细菌内毒素检查法操作规程
细菌内毒素检查操作程序
细菌内毒素检查操作程序1 概述：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/mL的灭菌注射用水。
2 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理检测的方法。
2.1 材料准备2.1.1 0.1ml/支规格及灵敏度的鲎试剂，细菌内毒素检查用水以及细菌内毒素国家标准品或工作标准品。
2.1.2 恒温器、旋涡混合器、试管架、计时器、剪刀、封口胶布、砂轮片、酒精棉球、酒精灯、灭菌的1ml玻璃注射器、烘箱。
2.2 实验操作2.2.1 接通恒温器电源，将温度调节至37℃±1℃。
2.2.2供试品稀释2.2.2.1 当供试品需要控制的内毒素限值大于鲎试剂灵敏度时，需要对供试品进行稀释，计算公式如下：MVD＝L/λMVD：供试品的最大有效稀释倍数L：供试品需控制的内毒素限值（EU/mL）λ：鲎试剂灵敏度值（EU/mL）2.2.2.2[举例]某供试品需要控制的内毒素限值为5EU/ml，使用灵敏度λ＝0.25EU/mL 的鲎试剂作细菌内毒素检查.MVD＝5EU/ml / 0.25EU/mL＝20倍。
即供试品需作1:20稀释后再作检查。
若检查结果为阳性，表明供试品内毒素含量≥5EU/ml，超过限值；若检查结果为阴性，表现供试品内毒素含量＜5EU/ml，低于限值。
2.3 检查操作2.3.1供试品溶液制备：取0.2g糖粉，加入2ml检查用水稀释，混匀，备用。
2.3.2 取0.1ml/支规格的鲎试剂8支，折断（或割断）安瓿颈，其中2支作为供试品管，2支作为阴性对照管，2支作为阳性对照管。
2支供试品阳性管。
2.3.3 阴性对照管加入0.2ml水，其余各管加入0.1ml水复溶；供试品管各加入0.1ml 供试品溶液，阳性对照管加入0.1ml2.0λ浓度的内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml供试品阳性对照溶液[用被测供试品溶液将同一支细菌内毒素工作标准品制成2.0λ浓度的同毒素溶液。
细菌内毒素检查法标准操作规程
细菌内毒素检查法标准操作规程目的：建立细菌内毒素检查的基本操作，为细菌内毒素检查人员提供正确的操作规程。
2.依据：《中华人民共和国药典》2000年版二部。
3.范围：本标准适用于细菌内毒素检查的操作。
4.职责：QC细菌内毒素检查人员对本标准的实施负责。
5.程序：5.1. 定义：5.1.1.细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
5.1.2.细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌精制得到的内毒素，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
5.1.3.细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其重量相当效价，每1ng工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU。
细菌内毒素工作标准品用于试验中鲎试剂灵敏度复核干扰试验及设置的各种对照。
5.1.4.细菌内毒素检查用水：系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
5.2. 实验设备：电热干燥箱（50~300±1）℃、电热恒温水温箱。
实验用具：注射器(精度0.02ml)、针头、试管架、白胶布、砂轮、75%酒精棉球、金属直镊、注射器盒、时钟。
试剂：鲎试剂（其标示值用λ表示）、内毒素工作标准品、内毒素检查用水。
5.3. 用具除热原：试验中所用的试管、注射器、针头、金属直镊等冲洗干净，置电热干燥箱中（注射器、针头、金属直镊等放入注射器盒中封好，再放入干燥箱中），经250℃加热30分钟，除去热原。
5.4. 检查法：5.4.1.打开洁净工作台的风机及照明开关，并用75%酒精棉球擦拭台面，打开恒温水温箱的开关，使水温恒定在（37±1）℃。
5.4.2.用75%酒精棉球擦手消毒。
5.4.3.内毒素阳性对照溶液的制备：5.4.3.1. 取内毒素工作标准品1支，用75%酒精棉球消毒瓶颈，用砂轮割开瓶颈。
细菌内毒素检查操作规程
细菌内毒素检查操作规程1. 目的规范细菌内毒素检查操作2. 范围细菌内毒素检查操作3. 责任人检验员4.依据标准：中国药典2010年版二部附录XII E原理鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应机理，判断供试品中细菌内毒素限量是否符合规定。
5.内容5.1 设备：超净工作台电热干燥箱恒温水浴锅电热蒸汽灭菌器5.2.试剂，标准品，玻璃仪器细菌内毒素工作标准品：灵敏度和阳性对照鲎试剂（0.5EU/ml）无热原水玻璃注射针（1ml）、（20ml）具塞玻璃管20ml5.3.准备所有器具除热原玻璃器皿180℃干热2小时或121℃蒸汽灭菌30分钟后干燥无热原水灭菌注射用水或内毒素检查用水5.4 试验5.4.1.供试品数量：同一批号至少3个单位供试品供试液制备：取注射器抽取5 mL无热原浸提介质，连接于留置针连接座上，注入留置针内腔至导管末端，一起置于37℃恒温箱中浸提1小时。
将注射器中剩余浸提介质推注流过留置针内腔，收集全部浸提液进行试验，注入浸提介质不超过5mL。
5.4.2.供试品检查：将鲎试剂和细菌内毒素工作标准品分别按标示量加入无热原水溶解。
细菌内毒素工作标准品逐次稀释至0.5EU/ml，为阳性对照。
取10mm×75mm试管7支，2支加入0.1ml供试液,2支管加入0.1ml无热原水为阴性对照管，2支管加入0.1ml细菌内毒素工作标准品为阳性对照管，2支管加入0.1ml细菌内毒素工作标准品与0.1ml供试液为阳性干扰对照管再逐一加入0.1ml鲎试剂溶解液。
轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入37±1℃恒温水浴中保温60±2分钟，轻轻取出，观察结果。
5.4.4.结果判定：将试管缓慢倒转180℃，管内容物坚实凝胶者为阳性，记录为（+），不呈凝胶状和虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（-）。
