及 起始反应物比较稳定的特点。
详细步骤：
第一步：将预先连接在固相载体
CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三 氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基 团DMT，获得游离的5'-羟基。（DMT： 二甲氧基三苯甲基）
第三步，带帽(capping)反应，
缩合反应中可能有极少数5'-羟 基没有参加反应(少于2%)，用 乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继 续发生反应，这种短片段可以在 纯化时分离掉。
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第四步：在氧化剂碘的作用
下，亚磷酰形式转变为更稳定
DTMHP
将核苷酸 固定在载 体上
A 在团5在脱羟‘某被三去基端反D氯D的MM应T乙T羟取产下酸基代生，作以游磷用保离酸下护的基，
可以开始了
CP G
第二步：合成DNA的原料，
亚磷酰胺保护核苷酸单体，与 活化剂四氮唑混合，得到核苷 亚磷酸活化中间体，它的3'端 被活化，5'-羟基仍然被DMT保 护，与溶液中游离的5'-羟基 发生缩合反应。
DT MP
A
核苷酸与亚磷酰
胺，和活化剂四 氮唑混合，核苷
亚P
酸3’上的氢被
亚磷酰胺取代形
成核苷亚磷酰胺
活ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ中间体
PDM
T
A
P 之后产生的
核苷亚磷酸酰
H亚P
A
胺活化中间体
3’端的亚磷酸
基团与第一步
制好的固相载
体的5’端活化
CPG
的羟基缩合
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来，通过OPC,page等手段纯化引物，成品引物用
C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，
测定OD260定量，根据定单要求分装。
3
参考资料
1.亚磷酰胺法 ．全国科学技术名词审 定委员会[引用日期2019-01-23]
2.引物是如何合成的 ．生物 帮．2019-04-01[引用日期2019-0123]
第的一磷酸个三酯循。 环结束
后期处理
经过以上四个步骤，一
个脱氧核苷酸被连接到 固相载体的核苷酸上。 再以三氯乙酸脱去它的 5'-羟基上的保护基团
2
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合 成效率。
DMT，重复以上步骤，
直到所有要求合成的碱
基被接上去。
1
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下
3.《环球科学》杂志：组装生命的生 物工厂
Thank you!
谢谢！
18
学和生物化学，利用DNA自身
的化学性质，研发出一种单
链DNA合成法。
1987年，发明“固相亚磷酰
胺法”。
1994年，被授予美国国家科
学院院士。
原理：
将核苷3'固定在固相载体（如CPG，可控微 孔玻璃珠）上,并在5'上连接一个保护基团DMT,使 合成的方向由待合成引物的3'端向5'端合成的。
相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。