微生物自主实验-活性的测定
抗菌活性测试步骤
抗菌活性测试步骤抗菌活性测试步骤及实验器材第一天中午12点1、准备9个锥形瓶（1个备用，4个培养菌液，4个稀释菌液），洗净，烘干2、先在备用锥形瓶中配制500ML液体培养基，溶解后，倒入其余8个锥形瓶中，每瓶50ML。
盖上半透膜，用绳或皮筋系住，在用报纸盖上一层，用皮筋系住。
液态培养基：蛋白胨5g，酵母2.5g，氯化钠5g，水500ML，按比例增减。
（半透膜）第一天下午3点3、将9个锥形瓶，200μL枪头两盒，10μL 枪头，1ML枪头，用报纸包住，放入灭菌箱中，灭菌20min。
121摄氏度。
（灭菌锅）第一天下午4点4、配药液，按照0.0010g—1ML，0.0020g—2ML，这种浓度配药液配出的浓度为1000μg/mL,溶剂为DMSO：水=1:1.等着全部溶解。
第一天晚上6点5.稀释药液，将配制好的药液浓度为1000，500，250，125μg/mL，四个浓度梯度。
第一天晚上9点6、将超净台打开紫外灯灭菌20min，点燃酒精灯，从灭菌箱取出4个锥形瓶，把接种环放在酒精灯上烧红，冷却几秒，从固体斜面菌落中划出一点，放在培养基中，放入摇床（转速131，温度37摄氏度）中培养12个小时。
超净台，摇（从左到右依次为接种环，床）第三天早上11点10、加完MTT，放在37度恒温箱中，培养4个小时。
（恒温箱）第三天下午三点11、3小时后，取出，大概称量下96孔板的重量（使他们放在离心机中可以平衡，相对的板质量差不可以超过0.02克）放在离心机中离心3分钟，3050RPM 3 MIN,离心结束后，甩掉上层清液（），用排枪在96孔板中每孔加入150μLDMSO （二甲基亚砜），轻摇5-30min溶解，放在酶标仪中测量，得到数据。
（从左到右依次为排枪，离心机，酶标仪）仪器：锥形瓶, 半透膜, 200μL枪头两盒，10μL枪头，1ML枪头, 灭菌箱, , EP 管, 超净台, 接种环,酒精灯，摇床，96孔板，枪，恒温箱，离心机，酶标仪。
微生物学类实验指导书(下)蛋白酶产生菌活力测定及果酒酵母分离纯化
实验一产酶微生物的分离、纯化与选育酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。
由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒,环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。
目前,能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶,葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的.通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。
2。
蛋白酶产生菌的分离与纯化2。
1 实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化.2。
2 实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶,细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌.本实验将土壤样品（或其他样品)悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛.也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养,分离筛选其他蛋白酶产生菌。
2.3 实验仪器与材料土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液;显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。
2。
4 实验方法与步骤2。
4.1 分离1)采集土壤样品，用无菌水制备1:10土壤悬液；2）取1:10土壤悬液5ml,注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75—80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌；3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置,于30-32 ℃培养24-48 h；4)对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片,做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
2。
4。
2 筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基,再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24—48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径.2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。
微生物生物化学实验技术
微生物生物化学实验技术微生物生物化学实验技术是一门涉及微生物和生物化学的实验技术学科，其研究内容包括微生物的生长特性、代谢途径、原生态功能等方面。
在实验室中，通过一系列实验手段和技术手段，可以研究微生物的生物化学过程，揭示微生物在环境中的作用和影响。
一、菌种的保存和鉴定在微生物生物化学实验技术中，首先需要进行菌种的保存和鉴定工作。
菌种的保存是为了长期保存某种微生物，以备后续实验使用。
常见的保存方式包括在琼脂培养基上制备菌斑、制备冻干粉末或低温冷冻保存等。
而菌种鉴定则是为了确保所使用的微生物种属准确，常见的鉴定方法包括形态学观察、生理生化特性检测、分子生物学技术等。
二、微生物生长曲线的绘制和分析微生物生长曲线是研究微生物生长和繁殖规律的重要手段。
利用实验技术，可以通过不同培养条件下不同时间点的菌液浓度进行测定，从而得到微生物生长曲线。
通过绘制生长曲线并进行数据分析，可以了解微生物在不同生长阶段的生长速率、最大生长速率、最大生长速率等参数。
三、微生物代谢产物的检测和分析微生物代谢产物是微生物在代谢过程中产生的各种物质，包括有机酸、氨基酸、酶等。
通过实验技术，可以对微生物代谢产物进行检测和分析，了解微生物的代谢途径和代谢产物的种类及含量。
常见的检测方法包括高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法等。
四、微生物酶活性的测定和应用微生物酶是微生物体内产生的一种特殊蛋白质，具有催化作用。
通过实验技术，可以对微生物酶的活性进行测定，了解酶的催化特性和反应底物的种类。
此外，微生物酶在生物化学工程、食品工业、医药等领域有着广泛的应用，通过研究微生物酶的活性和性质，可以进一步开发和利用其潜在的应用价值。
五、微生物工程技术的发展趋势随着现代科学技术的不断发展，微生物工程技术也在不断更新和完善。
新兴的技术包括代谢工程、系统生物学、合成生物学等，将为微生物生物化学实验技术的发展带来新的契机和挑战。
同时，微生物生物化学实验技术在环境保护、资源利用、新药开发等方面具有广阔的应用前景，将为人类社会的可持续发展做出重要贡献。
生物化学实验指导：酶的活性测定实验
生物化学实验指导：酶的活性测定实验1. 引言在生物化学领域，测定酶的活性是一项重要的实验技术。
酶是生物体内参与许多生化反应的催化剂，能够加速反应速率。
通过测定酶的活性，我们可以了解其催化效率和特性。
本实验旨在教授如何测定某一种酶的活性，并提供相应步骤和分析方法。
我们选择一种常见的酶作为例子，详细介绍实验操作步骤和数据处理方法。
2. 实验材料•酶提取物•底物（适合所选酶催化反应的底物）•缓冲溶液（pH值适合所选酶催化反应的缓冲溶液）•辅助试剂（如辣根过氧化物酸）•试剂盒或相关仪器设备3. 实验步骤步骤1：制备必要溶液1.准备合适浓度并调整pH值适合实验目标的缓冲溶液。
2.准备底物溶液，确保其浓度符合实验要求。
步骤2：制备标准曲线1.准备一系列不同底物浓度的标准溶液。
2.按照指定的方法将不同底物浓度的标准溶液与酶提取物混合。
3.在一定时间间隔内，记录反应进程中释放的产物（如颜色变化）。
步骤3：样品预处理1.从所需生物样品中提取目标酶。
可以采用相关提取方法，如超声波法、机械破碎法等。
2.将提取得到的酶溶液进行适当稀释，以便后续操作过程中能够在合适浓度范围内工作。
步骤4：活性测定实验1.将提取得到的目标酶与底物溶液以及其他必要试剂加入适当容器中，形成反应体系。
2.控制温度和pH值，确保反应条件符合要求。
3.运行反应体系一段时间，并记录反应进程。
步骤5：数据处理和分析1.使用已经制备好的标准曲线，根据测试产生的光吸光度（或其他测量结果）计算出底物的浓度。
2.根据所得底物浓度和反应时间，计算出酶催化反应速率。