阳性对照管与阳性干扰对照管应为（+），阴性对照管应为（-），否则试验无效。
供试品管均为（-），判定产品符合规定。
09T-I660-01细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程
09T-I660-01细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程——————————文件类别：技术标准 1/101.目的：建立细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程，并按规程进行检验，保证检验操作规范化。
2.依据：2.1.《中华人民共和国药典》2010年版一部。
3.范围：适用于所有用细菌内毒素检查法(一部)测定的供试品。
4.责任：检验员、质量控制科主任、质量管理部经理对本规程负责。
5.正文：5.1. 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
5.1.1. 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。
5.1.2. 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
5.1.3. 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成。
用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
5.1.4. 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
5.1.5. 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
5.1.6. 试验所用器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
5.2. 供试品溶液的制备：某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。
细菌内毒素检测标准操作
细菌内毒素检测标准操作细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量。
范围：适用于所有从治疗中心发放的细胞（包括CIK、DC、干细胞等）内毒素限量检测。
责任人：质量检测人员材料：一、电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能达到180℃。
二、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。
三、水银温度计，精度在1℃以下，量程不小于50℃。
四、旋涡混合器。
五、可调式移液器六、0.25EU/ml鲎试剂。
七、细菌内毒素工作品。
八、凝胶法细菌内毒素检查用水。
九、实验用具无热原吸头（1000μl、200μl）、带铝盖的凝集管（10mm×75mm）、试管架、计时器、75%酒精棉球、封口膜、剪刀、镊子、砂轮。
所用玻璃器皿使用前须经250℃干烤至少1小时或180℃干烤至少4小时。
操作方法一、取样1、细胞发放前3天，取细胞培养液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放（可存放多长时间）。
2、细胞发放当天，取细胞生理盐水混悬液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放。
（可存放多长时间）。
3、取样应以无菌操作技术取样，所用器材在使用前应无热原或已去除热原。
二、鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的是考察鲎试剂的灵敏度是否正确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。
在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。
（一）实验操作1、细菌内毒素工作品溶液的制备取细菌内毒素工作品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。
按照工作品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。
然后用倍倍稀释方式进行稀释，即0.5ml各浓度工作品溶液+0.5ml检查用水（以下稀释方式同此法），制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
细菌内毒素检测标准操作
细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量。
范围：适用于所有从治疗中心发放的细胞（包括CIK、DC、干细胞等）内毒素限量检测。
责任人：质量检测人员材料：一、电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能达到180℃。
二、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。
三、水银温度计，精度在1℃以下，量程不小于50℃。
四、旋涡混合器。
五、可调式移液器六、0.25EU/ml鲎试剂。
七、细菌内毒素工作品。
八、凝胶法细菌内毒素检查用水。
九、实验用具无热原吸头（1000μl、200μl）、带铝盖的凝集管（10mm×75mm）、试管架、计时器、75%酒精棉球、封口膜、剪刀、镊子、砂轮。
所用玻璃器皿使用前须经250℃干烤至少1小时或180℃干烤至少4小时。
操作方法一、取样1、细胞发放前3天，取细胞培养液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放（可存放多长时间）。
2、细胞发放当天，取细胞生理盐水混悬液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放。
（可存放多长时间）。
3、取样应以无菌操作技术取样，所用器材在使用前应无热原或已去除热原。
