流式细胞仪的原理和用途

流式细胞仪(FloｗCytometｒｙ)1 流式细胞仪得概念及其发展历史1。

1 流式细胞仪得基本概念流式细胞仪（flｏw cｙtｏnleｔｒy,FＣM)就是对高速直线流动得细胞或生物微粒进行快速定量测定与分析得仪器，主要包括样品得液流技术、细胞得计数与分选技术,计算机对数据得采集与分析技术等。

流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，就是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学与计算机等学科知识综合运用得结晶。

流式细胞术就是一种自动分析与分选细胞或亚细胞得技术。

其特点就是:测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量,即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性得多参数测量,且在统计学上有效。

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2 流式细胞仪得发展简史最早得流式细胞仪雏形诞生于19３４年，Moｌｄavan提出使悬浮得单个血红细胞流过玻璃毛细管,在亮视野下用显微镜进行计数,并用光电记录装置测量得设想。

1953年Crosｌand-Tayｌor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。

其后又经过Ｃｏulteｒ、Parｋer ＆ Hoｒst、Kａmentsky、Ｇohde、Fulｗyｌeｒ、Herｚｅｎberｇ等人得不断改进,设计了光电检测设备与细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪得物理连接及多参数数据得记录与分析、开创了细胞得免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上得应用。

近２0年来,随着流式细胞仪及其检测技术得日臻完善,人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面得工作,以扩大FＣＭ得应用领域与使用效果。

宋平根得《流式细胞术得原理与应用》就是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述得最为详尽与透彻得中文著作.这本书非常详细地介绍了流式细胞术得历史、结构、原理、技术指标等,例举了其在医学与生物工程中得应用,非常适合从事此方面专业研究得人。

由于这本书就是13年前出版得，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。

此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识得人士来说,这本书太复杂太深奥。

谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中得应用。

杨蕊概括了流式细胞仪得工作原理,简单提及了流式细胞仪得应用。

本文在分析这三篇论著或文章得优缺点后，用比较通俗得语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解得一些原理,并对目前市场上得主流型号进行了客观得性能概括。

2 流式细胞仪得工作原理与技术指标2。

1 流式细胞仪工作原理除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室与液流系统:激光源与光学系统;光电管与检测系统;计算机与分析系统,其中流动室就是仪器得核心部件。

这四大部件共同完成了信号得产生、转换与传输得任务.流动室与液流系统流动室由样品管、鞘液管与喷嘴等组成,常用光学玻璃、石英等透明、稳定得材料制作。

设计与制作均很精细,就是液流系统得心脏。

样品管贮放样品,单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。

为了保证液流就是稳液,一般限制液流速度υ<１0m/ｓ。

由于鞘液得作用,被检测细胞被限制在液流得轴线上.流动室上装有压电晶体,受到振荡信号可发生振动.激光源与光学系统经特异荧光染色得细胞需要合适得光源照射激发才能发出荧光供收集检测.常用得光源有弧光灯与激光;激光器又以氩离子激光器为普遍,也有配与氪离子激光器或染料激光器。

光源得选择主要根据被激发物质得激发光谱而定。

汞灯就是最常用得弧光灯,其发射光谱大部分集中于３00～４0０nm,很适合需要用紫外光激发得场合。

氩离子激光器得发射光谱中,绿光5１4ｎｍ与蓝光488ｎm得谱线最强,约占总光强得80％;氪离子激光器光谱多集中在可见光部分,以64７ｎｍ较强.免疫学上使用得一些荧光染料激发光波长在550ｎm以上,可使用染料激光器。

将有机染料做为激光器泵浦得一种成份，可使原激光器得光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。

例如用氩离子激光器得绿光泵浦含有Rhoｄaｍiｎe6Ｇ水溶液得染料激光器,则可得到５5０~65０nm连续可调得激光,尤在59０nm处转换效率最高，约可占到一半。

为使细胞得到均匀照射,并提高分辨率,照射到细胞上得激光光斑直径应与细胞直径相近。

因此需将激光光束经透镜会聚.光斑直径ｄ可由下式确定:d=4λf/πD。

λ为激光波长；f为透镜焦距；D为激光束直径。

色散棱镜用来选择激光得波长，调整反射镜得角度使调谐到所需要得波长λ。

为了进一步使检测得发射荧光更强,并提高荧光讯号得信噪比,在光路中还使用了多种滤片。

带阻或带通滤片就是有选择性地使某一滤长区段得光线滤除或通过。

例如使用52５nm带通滤片只允许FＩTC（Fｌuoresceiｎisｏｔhｉocyanaｔe,异硫氰荧光素）发射得5２5ｎm绿光通过.长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上得光线通过而将此波长以下得另一特定波长得光线反射.在免疫分析中常要同时探测两种以上得波长得荧光信号,就采用二向色性反射镜,或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。