3.通过对不同条件组的实验数据进行比较和统计分析，可以进一步了解酶活性受到哪些因素影响。
4. 结论通过本实验指导，我们能够学会如何进行酶的活性测定实验，并熟悉基本的数据处理和分析方法。
这一实验可以为进一步探究酶催化机制、优化酶工艺等提供基础。
实践中，可以根据具体需求对该实验设计进行适当调整和补充。
微生物酶活性试验方法
微生物酶活性试验方法脱氢酶活性测定方法参考：【周春生, 尹军. 一脱氢酶活性检测方法的研究[J]. 环境科学学报, 1996, 4: 400-405.】以及【环境工程微生物检验手册[M]. 中国环境科学出版社, 1990.】（一）试验方法：（1）水样预处理：取污泥混合液10ml，放入离心管中离心5min后去除上清液，用纯水反复清洗三次，最后向样品中加入纯水至10ml搅拌均匀。
（2）加试剂：将处理后样品转移至25ml比色管中，依次加入7.5mlTris-HCl缓冲液（PH=8.4）、2.5ml硫酸钠溶液（0.36%）、2.5ml纯水以及2.5mlTTC溶液（0.4%）、混匀。
（3）样品培养：将比色管置于37℃条件下水浴恒温振荡器中培养，培养5min 后吸取5ml于离心管内，加0.5ml甲醛固定以作样品空白；（4）终止酶反应：继续培养30min，然后向管中加入2ml甲醛终止酶反应；（5）样品萃取：将样品培养液以5.5ml为1份分装在四个离心管中，连同样品空白对照管一道离心5min, 弃去上清液向各离心管内加6ml丙酮, 研磨搅拌混合,于37℃条件下萃取TF10min后；（6）比色分析：将萃取液进行离心5min,用1cm的比色皿取上清液显色液, 于波长485nm处进行比色, 记录吸光值,根据样品显色液与样品空白的吸光值之差, 查标准曲线, 进而计算出TF的生成速度, 即脱氢酶活性(mg/(L*h))（二）试剂：（1）0.4％三苯基四氮唑氯化物溶液（氯化三苯基四氮唑，TTC）:4g-2、3、5-氯化三苯基四氮唑，稀释至1L至容量瓶中，棕色瓶保存；（2）Tris-HCl缓冲液：称取6.057gTris（三羟甲基氨基甲烷, 分析纯, 北京化学试剂厂），加入20ml 1mol/L HCl溶液, 再定容至1L；（3）硫酸钠溶液（0.36%）：3.6g硫酸钠（Na2SO3）稀释至1L容量瓶中；（4）TTC标准溶液：称取0.05gTTC定容与50ml茶色容量瓶中此溶液即为1mg/L的标准溶液。
土壤微生物量及土壤酶活性测定方法
2 土壤微生物量测定土壤微生物量（MB）是指土壤中体积小于5x103叩3的生物总量，但活的植物体如植物根系等不包括在内］。
它通过调控土壤中能量和养分循环以及有机物转化，来反映土壤同化和矿化能力。
土壤微生物生物量包括土壤微生物生物量碳、土壤微生物生物量氮、土壤微生物生物量磷和土壤微生物生物量硫，但一般情况下土壤微生物生物量的大小以土壤微生物生物量碳来表示。
2.1熏蒸浸提法2.1.1原理利用不同的浸提剂，通过氧化滴定法来测定土壤浸提液中有机C、N和P提取的可溶性有机碳含量和微生物量C之间存在较稳定的比例关系。
2.1.2则定步骤1.根据土壤样品含水量，调节土壤含水量为田间持水量的50%，25 ℃下密封培养10 d，以保持土壤均匀和不同地方所得结果的可比性。
2.氯仿熏蒸24 h后，用真空泵反复抽气，直到土壤闻不到氯仿气味为止。
根据所测对象不同选择不同的提取剂浸提，振荡浸提30 min后，立即分析浸提液中所测对象的含量或放入-15 ℃下保存。
表1指出氯仿熏蒸浸提法测定不同土壤微生物量所选用的浸提剂及其条件。
表1姓熏薪髓喉土就生帽条件Table I F'E fcrdieneasuirm aitcondiocnsof soilm riobialbmass土情即鄢Detemiia血cfhdicaMr Eitatnt土觥生醯K(=D,3S 或D.45土觥物1小K国加士躺蜘M恻般注®拓牖腌雄魂航觥刎楠融脑机装痴螭定雕耐帕帆小麒眼3 土壤酶活性测定土壤酶活性均用风干土壤。
土壤转化酶活性和过氧化氢酶活性、脲酶活性、磷酸酶活性依次用硫代硫酸钠滴定法、高锰酸钾滴定法、靛酚蓝比色法和磷酸苯二钠比色法测定（关松荫,1986）3.1脲酶一一靛酚蓝比色法脲酶的活性可以用来表示土壤供氮能力（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。
酶的活性测定实验报告
酶的活性测定实验报告实验目的：本实验旨在通过测定酶的活性，了解酶在不同条件下的反应速率，并熟悉酶的活性测定方法。
实验原理：酶是一种生物催化剂，可以加速生物体内许多生化反应。
酶的活性可以通过测定酶催化反应的速率来间接衡量。
本实验采用辣根过氧化物酶催化紫苏过氧化物酸钾（Guaiacol peroxidase催化H2O2）的反应，通过测定紫苏过氧化物酸钾在酶作用下与H2O2反应生成的天然染料产物对应颜色的吸光度变化，来确定酶的活性。
实验步骤：1. 实验前准备：将所需试剂和设备准备齐全，包括辣根过氧化物酶、紫苏过氧化物酸钾、H2O2、标准曲线所需的辣根酚浓溶液、缓冲液等。
2. 标准曲线的制备：依据辣根酚浓溶液的吸光度与其浓度的线性关系，制备一系列浓度不同的辣根酚标准溶液，浓度范围可根据实验需要自行设定。
3. 酶的活性测定：a. 取一定体积的缓冲液倒入试管中，并在室温下预热。
b. 向试管中加入一定体积的辣根过氧化物酶，尽量保持温度稳定。
c. 加入一定体积的紫苏过氧化物酸钾溶液，并立即开始计时。
d. 向混合液中加入适量的H2O2，混合均匀后立即开始计时。
e. 在一定时间间隔内，分别取出试管中适量的反应液，加入相应的辣根酚溶液，混合均匀后置于恒温水浴中反应一段时间。
f. 将反应液取出，用紫外分光光度计测定吸光度值。
4. 数据处理：a. 将浓度不同的辣根酚标准溶液的吸光度值与其浓度绘制曲线，得到标准曲线方程。
b. 将实验得到的吸光度值带入标准曲线方程，计算出相应的辣根酚浓度。
c. 根据反应体系中辣根酚的浓度变化，计算出酶催化反应的速率。
结果与讨论：根据实验数据，我们绘制了辣根酚浓度与吸光度的标准曲线，通过该曲线我们可以计算出实验得到的吸光度值对应的辣根酚浓度。
将实验中测得的吸光度值带入标准曲线方程，我们可以计算出不同时间点反应体系中辣根酚的浓度。
根据实验前的设定，我们可以计算出不同时间点酶催化反应的速率。
通过观察速率随时间变化的曲线，我们可以得出酶反应速率的变化规律。
(完整word版)乳酸菌活性测定具体操作步骤
乳酸菌活性测定具体操作步骤一、培养基的配制：改良TJA培养基(改良番茄汁琼脂培养基）番茄汁 50mL酵母抽提液 5g肉膏 10g乳糖 20g葡萄糖 2gK 2HPO42g吐温80 1g乙酸钠 5g琼脂 15g水加至。
1000mL pH6.8±0。
2（用10mol/l的氢氧化钠调节）番茄汁的制作：将新鲜番茄洗净,切碎（切勿捣碎），放入三角烧瓶，置4℃冰箱8～12h，取出后用纱布过滤即成。
如一次使用不完，可将其置入0℃冰箱，可保存四个月。
使用时让其在常温下自然溶解。
制法:将所有成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6。
8±0.2。
分装烧瓶，高压灭菌121℃ 15~15min。
临用时加热熔化琼脂，冷至50℃时使用。
二、器材lm1无菌移液管,无菌平皿,无菌试管，塞子，试管架,酒精棉、70～75％酒精、酒精灯、镊子、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱等，电子天平,洗耳球，三角瓶，烧杯等。
三、操作步骤（实验步骤按实验操作进行增减）l．编号：（每个样的操作按下表进行编号和操作）注：酸奶由一个组成员做即可,酸奶稀释倍数要做到10—8.平板上还需标明班级,组号，样品种类（分瓶中和管内)。
其中倒平板时酸奶做6、7、8三个梯度，酸奶粉做2、3、4三个梯度（根据具体情况定）。
酸奶粉做2个平行,原酸奶做3个平行。
2．配置酸奶奶粉溶液：以无菌操作（即在超净工作台上操作，电子天平、称量纸、药匙、事先放入超净工作台上紫外杀菌30min)称取1g 奶粉溶解于10—1试管无菌生理盐水中配成1:10的均匀稀释液。
将10-1试管置试管振荡器上振荡（此处由于实验条件有限，盖住硅胶塞，右手左右晃动震荡即可）,使菌液充分混匀.酸奶则吸取1ml溶解于另一支10—1标号无菌生理盐水中配成1：10的均匀稀释液。
3、稀释用lmL无菌吸管吸取lmL已充分混匀的1：10的奶粉溶液（待测样品) 沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的标号10—2试管内 (注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。
抗菌活性的测定
(一)抗菌活性的测定（琼脂块法）
二实验原理
利用放线菌产生的抗生素在琼脂中扩散使其周围的指示菌生长受到抑制而形成抑菌圈，根据抑菌圈的大小来判断抗菌活性。
2；材料与器材
菌种：白假丝酵母, 枯草杆菌，大肠杆菌.，草分枝杆菌607，金色葡萄球菌，灰棕黄青霉和黑曲霉
培养基：高氏1号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基.