二、鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的是考察鲎试剂的灵敏度是否正确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。
在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。
（一）实验操作1、细菌内毒素工作品溶液的制备取细菌内毒素工作品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。
按照工作品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。
然后用倍倍稀释方式进行稀释，即0.5ml各浓度工作品溶液+0.5ml检查用水（以下稀释方式同此法），制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
中国药品检验标准操作规程2019版细菌内毒素检查法word精品文档29页
细菌内毒素检查法1 简述1.1 本规范适用于《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。
后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
1.2 供试品细菌内毒素限值的确定1.2.1 药典中或国家标准有规定的，按供试品各论中规定限值；1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L＝K∕M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U等表示。
K为按规定的给药途径，人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(kg·h) 表示。
其中注射剂，K＝5EU／(kg·h)；放射性药品注射剂，K＝2.5EU ／(kg·h)；鞘内用药品，K＝0.2EU／(kg·h)。
M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml／(kg·h)、mg／(kg·h)、U／(kg·h) 等表示。
药品人用最大剂量可依据药品使用说明书或参阅《临床用药须知》，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1h的按1h计。
若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量［即M：（最大给药剂量／(m２·h)×1.62m２）／60kg］。
1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算：MVD＝C·L／λL为供试品的细菌内毒素限值，当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L 的单位以EU／mg或EU／u表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／ml 或U／ml。
λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。
供试品如为无菌粉末或原料药，供试品最小有效稀释浓度（MVC）按下式计算：MVC＝λ／L。
sop细菌内毒素检查操作规程
1 目的规范操作人员检查细菌内毒素的方法，确保检验数据的准确性。
2 范围适用于本厂质监科化验室对注射用水的细菌内毒素检验。
3 责任化验员有责任按本操作规程进行正确操作，并对检验结果负责。
4 内容本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
4.1仪器、用具4.1.1旋涡混合器、注射器（2.0ml、1.0ml）、注射针（6号、9号）、保鲜纸、试管（10×75 mm）、镊子（金属）、金属盒。
4.1.2用具除去外源性内毒素：将用具放入金属盒，在250℃干烤30分钟或180℃干烤120分钟。
4.2试剂4.2.1细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
4.2.2细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价应不小于2EU，不大于50EU。
4.2.3细菌内毒素检查用水：系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37℃±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
4.2.4鲎试剂：0.1ml/支（λ=0.5EU/ml）。
4.3鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度的标示值（λ，此处λ=0.5EU/ml）,将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混合15分钟，然后制备成合适的稀释浓度，1EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度管均为阳性，最低浓度管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度的测定值λc。
λc=lg-1(∑X/4)式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。
反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。
细菌内毒素检查操作规程
*******制药有限责任公司目的：建立一个规范的细菌内毒素检查操作规程。
范围：本规程适用于细菌内毒素检查。
职责：生物检测人员对本规程实施负责。
内容：1 准备工作1.1 设备用具的洗涤及除热原1.1.1 设备与用具刻度吸管(1、2、5、10ml)、10mm³75mm试管、试管架、不锈钢盒(或铝饭盒)、不锈钢筒(或铝筒)、洗耳球、电热干燥箱、恒温水浴箱、定时钟、电冰箱、旋涡混合器。
