液相色谱PPT课件
合集下载
高效液相色谱分析ppt课件
• 分离极性物质，选用极性固定液，各组分按极性顺序分 离，极性小的先流出色谱柱，极性大的后流出色谱柱。
• 分离非极性和极性混合物时，一般选用极性固定液，这 时非极性组分先出峰。
• 对于形成氢键的试样，如醇、酚、胺和水等，一般选用 极性或氢键型固定液，各组分按与固定液分子间形成氢 键能力大小先后出峰。
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
2019/10/28
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
速率理论(与GC对比)
• GC: HAB/uCu(填充)柱 HAB/uCu (毛细管) 柱
A2dp Adp B2Dm2Dg BtR, BDg
DgT或Dg T
η
M
CCmCs Cg Cl Cl
df2
T
Cl Dl
DL
• HPLC: HACu
3、离子色谱装置类型 suppressed apparatus of IC
抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.01～0.05
毫摩尔/克干树脂。 非抑制型: 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.007～ 0.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸 及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接 与分离柱相连，不需抑制柱。
全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100105范围内的化合物按质量分离
• 分离非极性和极性混合物时，一般选用极性固定液，这 时非极性组分先出峰。
• 对于形成氢键的试样，如醇、酚、胺和水等，一般选用 极性或氢键型固定液，各组分按与固定液分子间形成氢 键能力大小先后出峰。
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
2019/10/28
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
速率理论(与GC对比)
• GC: HAB/uCu(填充)柱 HAB/uCu (毛细管) 柱
A2dp Adp B2Dm2Dg BtR, BDg
DgT或Dg T
η
M
CCmCs Cg Cl Cl
df2
T
Cl Dl
DL
• HPLC: HACu
3、离子色谱装置类型 suppressed apparatus of IC
抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.01～0.05
毫摩尔/克干树脂。 非抑制型: 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.007～ 0.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸 及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接 与分离柱相连，不需抑制柱。
全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100105范围内的化合物按质量分离
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
液相色谱质谱分析ppt课件
35
1. 质谱分析法 质谱分析法（Mass Spectrometry, MS）是
在高真空系统中测定样品的分子离子及碎片离 子质量，以确定样品相对分子质量及分子结构 的方法。化合物分子受到电子流冲击后，形成 的带正电荷分子离子及碎片离子，按照其质量 m和电荷z的比值m/z（质荷比）大小依次排列 而被记录下来的图谱，称为质谱。
b) 采用与标准谱库对照的方法。
由质谱数据推导有物机分子结构的过程，形象地说， 如同用弹弓击碎一个瓷花瓶，再由一堆碎片来拼凑复原花 瓶的过程。
52
实验 HLPC分离蜂胶中的黄酮类物质
• 蜂胶素被誉为“紫色黄金”，集动植物之精华, 具有复杂而独特的化学组成。富含黄酮类和萜烯 类物质。黄酮是人体必需营养成份之一，体内不 能合成，但对调节生理功能，提高生命运动质量 有重要意义。而蜂胶中含有多种黄酮类物质，因 此对蜂胶产品的开发和使用有重要的社会意义。
生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
30
2. 分配色谱（液－液分配色谱） （1）原理
根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解 度不同，因而具不同的分配系数。在色谱柱中， 随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次， 造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的 过程。
31
分离原理
K cs cm
23
色谱柱的使用和维护
1．使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有 一定的溶解度)。
2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱 柱的pH范围。
3．避免流动相组成及极性的剧烈变化。 4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理。 5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱
那么，如何辩认分子离子峰呢？
1. 质谱分析法 质谱分析法（Mass Spectrometry, MS）是
在高真空系统中测定样品的分子离子及碎片离 子质量，以确定样品相对分子质量及分子结构 的方法。化合物分子受到电子流冲击后，形成 的带正电荷分子离子及碎片离子，按照其质量 m和电荷z的比值m/z（质荷比）大小依次排列 而被记录下来的图谱，称为质谱。
b) 采用与标准谱库对照的方法。
由质谱数据推导有物机分子结构的过程，形象地说， 如同用弹弓击碎一个瓷花瓶，再由一堆碎片来拼凑复原花 瓶的过程。
52
实验 HLPC分离蜂胶中的黄酮类物质
• 蜂胶素被誉为“紫色黄金”，集动植物之精华, 具有复杂而独特的化学组成。富含黄酮类和萜烯 类物质。黄酮是人体必需营养成份之一，体内不 能合成，但对调节生理功能，提高生命运动质量 有重要意义。而蜂胶中含有多种黄酮类物质，因 此对蜂胶产品的开发和使用有重要的社会意义。
生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
30
2. 分配色谱（液－液分配色谱） （1）原理