仪器：移液管。
培养皿。
无菌打孔器。
针头。
镊子
3实验步骤
（1）倒平板：在无菌培养皿中，倒入高氏一号培养基，凝固后待用。
（2）接种：将被测得放线菌的菌株制成悬液，均匀的涂布在每个平板上。
倒置，28℃培养2-3天。
（3）打孔：用无菌打孔器将小菌落琼脂块打下移至湿室中培养成熟24小时。
（4）用镊子将培养成熟的单菌落琼脂从湿室中移出，放置在分别含有白假丝酵母, 枯草杆菌，大肠杆菌.，草分枝杆菌607，金色葡萄球菌，灰棕黄青霉和黑曲霉的培养基表面，倒置，在28℃下培养24小时。
（4）抑菌圈大小测定：测量抑菌圈直径，分别记下每种抑菌圈相对应的大小
4实验所需控制的条件
温度，适度，无菌条件。
微生物活性测定方法综述
第３６卷第８期２０１６年４月生态学报ＡＣＴＡＥＣＯＬＯＧＩＣＡＳＩＮＩＣＡＶｏｌ．３６，Ｎｏ．８Ａｐｒ．，２０１６基金项目：国家自然科学基金项目（４１２３０７５０）；中国科学院战略先导专项Ｂ课题（ＸＤＢ０５０１０２００）收稿日期：２０１４⁃１０⁃２６；㊀㊀网络出版日期：２０１５⁃㊀⁃㊀∗通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｃｕｉｘｙ＠ｕｃａｓ．ａｃ．ｃｎＤＯＩ：１０．５８４６／ｓｔｘｂ２０１４１０２６２０９３车荣晓，王芳，王艳芬，邓永翠，张静，马双，崔骁勇．土壤微生物总活性研究方法进展．生态学报，２０１６，３６（８）：㊀⁃㊀．ＣｈｅＲＸ，ＷａｎｇＦ，ＷａｎｇＹＦ，ＤｅｎｇＹＣ，ＺｈａｎｇＪ，ＭａＳ，ＣｕｉＸＹ．Ａｒｅｖｉｅｗｏｎｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎｇｔｏｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｏｉｌｓ．ＡｃｔａＥｃｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，２０１６，３６（８）：㊀⁃㊀．土壤微生物总活性研究方法进展车荣晓１，２，王㊀芳１，王艳芬１，邓永翠３，张㊀静１，马㊀双１，崔骁勇１，∗１中国科学院大学，北京㊀１０００４９２格里菲斯大学，布里斯班㊀４１１１３南京师范大学，南京㊀２１００２３摘要：微生物总活性是指在某一时段内微生物所有生命活动的总和，它直接决定着微生物行使生理㊁生态功能的能力，是微生物学研究的热点，也是难点㊂迄今为止，还没有建立直接测定微生物总活性的方法，只能用一些相关指标来间接反映它㊂目前常用的指标主要包括微生物的呼吸速率㊁生长速率以及胞内ＲＮＡ含量等㊂与其它一些基质和环境相比，测定土壤中的微生物总活性更为困难㊂通过总结研究土壤微生物总活性常用的三种方法，在简略概括传统的土壤微生物呼吸测定法的基础上，详细介绍了放射性同位素标记法和ＲＮＡ直接表征法的原理和操作流程，整理归纳了一些重要应用案例，比较分析了不同方法的优缺点，以期为选择研究土壤微生物总活性的适宜方法提供依据㊂关键词：土壤微生物；微生物总活性；土壤微生物呼吸；微生物生长活性；土壤ＲＮＡＡｒｅｖｉｅｗｏｎｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎｇｔｏｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｏｉｌｓＣＨＥＲｏｎｇｘｉａｏ１，２，ＷＡＮＧＦａｎｇ１，ＷＡＮＧＹａｎｆｅｎ１，ＤＥＮＧＹｏｎｇｃｕｉ３，ＺＨＡＮＧＪｉｎｇ１，ＭＡＳｈｕａｎｇ１，ＣＵＩＸｉａｏｙｏｎｇ１，∗１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００４９，Ｃｈｉｎａ２ＧｒｉｆｆｉｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｒｉｓｂａｎｅ４１１１，Ａｕｓｔｒａｌｉａ３ＮａｎｊｉｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００２３，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ（ＴＭＡ）ｉｎｓｏｉｌｓｉｓｖｉｔａｌｆｏｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅｒｏｌｅｓｏｆｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｉｎｅｃｏｓｙｓｔｅｍｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｉｔｃａｎｂｅｄｅｆｉｎｅｄａｓｔｈｅｓｕｍｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆａｌｌｔｈｅｍｉｃｒｏｂｅｓａｔａｇｉｖｅｎｍｏｍｅｎｔ．ＡｓＴＭＡｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｍｅａｓｕｒｅｄｉｒｅｃｔｌｙ，ａｓｅｒｉｅｓｏｆｐｒｏｘｉｅｓ，ｓｕｃｈａｓｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓ，ｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓ，ａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒＲＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｈａｖｅｂｅｅｎｐｒｏｐｏｓｅｄ．Ｈｅｒｅ，ｍｅｔｈｏｄｓｕｓｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｓｏｉｌＴＭＡａｒｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄ．（１）Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｍａｙｂｅｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｍｏｓｔｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｌｉｆｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｔｈｕｓ，ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓａｒｅｔｈｅｍｏｓｔｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｐｒｏｘｉｅｓｏｆｓｏｉｌＴＭＡ．Ｔｈｅｍａｉｎｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｉｓｔｈａｔｃｕｒｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓｕｓｕａｌｌｙｃａｎｎｏｔａｃｃｕｒａｔｅｌｙｒｅｆｌｅｃｔａｃｔｕａｌｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓ．ＷｈｅｎｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓａｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｕｓｉｎｇＣＯ２ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｒＯ２ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎｒａｔｅｓ，ｔｈｅｙｉｎｄｉｃａｔｅｃａｒｂｏｎｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎｏｒａｅｒｏｂｉｃｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．（２）Ｍｉｃｒｏｂｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓａｒｅｕｓｕａｌｌｙｍｏｒｅａｃｔｉｖｅ．Ｔｈｕｓ，ｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓａｒｅａｌｓｏｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｔｏｉｎｄｉｃａｔｅｓｏｉｌＴＭＡ．Ａｓｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｓａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌｔｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓ，ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｅｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ（ｉ．ｅ．，ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ，ｌｅｕｃｉｎｅ，ａｎｄａｃｅｔａｔｅ）ｃａｎｂｅｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｅｓｔｉｍａｔｅｍｉｃｒｏｂｅｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓ．Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ，ｔｒａｃｅｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｌｙｌａｂｅｌｅｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓａｒｅａｄｄｅｄｔｏｓｌｕｒｒｉｅｓ（ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄｓ）ｏｒｅｘｔｒａｃｔｅｄｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ（Ｂååｔｈᶄｓｍｅｔｈｏｄｓ）．Ａｆｔｅｒａｂｒｉｅｆｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ，ｍｉｃｒｏｂｅｓａｒｅｋｉｌｌｅｄａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓａｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｔｈｅｉｒｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅａｎｄｌｅｕｃｉｎｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎａｒｅｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｔｏ网络出版时间：2015-08-24 09:59:53网络出版地址：/kcms/detail/11.2031.Q.20150824.0959.002.html２㊀生㊀态㊀学㊀报㊀㊀㊀３６卷㊀ｍｅａｓｕｒｅｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓ，ｗｈｉｌｅａｃｅｔａｔｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｉｓｕｓｅｄｔｏｅｓｔｉｍａｔｅｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓｏｆｓａｐｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆｕｎｇｉ．Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓａｒｅｒｏｂｕｓｔｔｏｏｌｓｔｏｅｓｔｉｍａｔｅｔｈｅｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｅｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｏｎｅｃｒｉｔｉｃａｌｐｒｏｂｌｅｍｉｓｔｈａｔＴＭＡｉｎｃｌｕｄｅｓｂｏｔｈｇｒｏｗｔｈａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｎｏｎ－ｇｒｏｗｔｈａｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｈｅｒｅａｓｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓｏｎｌｙｒｅｆｌｅｃｔｔｈｅｆｏｒｍｅｒ．（３）Ｅｖｉｄｅｎｔｌｙ，ｎｏｎｅｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｂａｓｅｄｏｎｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｒｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｅｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓｃａｎａｃｃｕｒａｔｅｌｙｌｉｎｋｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｉｒｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｉｓｉｓｓｕｅｃａｎｂｅｒｅｓｏｌｖｅｄｔｈｒｏｕｇｈｕｓｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｂａｓｅｄｏｎＲＮＡ．ＲＮＡｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｃｌｏｓｅｌｙｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｏｓｔｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ＲＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｓａｓｓｕｍｅｄａｎｉｄｅａｌｉｎｄｉｃａｔｏｒｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ，ｍＲＮＡｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎａｎｄｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｗｈｅｒｅａｓｒＲＮＡｉｓａｐｒｏｘｙｏｆｓｏｉｌＴＭＡ．ＡｓｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｓｍａｌｌｓｕｂｕｎｉｔｒＲＮＡ（ＳＳＵｒＲＮＡ）ａｒｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌｔｏｔｏｔａｌｃｅｌｌｕｌａｒｒＲＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ＳＳＵｒＲＮＡｃｏｐｉｅｓｃａｎｓｅｒｖｅａｓａｎｉｎｄｉｃａｔｏｒｏｆｓｏｉｌＴＭＡａｎｄｔｈｅｒａｔｉｏｏｆＳＳＵｒＲＮＡｃｏｐｉｅｓｔｏＳＳＵｒＲＮＡｇｅｎｅｃｏｐｉｅｓｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅａｖｅｒａｇｅｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｓｏｉｌ．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ，ａｃｔｉｖｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｃａｎｂｅｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄｕｓｉｎｇｐｒｏｆｉｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓ，ｓｕｃｈａｓｃｌｏｎｅｌｉｂｒａｒｙ，Ｔ⁃ＲＦＬＰ，ａｎｄｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｂａｓｅｄｏｎＳＳＵｒＲＮＡ．Ｔｈｅｓｅａｐｐｒｏａｃｈｅｓｃａｎｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙｉｄｅｎｔｉｆｙｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｅｓａｎｄｔｈｅｉｒａｃｔｉｖｉｔｙｖｉａｉｎｓｉｔｕｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅｉｓｓｔｉｌｌｎｏａｄｅｑｕａｔｅｅｖｉｄｅｎｃｅｔｏｓｕｐｐｏｒｔｔｈｅａｓｓｅｒｔｉｏｎｔｈａｔｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｂａｓｅｄｏｎＳＳＵｒＲＮＡｃａｎａｃｃｕｒａｔｅｌｙｒｅｆｌｅｃｔｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｆｏｒｎｏｎ⁃ｇｒｏｗｔｈａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｎｏｎｅｏｆｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓａｒｅｐｅｒｆｅｃｔｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓｏｉｌＴＭＡ；ａｎｄａｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｕｉｔａｂｌｅｍｅｔｈｏｄｓｓｈｏｕｌｄｂｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ．ＫｅｙＷｏｒｄｓ：ｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｅｓ；ｔｏｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ；ｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ；ｍｉｃｒｏｂｉａｌｇｒｏｗｔｈａｃｔｉｖｉｔｙ；ｓｏｉｌＲＮＡ当前微生物生态学的研究正从两个方面展开：即微生物多样性和微生物功能，前者关注特定环境中的微生物群落结构，广泛采用分子生物学研究方法，并取得了显著进展；后一方面的研究深化了我们对微生物介导的特定生态过程的理解㊂微生物生态学研究的最终目标是建立微观尺度的微生物群落结构与宏观尺度的生态系统功能之间的联系，而微生物活性正是整合两者不可或缺的纽带㊂鉴于其极端重要性，微生物活性已经成为相关研究必须测定的基本指标，粗略检索发现，近些年每年都有上百篇生态㊁环境㊁土壤等方面的研究论文测定了微生物活性，但是基于研究目的和实验条件的不同，微生物活性的内涵和测定方法也有很大的差异，因此迫切需要界定微生物活性的含义，完善和开发微生物活性的测定方法㊂微生物活性又称为微生物代谢活力［１］，严格意义上是指微生物在某一时段内所有生命活动的总和，或在环境介质中微生物介导的所有过程的总和㊂从上述定义可以看出，直接测定微生物活性近乎是不可能的㊂基于此，绝大部分研究用特定代谢过程的速率来反映微生物的特定活性，如跟氮素转化相关的固氮活性［２］㊁硝化及反硝化活性［３］，与碳转化相关的纤维素分解活性［４］等㊂这些研究为理解微生物在生态系统的特定功能过程中的作用提供了重要基础，但是往往不能反映环境中微生物整体的代谢状态和综合生态系统功能㊂另一些研究则试图寻找相关指标（ｐｒｏｘｙ），间接反映微生物的总活性［５⁃７］㊂任何生命活动都需要能量供给，因此与能量供给相关的指标可以用来表征微生物总活性㊂这些指标主要包括微生物的ＡＴＰ含量㊁呼吸速率等㊂由于ＡＴＰ指征法存在较大的缺陷，现在更多采用呼吸速率反映微生物总活性［８⁃１０］㊂通常认为微生物活性与生长速率有正相关关系，即生长速率快的微生物具有更高的活性，所以微生物的生长速率也已成为表征微生物总活性的重要指标之一㊂早先的研究多采用平板计数或测量微生物生物量等方法测定微生物的生长速率，这些方法效率较低，已逐渐被放射性同位素标记法取代［６］㊂ＲＮＡ与生物体内各种酶的合成密不可分，而酶是生命活动的主要承担者，随着ＲＮＡ提取和定量方法的发展，用微生物胞内ＲＮＡ浓度来表征微生物总活性的方法逐步完善，并被推广应用［５］㊂相比于其他环境介质，土壤基质具有更为复杂的组成和结构，对微生物总活性的测定有较大的干扰，测定更加困难㊂目前有关土壤微生物总活性的研究主要采用土壤微生物呼吸测定法㊁放射性同位素标记法及ＲＮＡ直接表征法进行，其中土壤微生物呼吸测定法作为研究微生物总活性的经典方法已为国内外研究者所熟知，而放射性同位素标记法和ＲＮＡ直接表征法出现的时间相对较短，虽然在国际上已有大量的研究和应用［５⁃６］，但在国内尚未见该方法的研究报道㊂在此，我们简要概述土壤微生物呼吸测定法，详细介绍放射性同位素标记法和ＲＮＡ直接表征法在研究微生物总活性中的应用，比较各方法的优缺点，供微生物生态学㊁环境科学和微生物工程等领域的相关研究人员参考㊂１㊀土壤微生物呼吸测定法微生物呼吸是指微生物通过分解有机物质产生能量的过程，它是微生物几乎所有生命活动的能量来源㊂因此，呼吸作用的强弱在很大程度上可以反映微生物的总活性，而基于呼吸速率的微生物活性测定也已成为土壤微生物研究最常用的方法之一㊂土壤微生物呼吸速率常用的测定方式有三种：ＣＯ２释放速率㊁Ｏ２消耗速率和呼吸引起的温度变化，其中尤以前两种方法最为常用㊂为排除动㊁植物的影响，土壤微生物呼吸速率多在非原位状态下测定：即采集土壤样品，去除其中的植物根系后，置于一定的温度㊁水分等条件下培养㊂在此过程中ＣＯ２或Ｏ２浓度的变化一般采用气相色谱仪㊁红外气体分析仪（ＩＲＧＡ）㊁氧电极或专门的呼吸仪等仪器测定［７］，温度变化的测定则需要高精度测温装置［７］㊂微生物呼吸测定能较为准确地反映微生物总活性，且技术要求低，因此最早得到广泛的应用㊂呼吸作用是碳循环的重要环节，ＣＯ２是呼吸作用的主要产物，又是最主要的温室气体之一，随着全球变暖问题日益凸显，微生物在碳素转化中的作用愈发广受关注㊂测定微生物呼吸既能反映土壤微生物总活性，又能表征其在碳素转化中的生态功能，因此该方法至今仍是测定土壤微生物活性最常用的方法之一㊂在测定土壤微生物呼吸速率的同时，结合多种土壤酶活性的分析［１１⁃１３］，可以更准确地反映和理解土壤微生物总活性㊂微生物呼吸测定法也存在明显的缺陷㊂首先，ＣＯ２生成速率或Ｏ２消耗速率实际上反映的是有机碳矿化速率和有氧呼吸速率，与真实的微生物呼吸速率之间可能会有较大偏差［１４］；而测定土壤温度的变化又难以排除环境温度变化的影响，应用范围较窄㊂其次，要准确测定土壤微生物呼吸必须消除植物根系呼吸和土壤动物呼吸的影响，导致该方法难以实现原位测定㊂再次，该方法不能获得活性微生物种类的信息，不能建立微生物总活性与活性微生物种类之间的联系㊂综上所述，该方法适用于土壤动㊁植物干扰较少，又不需要了解土壤活性微生物种类的研究㊂基于ＣＯ２生成速率的土壤微生物总活性测定适用于有机碳作为微生物的主要能源的土壤；基于Ｏ２消耗速率的方法则更适用于通气性良好㊁微生物以有氧呼吸为主的土壤；而基于温度变化的测定方法，因为需要设置无呼吸对照，则更适用于室内培养实验㊂２㊀放射性同位素标记法通常生长速率快的微生物也