1.1.2 洗涤及除热原所用的玻璃器皿，先用自来水冲洗，再浸泡在洗液中过夜，取出后用自来水冲洗至pH中性，再用注射用水冲洗三次。
将刻度吸管放入金属筒内，试管、小瓶等放入金属盒内，于250℃干烤至少60分钟，也可采用其其它确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
1.2 试剂与标准品1.2.1 内毒素检查用水(即无热原水)，为内毒素含量不超过0.015Eu/mL的灭菌注射用水。
1.2.2 75%酒精棉。
1.2.3 细菌内毒素工作标准品，系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
由中国药品生物制品检定所标定和供应。
1.2.4 供试品溶液的制备：某些供试品需进行复溶，稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的pH值在6.0—8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家的推荐的适宜的缓冲液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定：药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中：L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg²h)表示，注射剂K=5EU/(kg²h)，放射性药品注射剂K=2.5EU/( kg²h)，鞘内用注射剂K=0.2EU/( kg²h)；M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg²h)、mg/( kg²h)或U( kg²h)表示，人均体重按60Kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。
细菌内毒素检验SOP
干扰试验
表1凝胶法干扰实验溶液的制备
编号
配制内毒素的溶液浓度
稀释用液
当Ea在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5 Ea～2Ea（包括0.5 Ea和2Ea）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对实验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺或环境中发生了任何有可能影响实验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
一般要求供试液的PH值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需要调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸，碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜缓冲液调节PH值。酸或碱溶液必须用细菌内毒素检查用水在已除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经验证不含内毒素和干扰因子。
检测
辅助材料
鲎试剂标准品检查用水9g/L的氯化钠溶液
细菌内毒素检验
审核
日期
批准
日期
序号
作业内容及作业要项
参考图
检验方法：凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验：在本检查规定的条件下，使鲎试剂生产凝集内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或实验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。
记录原始数据，填写检验报告。
辅助材料
鲎试剂标准品检查用水9g/L的氯化钠溶液
细菌内毒素检验操作程序
细菌内毒素检验操作程序目的：规范细菌内毒素检验操作程序。
范围：适用于细菌内毒素检查操作。
责任：品质部组织制定，中心化验室负责实施。
内容1准备工作1.1实验设备及用具1.1.1刻度吸管、称量瓶、镊子、安瓿瓶（2ml、5ml）、药匙、250℃烘烤1小时。
1.1.2干燥箱、恒温水浴锅、漩涡混合器、精密天平。
1.1.3剪刀、砂轮片、医用胶布、洗耳球、试管架、脱脂棉球、水银温度计、试管1.2内毒素标准品与实验试剂1.2.1鲎试剂：在使用前应进行灵敏度测定，原则上购进一个批号测定一次。
1.2.2细菌内毒素检查用水（内毒素含量＜0.015Eu/mL灭菌注射用水）。
1.2.3细菌内毒素国家标准品和工作标准品。
1.2.4 75%乙醇、铬酸洗液。
1.3实验用具的消毒处理：凡是参与实验样品或试剂接触的器具，在实验前必须经除细菌内毒素处理，将洗净的器具经纯化水冲洗后，在250℃干热灭菌至少60分钟。
1.4恒温水浴箱内水浴温度调节到37±1℃。
2鲎试剂灵敏度复核2.1根据鲎试剂灵敏度的标示值（如：λ=0.25 EU/ml），细菌内毒素工作标准品加入1ml 细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟。
2.2将工作标准品制备成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度（0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.06 EU/ml）的内毒素标准溶液，备用。
例：工作标准品为160 EU/ml 时30秒。
2.3取18支0.25 EU/ml 鲎试剂，每支中加入0.1mlBET 水，然后分别加入0.1ml2.2中制备好的4个浓度的标准液,按浓度从高到低依次加入，每个浓度加4支，；最后2支加入0.1mlBET 水作阴性对照。
2.4将上述试管用医用胶布封口，垂直放入37℃±1℃水浴锅中，保温60±2分钟。
放入水浴前把水搅动几下，以使水温均匀。
再次检查温度是否在所要求的范围，注意保温和取放过程应避免受到振动造成的假阴性结果。
415 细菌内毒素检查标准操作规程g
范围：注射用水、大输液、化学药品、生化药品、放射性药品、生物制品等以及药品生产过程的内毒素监控。