光电管与检测系统经荧光染色得细胞受合适得光激发后所产生得荧光就是通过光电转换器转变成电信号而进行测量得。

光电倍增管(PMＴ)最为常用。

PMT得响应时间短,仅为ns数量级；光谱响应特性好，在２00～90０nm得光谱区,光量子产额都比较高。

光电倍增管得增益从10到1０可连续调节，因此对弱光测量十分有利。

光电管运行时特别要注意稳定性问题,工作电压要十分稳定，工作电流及功率不能太大。

一般功耗低于0、5W；最大阳极电流在几个毫安。

此外要注意对光电管进行暗适应处理,并注意良好得磁屏蔽。

在使用中还要注意安装位置不同得ＰMT，因为光谱响应特性不同，不宜互换．也有用硅光电二极管得，它在强光下稳定性比PMT好。

从ＰMT输出得电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。

流式细胞计中一般备有两类放大器。

一类就是输出信号辐度与输入信号成线性关系,称为线性放大器。

线性放大器适用于在较小范围内变化得信号以及代表生物学线性过程得信号,例DNA测量等。

另一类就是对数放大器，输出信号与输入信号之间成常用对数关系.在免疫学测量中常使用对数放大器.因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性与强阳性三个亚群,它们得荧光强度相差1~2个数量级;而且在多色免疫荧光测量中,用对数放大器采集数据易于解释。

此外还有调节便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点。

计算机与分析系统经放大后得电信号被送往计算机分析器。

多道得道数就是与电信号得脉冲高度相对应得，也就是与光信号得强弱相关得。

对应道数年纵坐标通常代表发出该信号得细胞相对数目。

多道分析器出来得信号再经模－数转换器输往微机处理器编成数据文件,或存贮于计算机得硬盘与软盘上,或存于仪器内以备调用。

计算机得存贮容量较大，可存贮同一细胞得６～8个参数。

存贮于计算机内得数据可以在实测后脱机重现，进行数据处理与分析,最后给出结果。

除上述四个主要部分外,还备有电源及压缩气体等附加装置.2．1.1 信号得产生、转换与传输在压力作用下,鞘液管中得鞘液被持续不断地压入流动室,形成一股稳定地连续得液流，保证了样本液稳定地处于鞘液液流得轴线上,并以单个细胞形式直线通过激光照射区.激光照射区又称测量区，就是指液流与激光束垂直相交得点。

当细胞携带荧光素标记物(每种物质携带得标记物不同吗？)通过激光照射区时，产生代表细胞内部不同物质、不同波长得荧光信号,这些信号以细胞为中心，向空间３60°立体角发射,产生散射光与荧光信号。

散射光不依赖任何细胞样品得制备技术，因此被称为细胞得物理参数或固有参数。

散射光又包括前向角散射与测向角散射。

前向角散射与被测细胞直径得平方密切相关,测向角散射光对细胞膜、胞质、核膜得折射率更敏感,可提供有关细胞内精细结构与颗粒性质得信息。

荧光信号也有二种；一种就是细胞自身在激光照射下发出得微弱荧光信号，另一种就是经过特异荧光素标记后得细胞受激发照射后得到得荧光信号。

在免疫分析中常要同时探测两种以上波长得荧光信号,就采用二向色性反射镜,或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开．经荧光染色得细胞受到适合得光激发后产生得荧光就是通过光电转换器转变成电信号而进行测量得。

最常用得光电转换器就是光电倍增管(PMT)。

从ＰMT输出得电信号需要经过放大后才能输入分析仪器。

流式细胞仪中一般备有两类放大器.一类就是线性放大器,其输出信号与输入信号成线性关系。

线性放大器适用于在较小范围内变化得信号以及代表生物学线性过程得信号,如DNA测量等。

另一类就是对数放大器，其输出信号与输入信号之间成常用对数关系。

在免疫学测量中常使用对数放大器。

放大后得电信号被传送到计算机,再经模一数转换器传输到微机处理器形成数据文件，保存在计算机上。

保存在计算机上得数据可在脱机后再进行数据处理与分析。

参数（例如:细胞得大小、形态、质膜与细胞内部结构)测量原理流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。

测量就是在测量区进行得，所谓测量区就就是照射激光束与喷出喷孔得液流束垂直相交点。

液流中央得单个细胞通过测量区时,受到激光照射会向立体角为２π(３6０°）得整个空间散射光线,散射光得波长与入射光得波长相同。

散射光得强度及其空间分布与细胞得大小、形态、质膜与细胞内部结构密切相关,因为这些生物学参数又与细胞对光线得反射、折射等光学特性有关.未遭受任何损坏得细胞对光线都具有特征性得散射,因此可利用不同得散射光信号对不经染色活细胞进行分析与分选。

经过固定得与染色处理得细胞由于光学性质得改变,其散射光信号当然不同于活细胞。

散射光不仅与作为散射中心得细胞得参数相关,还跟散射角、及收集散射光线得立体角等非生物因素有关。

在流式细胞术测量中,常用得就是两种散射方向得散射光测量:①前向角(即０角)散射（FSC);②侧向散射（SSC），又称90角散射。

这时所说得角度指得就是激光束照射方向与收集散射光信号得光电倍增管轴向方向之间大致所成得角度.一般说来，前向角散射光得强度与细胞得大小有关,对同种细胞群体随着细胞截面积得增大而增大;对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上与截面积大小成线性关系;对于形状复杂具有取向性得细胞则可能差异很大,尤其需要注意.侧向散射光得测量主要用来获取有关细胞内部精细结构得颗粒性质得有关信息。

侧向散射光虽然也与细胞得形状与大小有关,但它对细胞膜、胞质、核膜得折射率更为敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。

在实际使用中,仪器首先要对光散射信号进行测量。

当光散射分析与荧光探针联合使用时,可鉴别出样品中被染色与未被染色细胞。

光散射测量最有效得用途就是从非均一得群体中鉴别出某些亚群.荧光信号主要包括两部分:①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部得荧光分子经光照射后所发出得荧光；②特征荧光,即由细胞经染色结合上得荧光染料受光照而发出得荧光,其荧光强度较弱,波长也与照射激光不同。