具有更高的代谢活性，因此生长速率也是表征微生物总活性的常用指标之一㊂微生物大分子的合成速率与微生物的生长速率有很好的相关性，由于放射性同位素检测的灵敏度很高，在环境中只需添加痕量的放射性同位素标记的大分子前体物质，经短时间孵育后，通过测定微生物体内相应大分子物质的放射性活度，就可以反映微生物的生长速率㊂该类方法由于只添加痕量的前体物质，在孵育阶段对微生物的生长㊁代谢影响较小，因此成为测定微生物生长速率的常用方法㊂经过大量尝试和筛选，目前应用最多的前体物质为胸腺嘧啶核苷（ＴｄＲ）㊁亮氨酸（Ｌｅｕ）以及醋酸盐㊂在土壤微生物研究中，放射性胸腺嘧啶核苷标记法㊁放射性亮氨酸标记法常用于测定土壤细菌的生长速率；放射性醋酸盐标记法常用于测定真菌的生长速率（表１）㊂胸腺嘧啶核苷是ＤＮＡ合成的前体之一，与微生物的分裂㊁增殖密切相关㊂早在１９７４年Ｔｈｏｍａｓ等就已使用放射性胸腺嘧啶核苷标记法测定土壤微生物的生长速率［１５］，该方法曾一度成为研究水生环境中微生物生长速率的标准方法㊂但近期有研究发现，很大一部分微生物并不能吸收胞外胸腺嘧啶核苷，因此该方法测定３㊀８期㊀㊀㊀车荣晓㊀等：土壤微生物总活性研究方法进展㊀４㊀生㊀态㊀学㊀报㊀㊀㊀３６卷㊀的结果不能准确反映微生物总活性［１６］㊂表１㊀放射性同位素标记法测定土壤微生物活性的主要应用案例Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｏｍｅｓｔｕｄｉｅｓｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｂａｓｅｄｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｉｎｇ生态系统类型ＲｅｆｅｒｅｎｃｅｓＰｒｏｃｅｄｕｒｅ参考文献Ｒｅｓｅａｒｃｈｏｂｊｅｃｔｓ标记的前体物质Ｌａｂｅｌｌｅｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ操作流程Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｔｙｐｅｓ研究对象农田Ｆａｒｍｌａｎｄ细菌３Ｈ⁃ＬｅｕＢååｔｈᶄｓ流程［２９］农田Ｆａｒｍｌａｎｄ细菌３Ｈ⁃Ｌｅｕ３Ｈ⁃ＴｄＲＢååｔｈᶄｓ流程［２５］农田Ｆａｒｍｌａｎｄ真菌１４Ｃ⁃醋酸盐传统流程［２５］农田Ｆａｒｍｌａｎｄ细菌３Ｈ⁃ＬｅｕＢååｔｈᶄｓ流程［３０］农田Ｆａｒｍｌａｎｄ真菌１４Ｃ⁃醋酸传统流程［３０］农田Ｆａｒｍｌａｎｄ细菌３Ｈ⁃ＬｅｕＢååｔｈᶄｓ流程［３１］农田Ｆａｒｍｌａｎｄ真菌１４Ｃ⁃醋酸传统流程［３１］森林Ｆｏｒｅｓｔ细菌３Ｈ⁃ＬｅｕＢååｔｈᶄｓ流程［３２］草地Ｇｒａｓｓｌａｎｄ细菌３Ｈ⁃ＬｅｕＢååｔｈᶄｓ流程［３３］草地Ｇｒａｓｓｌａｎｄ细菌３Ｈ⁃ＬｅｕＢååｔｈᶄｓ流程［３４］湿地Ｗｅｔｌａｎｄ细菌３Ｈ⁃ＬｅｕＢååｔｈᶄｓ流程［２７］草地Ｇｒａｓｓｌａｎｄ细菌３Ｈ⁃ＬｅｕＢååｔｈᶄｓ流程［２７］森林Ｆｏｒｅｓｔ细菌３Ｈ⁃ＬｅｕＢååｔｈᶄｓ流程［３５］草地Ｇｒａｓｓｌａｎｄ细菌３Ｈ⁃ＬｅｕＢååｔｈᶄｓ流程［３６］草地Ｇｒａｓｓｌａｎｄ真菌１４Ｃ⁃醋酸盐传统流程［３６］荒漠Ｄｅｓｅｒｔ细菌３Ｈ⁃ＬｅｕＢååｔｈᶄｓ流程［３７］亮氨酸是蛋白质合成的前体之一，与微生物的生长㊁代谢关系密切㊂环境中绝大多数微生物都能直接利用胞外亮氨酸［１６］，而且微生物胞内蛋白质含量要显著高于ＤＮＡ含量，所以亮氨酸标记法已有取代胸腺嘧啶核苷标记法的潜势［１７］㊂尽管在有些研究中两种方法得到的结果较为一致［１８⁃１９］，但在另外一些研究中这两种方法测得的微生物生长速率差异较大［２０⁃２１］㊂我们建议最好将两种方法结合起来进行土壤微生物总活性研究，在条件无法满足时应优先考虑使用放射性亮氨酸标记法㊂醋酸盐是真菌麦角固醇合成的前体物质㊂尽管并不是只有真菌才能利用醋酸盐，但是麦角固醇却是真菌所特有的，是其细胞膜的重要组分㊂因此，可以通过分离并测定麦角固醇的放射性活度，排除其它微生物的影响㊂基于此，放射性醋酸盐标记法可用于测定真菌的生长速率㊂Ｐｅｎｎａｎｅｎ等在１９９８年首次使用这一方法研究土壤中真菌的生长速率［２２］，此后，该方法被广泛应用于此类研究中［２３⁃２５］㊂应用放射性同位素标记法测定土壤微生物总活性的传统方法不需要分离提取土壤微生物，而是直接向用蒸馏水制备的土壤悬浊液中施入放射性标记的前体物质㊂此后Ｂååｔｈ改进了这一方法，先将土壤中的微生物使用 混匀 离心 的方法提取出来，之后再进行放射性同位素标记［２６］㊂流程改进后可以有效地排除同位素标记物质被土壤颗粒吸附引起的干扰［６］㊂现在，胸腺嘧啶核苷和亮氨酸标记法一般采用Ｂååｔｈ改进的流程［２７］，但由于从土壤中提取真菌的效率较低，采用醋酸盐标记法研究土壤真菌总活性时一般采用不提取真菌的传统流程㊂不管采用传统方法还是Ｂååｔｈ改进的方法，在放射性同位素标记的前体加入之前都要将待测体系置于测试温度下稳定１０分钟左右；在施入放射性同位素标记的前体后，根据实验需要选择合适的孵育时间（一般Ｌｅｕ和ＴｄＲ标记法为１ ２小时；醋酸盐标记法为４小时左右）；孵育结束后向体系中加入适量５％的福尔马林，杀死微生物并终止反应；之后选用合适的方法提取相应的大分子物质（Ｌｅｕ标记法需提取蛋白质；ＴｄＲ标记法需提取ＤＮＡ；醋酸盐标记法则需要提取麦角固醇），并溶于ＮａＯＨ溶液［２８］；最后用液体闪烁仪测定相应大分子物质的放射性活度，并结合孵育时间计算微生物的生长速率［２６］㊂Ｒｏｕｓｋ等已经对放射性同位素标记法的应用案例做了较为详尽的总结［６］，我们在此不再赘述，仅对近年的研究做了一些简单补充（表１）㊂可以看出，该方法在农田㊁草地以及森林等主要陆地生态系统类型上都有着广泛的应用㊂如前所述，现在土壤细菌生长速率和活性研究多采用放射性亮氨酸标记法，仅有一个研究结合了放射性亮氨酸标记法和放射性胸腺嘧啶核苷标记法［２５］㊂为提高同位素标记法的检测效率和灵敏度，现在细菌生长速率的测定一般采用Ｂååｔｈ改进的操作流程；而因为从土壤中提取真菌难度较大，真菌的相关研究多采用传统操作流程的放射性醋酸盐标记法㊂应用放射性同位素标记法测定土壤微生物的生长速率和总活性有两个问题备受关注：一是该方法的测量结果能在多大程度上反映原位的状况？针对这一问题开展的研究表明，改变一些重要的环境条件，微生物仍然能够在数小时内维持其原有的生长速率不变，并且该方法的操作环节较易完成，一般对测定结果的影响很小［２６，３８⁃３９］，因此，其测定结果可以较为准确地反映土壤原位真实的微生物生长速率和总活性㊂第二个问题是，该方法能否特异性地测定土壤细菌或真菌的总体生长速率和总活性？研究发现，不管采用传统操作流程，还是采用Ｂååｔｈ改进的流程，ＴｄＲ或Ｌｅｕ标记法都能特异性地测定土壤细菌的生长速率和总活性［３９⁃４０］㊂由于麦角固醇是真菌所特有的，所以醋酸盐标记法测定真菌生长速率和总活性的特异性也较好㊂当然，应用放射性同位素标记法测定土壤微生物总活性也存在三个无法避免的缺陷㊂首先，放射性同位素可能会给待测微生物造成较大损害，从而影响测定结果㊂其次，该方法无法给出微生物的种类组成信息，只能得到较单一的土壤微生物总体生长速率结果㊂第三，微生物生长速率并不完全等价于微生物活性［５］，微生物生长速率能在多大程度上表征微生物总活性也是最值得关注的问题和研究课题㊂事实上，微生物活性由生长活性和非生长活性两部分构成，而微生物生长速率仅能反映微生物的生长活性㊂已有研究发现微生物在某些胁迫条件下会提高自身的非生长活性［４１］，而且土壤中的微生物绝大部分都处于非生长状态［４２⁃４３］，没有生长活性，只有非生长活性㊂因此，直接用微生物生长速率表征微生物活性有时会产生较大偏差㊂综上所述，放射性同位素标记法在测定微生物生长速率方面有较大优势，但作为微生物总活性的间接指标，由于其只能指示生长活性，存在较大的局限性㊂可以用于近似表征营养供应及其它环境条件良好㊁微生物生长活性占主导的土壤中微生物的总活性㊂３㊀ＲＮＡ直接表征法蛋白质是绝大多数生命活动的直接承担者，在翻译过程中，信使ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）是模板，转运ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）是搬运氨基酸的工具，核糖体ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）是构成翻译工厂的核心组件，它们与蛋白质合成关系极为密切，因此通过ＲＮＡ来反映微生物活性已成为一种重要的研究手段［５］㊂在微生物活性的研究中，ｍＲＮＡ常用于表征某一特定代谢过程的活跃程度，而ｒＲＮＡ可用于表征微生物总活性，也是本文讨论的重点㊂用ＲＮＡ测定土壤微生物总活性有其独有的优势：能同时获得微生物的代谢活性信息和活性微生物群落结构信息；不需要孵育过程，原位测定简单易行㊂因此该方法已经被广泛采用，２０１３年的评述论文报道当时已经检索到用该方法研究微生物总活性的报道１００余篇［５］㊂ｒＲＮＡ直接表征法测定微生物总活性有着坚实的理论基础和一定的实验依据㊂首先，ｒＲＮＡ是核糖体的核心组分，是蛋白质合成的催化中心，因此胞内ｒＲＮＡ的量与胞内蛋白质合成速率有着紧密的关系㊂其次，已有研究显示多种微生物胞内ｒＲＮＡ的含量与其生长速率㊁代谢活性有高度相关性［４４⁃４６］㊂再次，微生物的死亡和休眠往往伴随着ｒＲＮＡ的降解［４７⁃４８］，只有活性微生物中存在大量ｒＲＮＡ㊂早期的研究多测定ｒＲＮＡ的总量来表征微生物总活性，而现在多趋向于直接分析ＳＳＵｒＲＮＡ的拷贝数来表征微生物总代谢活性㊂这是因为微生物体内ＳＳＵｒＲＮＡ（核糖体小亚基ｒＲＮＡ）与ｒＲＮＡ总量有良好的线性相关关系，而且ＳＳＵｒＲＮＡ基因是微生物研究中应用最广泛的分子标记㊂通常１６ＳｒＲＮＡ用于表征土壤细菌和古菌总活性；１８ＳｒＲＮＡ则用于表征土壤真菌总活性㊂ＳＳＵｒＲＮＡ表征法测定微生物总活性的操作流程如下：（１）土壤样品采集；（２）土壤总ＲＮＡ和土壤总ＤＮＡ提取；（３）土壤总ＲＮＡ反转录；（４）实时荧光定量ＰＣＲ测定ＳＳＵｒＲＮＡ基因和ＳＳＵｒＲＮＡ的拷贝数；（５）通过克隆文库㊁末端限制性片段长度多态性（Ｔ⁃ＲＦＬＰ）㊁高通量测序等技术确定土壤活性微生物的群落组成㊂其中５㊀８期㊀㊀㊀车荣晓㊀等：土壤微生物总活性研究方法进展㊀６㊀生㊀态㊀学㊀报㊀㊀㊀３６卷㊀样品保存㊁ＲＮＡ提取及活性表征方式需要特别注意㊂１）样品的保存问题㊂相比基于ＤＮＡ的微生物生态学研究，用于ＲＮＡ研究的土壤样品的保存要求更为严格㊂通常要求样品在采集后即刻进行液氮速冻；在运输过程中无法实现液氮保存时，可用干冰冻存作为短期的替代选择；实验室内则要求－８０ħ冻存㊂此外，现在有很多试剂公司已推出ＲＮＡ保护液类产品，可抑制ＲＮＡ的合成和降解，实现常温下样品的短期保存㊂不当的保存方法可能引起ＲＮＡ降解，甚至导致试验失败，对此我们不做深入讨论㊂更为严重的是保存方法不当还会造成实验假象㊂过高的保存温度 例如简单的冷冻保存或常温保存 并不能完全阻止微生物体内ＲＮＡ的合成与降解㊂而通常样品保存的条件与土壤原位环境条件差异较大，这会导致测定时样品中的ＲＮＡ实际反映的是样品保存条件下的微生物活性状态，而非采样时土壤原位条件下的微生物活性状态㊂常见的实验假象有１６ＳｒＲＮＡ表征的活性细菌群落比１６ＳｒＲＮＡ基因表征的总细菌群落的种间亲缘关系更近，微生物总活性在各处理间无显著差异等㊂总结近期用ｒＲＮＡ直接表征法研究土壤微生物活性的报道（表２），结果显示用液氮或－８０ħ保存土壤样品时，活性微生物群落结构能反映试验处理间的差异，我们待发表的数据也证实增温会显著改变活性细菌的群落结构（土样为液氮保存）㊂在较高温度下保存土壤样品，则可能降低实验结果的可信度㊂例如，Ｍäｎｎｉｓｔö等研究积雪在不同月份对活性微生物群落的影响［４９］，五月份采集的土壤样品保存在４ħ，六月份的样品在环境温度下保存，结果发现五㊁六月份的土壤活性细菌群落结构差异较大㊂虽然作者在文中提及他们所采用的土壤保存方法不会影响用ｒＲＮＡ研究土壤细菌群落结构，但是我们很难辨别这种群落差异是不是因为样品保存方式不当所造成的假象㊂再如Ａｎｇｅｌ等调查沿降水梯度的活性微生物群落［５０］，仅用冰盒保存土壤样品，结果发现活性微生物群落结构仅在水分含量不同的土壤间表现出差异，但有理由怀疑温度的效应可能被不当的保存方法造成的假象所掩盖㊂表２㊀ＲＮＡ直接表征法测定土壤微生物总活性的主要应用案例Ｔａｂｌｅ２㊀ＳｏｍｅｓｔｕｄｉｅｓｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｕｓｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｂａｓｅｄｏｎＳＳＵｒＲＮＡ生态系统类型Ｔｏｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ参考文献ＲｅｆｅｒｅｎｃｅｓＤａｔａｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ活性微生物群落结构Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｔｙｐｅｓ样品保存方法Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓ数据表示方法Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｃｔｉｖｅｍｉｃｒｏｂｅｓ微生物总活性灌木林未涉及［４９］Ｓｈｒｕｂｌａｎｄ常温或４ħ未涉及季节因素影响大地点之间无差异灌木林未涉及［５０］Ｓｈｒｕｂｌａｎｄ冰盒未涉及仅在土壤含水量不同的小区间有差异森林Ｆｏｒｅｓｔ保护液ｇ－１土壤无差异无差异［５１］草地Ｇｒａｓｓｌａｎｄ－８０ħ未涉及差异显著未涉及［５２］森林Ｆｏｒｅｓｔ液氮ｎｇ－１ＤＮＡ未涉及无差异［５３］森林Ｆｏｒｅｓｔ液氮ｎｇ－１ｃＤＮＡ差异显著未提及［５４］２）土壤ＲＮＡ提取问题㊂土壤ＲＮＡ有多种提取方法，刘华等总结了包括Ｔｒｉｚｏｌ法㊁ＳＤＳ⁃Ｐｈｅｎｏｌ法和试剂盒法在内的多种方法［５５］㊂对于有机质含量较高的土壤，我们建议优先选择试剂盒法；若采用常规方法则需用核酸纯化柱去除杂质㊂所提取ＲＮＡ的质量多用１％的琼脂糖凝胶电泳检测，理论上会出现三条较亮的电泳条带，自上到下分别对应ＬＳＵｒＲＮＡ（核糖体大亚基ｒＲＮＡ）㊁ＳＳＵｒＲＮＡ和５．８／５ＳｒＲＮＡ，ｍＲＮＡ等则呈弥散状分布于ＬＳＵｒＲＮＡ条带下方㊂但实际上５／５．８ＳｒＲＮＡ条带一般不可见，故电泳图谱出现两条清晰条带即可证明ＲＮＡ提取是成功的（图１ａ）㊂由于在细胞内ＬＳＵｒＲＮＡ和ＳＳＵｒＲＮＡ的拷贝数之比为１，所以条带的亮度主要由片段的长度决定㊂因为２８ＳｒＲＮＡ长度为１８ＳｒＲＮＡ的２．４倍左右，所以真核生物中判别ＲＮＡ提取质量的另一方法是根据两个条带的亮度，第一条亮带的亮度达到第二条亮带的两倍即为成功㊂但２３ＳｒＲＮＡ与１６ＳｒＲＮＡ长度比一般在１．８左右，所以原核生物ＲＮＡ两个条带的亮度差异不是特别明显㊂此外，若在ＳＳＵｒＲＮＡ条带上方仍有条带出现则证明所提取的ＲＮＡ中混有残留的基因组ＤＮＡ（图１ｂ），需用ＤＮＡ酶消化去除㊂图１㊀土壤ＲＮＡ提取电泳图Ｆｉｇ．