职责：检验室对本规程的实施负责正文：1.操作前准备1.1检验人员操作前要穿戴好工作服、工作帽、戴上口罩，手要用75%的酒精消毒。
操作时要力求准确。
1.2设备与用具——试验所用器皿，需经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃干烤至少1小时（或180℃干烤至少2小时）。
1.3试剂与标准品1.3.1无热原水：内毒素含量不超过0.06Eu/ml的注射用水。
1.3.275%酒精棉1.3.3鲎试剂为冻干品，规格有0.1ml/支和0.5ml/支二种。
1.3.4细菌内毒素工作标准品，由中国药品生物制品检定所指定的鲎试剂厂标定及供应。
1.3.5供试品溶液可按药典正文规定进行。
2.操作步骤：2.1取试管5支，各加入0.1ml鲎试剂溶液，其中2支分别加入0.1ml供试品溶液作为供试品管。
2.2另一支加入2倍灵敏度内毒素标准品溶液0.1ml作为阳性对照管。
2.3第四支加入2倍灵敏度内毒素标准品溶液0.1ml，再加入供试品溶液0.1ml 作为样品阳性对照管。
2.4最后一支加入0. 灵敏度1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
2.5将上述5支管轻轻混匀后封闭管口，垂直放入37℃±1℃水浴中保温60min ±2min，小心取出，观察结果。
3.结果判断3.1阳性：缓慢倒转试管180℃，管内物质是坚实凝胶者，记录为（+）3.2阴性：缓慢倒转试管180℃，管内物质流动或呈凝胶状但不能保持完整者，记录为（－）3.3阳性对照管2管均为阳性（+）及阴性对照管为阴性供试品（－），则试验有效。
3.4供试品2管均为阳性结果（+），应判为不符合规定。
如供试品2管均为阴性结果（－）则符合本法规定。
3.5供试品2管中如有一管为（+），一管为（－）时，按“2.操作步骤”另取4支试管复试，4管中如有一管（+），即认为该批样品不符合本法规定。
细菌内毒素检查操作规程
细菌内毒素检查操作规程细菌内毒素检查操作规程 1.目的：建立一个测定细菌内毒素的检查方法。
2.范围：适用于需测定细菌内毒素的药品等。
3.责任：质检科检验员对实施本规程负责。
4.程序4.1原理4.1.1本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
4.1.2细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
4.1.3细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
4.1.4细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
4.1.5细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
4.1.6凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。
光度测定法的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。
4.1.7试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
常用的方法是在250?干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
试验操作过程应防止微生物的污染。
4.2供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的pH值在6.0～8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
细菌内毒素检查操作规程
细菌内毒素检查操作规程细菌内毒素检查操作规程一、实验目的细菌内毒素检查是为了检测样本中是否存在细菌产生的内毒素，可以作为细菌感染的诊断依据和治疗效果评估的指标。
二、实验材料和设备1. 细菌培养基和培养物2. 内毒素检测试剂盒3. 显微镜和载玻片4. 离心机5. 温箱和恒温水浴6. 试管、培养皿、移液器等常规实验用品三、实验步骤1. 培养细菌：将待检测的细菌接种到适当的培养基上，放入温箱中以适当的温度和时间进行培养，使细菌生长至对应的生长期。
2. 收集细菌：将培养好的细菌转移到离心管中，使用离心机将细菌离心沉淀。
3. 细菌裂解：将细菌沉淀加入合适的裂解缓冲液中，使用适当的方法将细菌完全裂解。
4. 澄清液分离：使用离心机将细菌裂解液离心，将上清液转移到新的试管中。
5. 内毒素检测：按照内毒素检测试剂盒说明书的要求，将所得上清液加入试剂盒中，进行内毒素的检测。
6. 结果解读：根据试剂盒的指示，观察试剂盒中的颜色变化或读取光密度等指标，判断样品中是否存在细菌内毒素。
7. 结果验证：使用正负对照样品验证结果的准确性和可靠性。
四、实验注意事项1. 实验过程需要遵守无菌操作的要求，避免细菌污染。
2. 实验中使用的试剂和培养基要在有效期内，并按照要求保存。
3. 实验过程中应注意个人防护，避免接触到有害物质。
4. 操作前要充分了解试剂盒的使用方法和读取结果的标准。
5. 结果解读时要考虑到阳性和阴性对照的结果，以免误判。
6. 使用的设备要事先进行验证和校准，以保证实验结果的准确性和可靠性。
五、实验结果记录和分析1. 记录实验所使用的试剂批号和有效期。
2. 记录实验过程中的注意事项和操作细节。
3. 记录实验结果，包括阳性和阴性对照的结果。
4. 对实验结果进行分析和解释，判断样品中是否存在细菌内毒素。
六、实验结果的报告和存档1. 编写实验报告，包括实验目的、材料和方法、结果分析、结论等内容。
2. 报告中要附带实验记录、数据分析和结果验证等材料。
细菌内毒素检查法标准操作规程
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1.目的建立细菌内毒素检查法的操作标准，以免操作不当而造成损失及减少误差的来源。
2.范围本规程适用于各品种的细菌内毒素检查。
3.职责QC负责本规程的实施，QC主管对本规程的实施进行监督。