根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解 度不同，因而具不同的分配系数。在色谱柱中， 随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次， 造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的 过程。
31
分离原理
K cs cm
23
色谱柱的使用和维护
1．使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有 一定的溶解度)。
2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱 柱的pH范围。
3．避免流动相组成及极性的剧烈变化。 4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理。 5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱
那么，如何辩认分子离子峰呢？
《液相色谱法》PPT课件
第七章 液相色谱(liquid chromatography)
§7-1 概述
（1）液相色谱简介
（2）液相色谱的发展
（3）液相色谱的分类
§7-2 液相色谱仪
（1）液相色谱仪
（2）液相色谱仪的流程图
（3）液相色谱仪的工作过程
（4）液相色谱仪的基本组成系统
（5）高压泵
精选课件ppt
1
第七章 液相色谱(liquid chromatography)
吸附色谱 吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备
分配色谱 疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备
凝胶色谱 溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定
离子交换色谱
库仑力
无机离子、有机离子分析
离子排斥色谱 Donnan膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析
离子对色谱 疏水分配作用 离子性物质分析
疏水作用色谱 疏水分配作用 蛋白质分离与纯化
手性色谱
立体效应 手性异构体分离，药物纯化
亲和色谱 生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
两种最常用的色谱法
（一）吸附色谱法（adsorption chromatography） 以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色
谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流 动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。 在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力 的不同而被分离。
（6）梯度洗脱装置 （7）进样器 （8）色谱柱 （9）色谱填料 （10）检测器 （11）数据处理系统与自动控制单元
§7-3 新型液相色谱仪简介
（1） waters的UPLC （2）岛津高效率HPLC-2010A/2010C型 （3）岛津LC-VP系列应用系统离子色谱仪
§7-1 概述
（1）液相色谱简介
（2）液相色谱的发展
（3）液相色谱的分类
§7-2 液相色谱仪
（1）液相色谱仪
（2）液相色谱仪的流程图
（3）液相色谱仪的工作过程
（4）液相色谱仪的基本组成系统
（5）高压泵
精选课件ppt
1
第七章 液相色谱(liquid chromatography)
吸附色谱 吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备
分配色谱 疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备
凝胶色谱 溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定
离子交换色谱
库仑力
无机离子、有机离子分析
离子排斥色谱 Donnan膜平衡 有机酸、氨基酸、醇、醛分析
离子对色谱 疏水分配作用 离子性物质分析
疏水作用色谱 疏水分配作用 蛋白质分离与纯化
手性色谱
立体效应 手性异构体分离，药物纯化
亲和色谱 生化特异亲和力 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
两种最常用的色谱法
（一）吸附色谱法（adsorption chromatography） 以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色
谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流 动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。 在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力 的不同而被分离。
（6）梯度洗脱装置 （7）进样器 （8）色谱柱 （9）色谱填料 （10）检测器 （11）数据处理系统与自动控制单元
§7-3 新型液相色谱仪简介
（1） waters的UPLC （2）岛津高效率HPLC-2010A/2010C型 （3）岛津LC-VP系列应用系统离子色谱仪
分析化学 液相色谱法PPT课件
• 阴离子交换反应
RN(CH3 )3+ OH- + X- == RN(CH3)3+X-+ OH-
2021年5月
32
第32页/共68页
树脂的再生
• 阳离子交换树脂用HCl溶液处理 •
• R阴离子-交S换O树3-脂M用N+aO+HH溶液+处C理l- == R - SO3-H + + M+Cl-
RN(CH
2021年5月
21
第21页/共68页
（六）操作方法
• 1.装柱 • 2.加样 • 3.洗脱
2021年5月
22
第22页/共68页
二、 液－液分配柱色谱法
• （一）分离机理 • 利用混合物中不同组分在两相溶剂中溶解性不同(分配系数不同)，当流动相携 带样品流经固定相时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取，再溶解、再萃取。 样品在色谱柱内经过无数次分配之后，而使分配系数稍有差异的组分得到分离。 • 正相色谱：流动相的极性比固定相的极性弱 • 反相色谱：流动相的极性比固定相的极性强
第十二章 液相色谱法
• 第一节 概述 • 第二节 柱色谱法 • 第三节 平面色谱法 • 思考与练习
2021年5月
1
第1页/共68页
第一节 概述
色谱法(chromatography)又称层析法，是一种依据物质的物理化学性质的不同(如溶解性、极性、离子 交换能力、分子大小等)而进行的分离分析方法。
• 一、 色谱法的产生和发展
•
原理:硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键(吸附性),组分与硅醇基形成氢键(被吸附)的能力不同而
分离。
•
应用:酸性和中性物质的分离，如有机酸、酚类、醛类.
RN(CH3 )3+ OH- + X- == RN(CH3)3+X-+ OH-
2021年5月
32
第32页/共68页
树脂的再生
• 阳离子交换树脂用HCl溶液处理 •
• R阴离子-交S换O树3-脂M用N+aO+HH溶液+处C理l- == R - SO3-H + + M+Cl-
RN(CH
2021年5月
21
第21页/共68页
（六）操作方法
• 1.装柱 • 2.加样 • 3.洗脱
2021年5月
22
第22页/共68页
二、 液－液分配柱色谱法
• （一）分离机理 • 利用混合物中不同组分在两相溶剂中溶解性不同(分配系数不同)，当流动相携 带样品流经固定相时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取，再溶解、再萃取。 样品在色谱柱内经过无数次分配之后，而使分配系数稍有差异的组分得到分离。 • 正相色谱：流动相的极性比固定相的极性弱 • 反相色谱：流动相的极性比固定相的极性强
第十二章 液相色谱法
• 第一节 概述 • 第二节 柱色谱法 • 第三节 平面色谱法 • 思考与练习
2021年5月
1
第1页/共68页
第一节 概述
色谱法(chromatography)又称层析法，是一种依据物质的物理化学性质的不同(如溶解性、极性、离子 交换能力、分子大小等)而进行的分离分析方法。
• 一、 色谱法的产生和发展
•
原理:硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键(吸附性),组分与硅醇基形成氢键(被吸附)的能力不同而
分离。
•
应用:酸性和中性物质的分离，如有机酸、酚类、醛类.
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
11
溶剂等级
水的等级
纯化水 蒸馏水 去离子水
吸 光
去离子水
率 纯化水
波长 (nm) 因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高
纯化水中去除了无机和有机的污染物
12
HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：
• 1 专门的纯水机或超纯水机； • 2 去离子水重蒸； • 3 二次或三次重蒸水； • 4 采用类似家用的纯水机； • 5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水； • 6 其它途径；
Modified Si
9
反相HPLC 色谱柱
C18 (ODS) type
C8 (octyl) type Non-polar property
C4 (butyl) type Phenyl type
-Si-C18H37
TMS type
Si
Cyano type
10
流动相
流动相选择注意事项： ▪纯度：采用“ HPLC ”级溶剂 ▪避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 ▪对试样有适宜的溶解度 ▪溶剂粘度要小 ▪与检测器相匹配 ▪流动相配制时的顺序
26
进样体积与响应值关系
检
测
器
响 应
部分注入
值
定量管体积的一半
18
进样器
▪ 自动进样器 ▪ 手动进样器
原理：（六通阀） 注入方式：
1）全量注入 2）部分注入
返回
19
HPLC六通阀进样器的使用及保养
• 六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是 由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne 公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以 此产品作为仪器的进样器。
24
• 可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精 确计算定量环的体积，譬如，一根名义上10μl的定量环， 实际是9μl还是1lμl并不重要，因为被测样品和校正样 品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。
25
• 进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样 品溶液均要用0．45μm的滤膜过滤。防止微粒阻塞进 样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留 物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常 用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样 阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注 射器针头的外侧。
20
手动进样器的原理图
装填状态
进样状态 返回
21
• 虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、 日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使 用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用 得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需 维修。
22
• 手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路， 流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上 引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在 HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平 头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧， 密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止 了针头刺坏密封组件及定子。
检测器 数据处理
4
•
5
6
第二节 基本理论 一、色谱分离过程 （一）液-固吸附色谱
流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸 附作用的不同来分离物质。
7
（二）液-液分配色谱
流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液 色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间 的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一 种是涂渍于载体上的固定相。
HPLC的环境设置：
• HPLC的日常操作条件：温度：10～30℃；相对湿 度<80％； 最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、 高振动设备，有良好的通风设施。
• 现在检测糖组分的液相要求检测器的温度是35℃.