4.内容4.1实验材料及用具4.1.1天平（精度0.1mg）；电热干燥箱（用于去除外源性内毒素，温度应能达到250℃）；恒温水浴箱货适宜的恒温器（37℃±1℃）；水银温度计或酒精温度计（精度1℃以下）；旋涡混合器；鲎试剂（应有国家主管部门的批准文号）；4.1.2细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品；4.1.3细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
4.1.4实验用具：移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10mm ×75mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、时钟、75%乙醇棉、剪刀、砂轮。
所用玻璃器皿须经250℃干烤30分钟以上。
若使用塑料器械、如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
4.2实验准备4.2.1玻璃器皿的洗涤：将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置人电热干燥箱。
4.2.2玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素的去除：玻璃器皿置干燥箱后，将干燥箱调至250℃，待干燥箱温度升至设定的温度后开始计时，250℃干烤30分钟以上。
达到规定时间后，关断电源，待干燥箱温度自然降至室温。
在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。
4.2.3供试品溶液的制备：某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
细菌内毒素检查规程
细菌内毒素检查规程一、目的：阐述细菌内毒素检查规程。
二、适用范围：适用于细菌内毒素的检查规程。
三、责任者：品控部。
四、正文：1 简述1.1 本规程适用于2005年版附录中细菌内毒素检查法——凝胶法1.2 鲎试剂灵敏度复核试验的目的不仅是考查鲎试剂和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确和实验条件是否符合规定。
因此要求每个实验室在将一批新的鲎试剂用于干扰试验或供试品细菌内毒素检查前应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
1.3 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和工艺是否有变化，鲎试剂来源于不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。
1.4 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。
阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。
2 实验材料及用具2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。
2.2 电热干燥箱除外源性内毒用，温度应能维护250℃以上至少一小时。
2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37°±1℃保持一小时。
2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。
2.5 旋涡混合器2.6 鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号2.7 细菌内毒素国家标准品（NSE），细菌内毒素工作标准品（WSE），除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。
2.8 细菌内毒素检查用水（BET水）系指与灵敏度为0.03Eu/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下不产生凝集反应的灭菌注射用水。
2.9 实验用具移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（10³75mm）、三角瓶、小试管（16³100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管架、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮。
所用玻璃器皿经过250℃干烤至少1小时。
塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。
2.10 试剂75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液3 操作方法3.1 试验准备3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。
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标准操作规程目的建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。
适用范围所有原料、成品的细菌内毒素检查。
责任人检验员内容1简述1.1本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。
1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。
供试品检测时可使用其中任何一种方法。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
1.3 本规范适用于凝胶法检查。
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位（）表示1.5 细菌内毒素国家标准品（）系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