2
一、色谱起源
石油醚
色素
碳酸钙颗粒
色谱
组分
3
液相色谱流程图
进样器 输液泵 溶剂
色谱柱 柱温箱
13
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高 放置时间越短。
• 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过 0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气 等。
14
溶剂前处理
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使 用无机盐配制的缓冲液。
17
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜： 适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质 和其相关样品。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸,70%乙醇、 二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜： 具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。
15
溶剂前处理
脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小 气泡对测定的影响：
1）柱压波动，流量偏小 2）基线波动
16
样品过滤头的类型：
30mm内径： 适用于大进样量的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格,材料有 纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50µl。 13mm内径： 适用于范围广的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格,材料为纤 维素。 3mm内径： 适用于小进样量的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格。处理 样品体积为7µl。
流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相 分配色谱法
流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相 分配色谱法
8
正相HPLC 色谱柱
硅胶型 氰基型 氨基型 糖类分析 二醇基型 蛋白质分析
Si Silica gel
-Si-CH2CH2CH2CN
H2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
23
• 六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两 种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积 的75％，如20μl的定量环最多进样15μl的样品，并且要 求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时， 进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环最 少进样60至100μl的样品，这样才能完全置换样品定量 环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐 采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。
溶剂等级
水的等级
纯化水 蒸馏水 去离子水
吸 光
去离子水
率 纯化水
波长 (nm) 因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高
纯化水中去除了无机和有机的污染物
12
HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：
• 1 专门的纯水机或超纯水机； • 2 去离子水重蒸； • 3 二次或三次重蒸水； • 4 采用类似家用的纯水机； • 5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水； • 6 其它途径；
Modified Si
9
反相HPLC 色谱柱
C18 (ODS) type
C8 (octyl) type Non-polar property
C4 (butyl) type Phenyl type
-Si-C18H37
TMS type
Si
Cyano type
10
流动相
流动相选择注意事项： ▪纯度：采用“ HPLC ”级溶剂 ▪避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 ▪对试样有适宜的溶解度 ▪溶剂粘度要小 ▪与检测器相匹配 ▪流动相配制时的顺序
26
进样体积与响应值关系
检
测
器
响 应
部分注入
值
定量管体积的一半
18
进样器
▪ 自动进样器 ▪ 手动进样器
原理：（六通阀） 注入方式：
1）全量注入 2）部分注入
返回
19
HPLC六通阀进样器的使用及保养
• 六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是 由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne 公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以 此产品作为仪器的进样器。
24
• 可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精 确计算定量环的体积，譬如，一根名义上10μl的定量环， 实际是9μl还是1lμl并不重要，因为被测样品和校正样 品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。
25
• 进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样 品溶液均要用0．45μm的滤膜过滤。防止微粒阻塞进 样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留 物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常 用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样 阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注 射器针头的外侧。
20
手动进样器的原理图
装填状态
进样状态 返回
21
• 虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、 日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使 用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用 得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需 维修。
22
• 手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路， 流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上 引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在 HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平 头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧， 密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止 了针头刺坏密封组件及定子。
检测器 数据处理
4
•
5
6
第二节 基本理论 一、色谱分离过程 （一）液-固吸附色谱
流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸 附作用的不同来分离物质。
7
（二）液-液分配色谱
流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液 色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间 的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一 种是涂渍于载体上的固定相。
HPLC的环境设置：
• HPLC的日常操作条件：温度：10～30℃；相对湿 度<80％； 最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、 高振动设备，有良好的通风设施。
• 现在检测糖组分的液相要求检测器的温度是35℃.
2
一、色谱起源
石油醚
色素
碳酸钙颗粒
色谱
组分
3
液相色谱流程图
进样器 输液泵 溶剂
色谱柱 柱温箱
13
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高 放置时间越短。
• 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过 0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气 等。
14
溶剂前处理
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使 用无机盐配制的缓冲液。
17
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜： 适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜： 不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质 和其相关样品。 尼龙66滤膜： 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸,70%乙醇、 二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜： 具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。
15
溶剂前处理
脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小 气泡对测定的影响：
1）柱压波动，流量偏小 2）基线波动
16
样品过滤头的类型：
30mm内径： 适用于大进样量的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格,材料有 纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50µl。 13mm内径： 适用于范围广的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格,材料为纤 维素。 3mm内径： 适用于小进样量的过滤，由0.22µm和0.45µm两种规格。处理 样品体积为7µl。
流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相 分配色谱法
流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相 分配色谱法
8
正相HPLC 色谱柱
硅胶型 氰基型 氨基型 糖类分析 二醇基型 蛋白质分析
Si Silica gel
-Si-CH2CH2CH2CN
H2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
23
• 六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两 种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积 的75％，如20μl的定量环最多进样15μl的样品，并且要 求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时， 进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环最 少进样60至100μl的样品，这样才能完全置换样品定量 环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐 采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。