1.6 细菌内毒素工作标准品（）系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水（水）系指内毒素含量小于0.015灭菌注射用水。
光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005。
1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素标准操作规程的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
1.9供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。
1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。
阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。
2实验材料及用具2.1 天平供试品称量用，感量为0.1以下。
2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250C以上至少一小时。
2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37 土「C保持一小时。
2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1C以下。
2.5旋涡混合器2.6 鲎试剂（应具有国家主管部门的批准文号）及细菌内毒素检查用水（符合规定）。
2.7细菌内毒素国家标准品（），细菌内毒素工作标准品（），除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。
2.8 实验用具移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（10 X 75）、三角瓶、小试管（16 X 100）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮所用玻璃器皿须经250C干烤至少1小时。
塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。
2.9 试剂75%乙醇、蒸馏水、5师铬酸钾硫酸洗液。
3操作方法3.1 试验准备3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。
3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。
标准操作规程3.1.3 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后将烤箱调至250C,待烤箱温度升至设定的温度后开始记时，须干烤至少1小时。
达到规定时间后，关断电源。
待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可在两周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。
3.2 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值(L) 一般按以下公式确定式中L为供试品的细菌内毒素限值，以、、或(活性单位)表示；K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以(• h)表示，注射剂，5( • h)，其中放射性药品注射剂K= 2.5( • h)，鞘内用药品，0.2( • h);M为人用每公斤体重每小时最大供试品剂量，以(• h)、(• h)或(• h)表示，人均体重按60计算，注射时间若小于I小时，按I小时计。
按人用计量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。
3.3确定最大有效稀释倍数()最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限度的检测。
用以下公式来确定：入L为供试品的细菌内毒素限值；C表示供试品的浓度，或供试品复溶后所得溶液的浓度。
当L以表示时C为11，当L以或表示时，C单位需为或。
如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则取1,可计算供试品的最小有效稀释浓度入;入为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度()，或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
3.4 鲎试剂灵敏度复核3.4.1 内毒素标准溶液的制备3.4.1.1 取或一支，轻弹瓶壁，使粉末落人瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻标准操作规程划痕，75%酉精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。
341.2 按标准品使用说明书用移液管加入规定量的水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。
置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0入、1.0入、0.5入、0.25入（入为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒（详细过程请参见使用说明书）。
若为，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装并保存。
例如使用（内毒素含量为9000/支）时的方法如下：复溶：准确吸取水1加入的安瓿内，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器混合15 分钟，即为9000内毒素标准溶液。
稀释：取0.3内毒素标准溶液加上2.7水即为1-10稀释液，得到900内毒素标准溶液。
取0.3 -10稀释液，加上2.7水即为1-100稀释液，得到90内毒素标准溶液。
往后依次类推。
也可写成下列格式：0.3 0.3 0.3 0.3 1 19000 —900—90—9——0.5 —2.7 2.7 2.7 2.40.25 —0.125 —0.0625 —0.03125在上述稀释过程中，每稀释一步，均须在旋涡混合器上混合30秒钟。
3.4.2 待复核鲎试剂的准备3.4.2.1 在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。
用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%L醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落人瓶内，加入0.1水复溶，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
3.4.2.2 若待复核鲎试剂的规格不是0.1支时，按标示量加入水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混匀后每0.1m1分配到10X 75凝聚管中，要求至少分配18管******有限公司标准操作规程备用（或取0.1支的鲎试剂溶液的10X 75试管或复溶后的0.1支的鲎试剂原安瓿）。
343 加样将已充分溶解的待复核：鲎试剂18支（管）•放在试管架上，排成5列，其中4支（管）4 列分别加入2.0入、1.0入、0.5入、0.25入的内毒素标准溶液；2支（管）1列分别加入水作为阴性对照。
内毒素标准溶液和水的加样量均为0支。
3.4.4 加样结束后、用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放人37 士「C水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60 ± 2分钟，观察结果。
3.4.5 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形、并从管壁滑脱者为阴性。
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阳性结果。
3.4.6 鲎试剂灵敏度复核实验结果计算当最大浓度2.0入管均为阳性，最低浓度0.25入管均为阴性，阴性对照为阴性，试验方为有效。
按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的复核结果（入C） O 1入（' x/4）式中X为反应终点浓度的对数值（）。
反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
当入C在0.5入〜2入（包括0.5入和2入）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度入为该批鲎试剂的灵敏度。
3.5 干扰试验3.5.1 按表1制备溶液A、B、C和D,使用的供试品应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
3.5.2 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。
按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（E。
和E1）E o JgT X°/4）E i =lg」C X i/4）式中X。
、X i分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（）。
当吕在0.5入〜2入（包括0.5入和2入）及E i在0.5 E。
〜2 E o（包括0.5 E o和2 E o）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。
若供试品溶液在小于的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过的进一步稀释，再重复干扰试验。
3.5.3 表1凝胶法干扰试验溶液的制备注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D 为阴性对照。
3.5.4 可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。
为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。
3.6 供试品细菌内毒素的检查法。
3.6.1 凝胶限量试验3.6.1.1表2凝胶限量试验溶液的制备注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的值在6.0〜8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或稀释液）的值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节值。
酸、碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的窗口容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
361.2 检查方法按表2制备溶液A、B、C和B使用稀释倍数为并且已经排除干扰的供试品溶液来制备A和B,按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
取0.1支的鲎试剂溶液的10X 75试管或复溶后的0.1支的鲎试剂原安瓿8支，其中2支加入0.1按最大有效稀释倍数（）的供试品溶液（表2中的A）;2支加入0.1用细菌内毒素检查用水将内毒素工作标准品制成的2入浓度的内毒素溶液作为阳性对照管（表2中C）; 2支加入0.1供试品阳性对照溶液［用供试品溶液将同一支（瓶）内毒素工作标准品制成的2入浓度的内毒素溶液］作为供试品阳性对照阳性对照管（表2中B）, 2支加入0.1细菌内毒素检查用水作为阴性对照管（表2中D）3.6.1.3 结果判断保温60±2分钟后观察结果。
若阴性对照溶液D的平行管均为阴性（-），供试品阳性对照溶液B 的平行管均为阳性（+），阳性对照溶液C的平行管均为阳性（+），试验有效。