１㊀ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍｏｆｓｏｉｌＲＮＡ㊀ａ：正常的土壤ＲＮＡ电泳图；ｂ：有基因组ＤＮＡ残留的土壤ＲＮＡ电泳图３）活性表征的方式㊂推荐使用单位质量（一般为每克）干土中ＳＳＵｒＲＮＡ的拷贝数表征土壤微生物总活性，用ＳＳＵｒＲＮＡ与ＳＳＵｒＲＮＡ基因拷贝数的比值表征微生物的平均活性㊂有些研究用每纳克核酸中ＳＳＵｒＲＮＡ的拷贝数表征微生物总活性（表２），这种表示方法实际上反映的是土壤核酸的组成比例，与微生物活性关系不大㊂采用该指标并不合理，甚至可能会掩盖试验的处理效应，得出错误的结论㊂当然，用ｒＲＮＡ直接表征土壤微生物的活性也存在一定的风险［５］㊂首先，微生物胞内ＳＳＵｒＲＮＡ含量与微生物活性之间的量化关系还未完全确立，仅有的少数研究也发现这一量化关系在不同微生物之间有较大的差异［５，５６⁃５８］，因此在群落和生态系统尺度上是否有确定的关系还存在疑问㊂其次，尚未有研究确定微生物胞内ＳＳＵｒＲＮＡ含量是否与微生物的非生长活性相关，因此ＳＳＵｒＲＮＡ能否表征微生物总活性还需要进一步的试验验证㊂再次，因为土壤ＲＮＡ和ＤＮＡ一般是分别提取的，采用不同的方法体系，用ＳＳＵｒＲＮＡ与ＤＮＡ的比值表征微生物平均活性会因此产生不确定性［５９］㊂ＳＳＵＲＮＡ表征法在指示微生物总活性方面有很强的应用潜力，在表征活性微生物群落结构方面已有较为广泛的应用［６０⁃６１］㊂但一般认为该方法在微生物处于生长稳态时的使用效果最好，如果要应用于其他条件，则需要辅以其它验证性实验，以确立ＳＳＵｒＲＮＡ拷贝数与微生物总活性的关系㊂４㊀结论综上所述，土壤微生物呼吸测定法㊁放射性同位素标记法和ＲＮＡ直接表征法是基于不同的原理来指示土壤微生物总活性的，各有长处，同时也都有明显的缺陷（表３）㊂土壤微生物呼吸测定法非常适用于表征微生物总活性，但该方法的主要问题在于现存测定方法并不能真实反映微生物总的呼吸强度，但在通气性良好的土壤中，微生物呼吸方式大多为有氧呼吸，可以通过Ｏ２消耗速率近似反映微生物总活性；在微生物以有机碳作为最主要的能量来源时，ＣＯ２生成速率可以较好地反映微生物总呼吸㊂放射性同位素标记法测定的指标为生长速率，因此它适合于表征微生物的总体生长活性，也可在有利于微生物良好生长的环境中近似表征微生物总活性㊂在我国，由于放射性标记物质的购买㊁运输㊁环境释放和测定等受到极大的限制，该方法的生态学应用非常困难㊂ＲＮＡ直接表征法相比于前两种方法有明显的优势，它既能原位测定微生物总活性，又能提供微生物种类组成信息㊂但是，目前在实验证据上对它能否准确地反映土壤微生物总活性还存在疑问㊂在方法的选择上需要根据实际情况综合考量，确定合适的方法开展土壤微生物总活性研究；在条件允许的情况下，建议将几种方法组合使用㊂表３㊀三种土壤微生物活性研究方法的比较Ｔａｂｌｅ３㊀Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｒｅｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎｇｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ研究方法Ｓｔｕｄｙｍｅｔｈｏｄｓ土壤微生物呼吸测定法Ｓｏｉｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ放射性同位素标记法ＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅｉｓｏｔｏｐｅｌａｂｅｌｌｉｎｇＲＮＡ直接表征法ＲＮＡｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｓ基本原理Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ生命活动的能量来源生长速率蛋白质合成原位测定Ｉｎｓｉｔｕ否否能种类组成信息Ｓｐｅｃｉｅｓｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ否否能主要问题Ｍａｉｎｉｓｓｕｅｓ已有的测定方法并不能真实反映微生物呼吸速率只能反映生长活性与微生物活性的关系缺乏足够的实验证据支持７㊀８期㊀㊀㊀车荣晓㊀等：土壤微生物总活性研究方法进展㊀。
生物膜微生物活性的测定
生物膜微生物活性的测定(TTC-DHA)法在本课题研究中，生物膜微生物的活性通过氯化三苯基四氮唑(TTC)-脱氢酶活性测定法进行。
利用氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride ，TTC；Shanghai Reagent Co., Ltd, Shanghai, China)的还原性产物TTC-甲瓒(TF)的量，来表示微生物的活性。
一、生物膜样品的制备取10g载体生物膜，用蒸馏水润洗2次，置于锥形瓶中，用玻璃珠剧烈摇动将生物膜打碎，用生理盐水20mL稀释，用玻棒搅动，使成悬液，备用。
二、主要仪器和试剂氯化三苯基四氮唑( TTC)-葡萄糖标准溶液:TTC分析纯0.1 g与葡萄糖l g共溶于100 mL蒸馏水中，棕色试剂瓶保存；甲苯(分析纯)；三氯甲烷(分析纯)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCI缓冲溶液，pH值为8．6；其它：硫化钠。
三、标准曲线的制作在分液漏斗中依次注入l，2，3，4，5，6 mL浓度为l g ·L-1 TTC-葡萄糖标准溶液，2 mL Tris-HCI缓冲溶液及lmL 10％Na2S新配溶液,摇匀；待溶液充分显色后，准确加入甲苯溶液5mL，振摇，完全提取TF。
放置片刻；待溶液分层后，取有机溶液层, 移至lcm比色皿中,稳定2 min用752紫外分光光度计在波长485nm处，测对应的吸光度(A)值，对脱氢酶活性作图，以试剂空白作对照，绘制标准曲线。
四、生物膜脱氢酶活性测定取生物膜制备液2mL于带塞试管中，依次加入Tris-HCl缓冲液、0.1 mol ·L-1葡萄糖液、0.5％TTC各2 mL，置入37±1℃恒温箱中培养6 h后取出，加2滴浓硫酸终止反应，准确加入5 mL甲苯，振摇，在4000 rpm下离心5 min，取有机溶剂层比色。
在上述条件下，将1h产生1µgTF的量为1个酶活力单位。
微生物量碳和酶活性的测定
微生物量碳测定（此指标是反映土壤中微生物总量---群落大小的一个指标）称取经前处理相当于20-g烘干基的新鲜土样，盛装在50ml的烧杯中，放置于真空干燥器中，并放置盛有去乙醇的氯仿（约2/3烧杯）的50ml烧杯1只，烧杯内放入少量沸石(洗净烘干的瓷片，0.5mm大小)，用真空泵抽空使氯仿沸腾5分钟，关闭真空干燥器阀门，在室温避光下熏蒸24小时。
熏蒸24小时结束后，打开干燥器的阀门，取出盛装有氯仿的烧杯，然后用真空泵抽空3-4次（每次抽真空后应慢慢的打开阀门），使渗透到土样中的氯仿全部被排除。
熏蒸结束后将土样转移到250ml的三角瓶中，三角瓶中加入80ml 0.5M K2SO4溶液震荡1小时，用中速定量滤纸过滤，并收集滤液。
重复两次。
过滤时添加空白2个。
提取液应立即分析，或在－18℃下保存。
在熏蒸的同时，称取另外两份鲜土样直接加入80ml 0.5M K2SO4溶液震荡1小时，后过滤收集滤液。
重复两次。
过滤时添加空白2个。
注意，低温（－18℃）下保存的土壤提取液，解冻后会出现一些白色沉淀，不必除去，但取样前应充分摇匀。
提取液中的碳用总碳分析仪测定。
（稀释20倍—吸取2.5ml到50ml容量瓶，上机。
）试剂准备：氯仿；硫酸钾。
标准曲线：0 0.5 1 3 5微生物生物量碳(Bc) 用下面公式计算:Bc = Fc/ Kc。
式中Fc为熏蒸与不熏蒸土壤在培养期间CO2 的释放量的差值,Kc为熏蒸杀死的微生物量中的碳在培养过程中被分解,并以CO2 释放出来的比例, 目前一般都采用0. 45。
(一般用K2Cr2O7氧化法测定有机碳, Kc为0. 33～0. 38; TOC分析仪测定, Kc一般为0. 45 )酶活性的测定包括脱氢酶（Dehydrogenase），脲酶（Urease），精氨酸水解酶，碱性磷酸酯酶，β-葡萄糖酶等。
脲酶（Urease）和精氨酸水解蛋白酶（N-a-benzoyl-L-argininamide, BAA）活性的测定。
菌种活力测定方法
菌种活力测定方法
1.1活力管的制备
1.1.1称取脱脂奶粉11克加入89毫升蒸馏水，搅拌10-15分钟使之充分溶解，溶解后静置一小时后用双层纱布过滤，除去不溶物。
然后将溶液分装试管10毫升，盖上塞子密封。
采用间歇三次灭菌：第一次灭菌90-95℃水浴灭菌20分钟，取出自然冷却至室温然后放置于4-6℃冰箱保存。
第二天进行第二次灭菌，方法同第一次灭菌，取出自然冷却至室温然后放置于4-6℃冰箱保存。
第三天进行第三次灭菌，方法同第一次灭菌，取出自然冷却至室温然后放置于4-6℃冰箱保存备用。
1.1.2脱脂奶粉溶液要求：比重1.033-1.034；酸度≤200T；温度为20℃.
1.2活力测定：
1.2.1接种：接种前将活力管预热至37℃，在灭菌的活力管中加入3%的发酵剂。
接种操作要求在超净台完成，操作过程为无菌操作，使用接种吸管必须经过灭菌。
1.2.2发酵：在恒温37℃进行发酵培养3.5小时。
1.2.3测酸：发酵培养3.5小时后，立即取出活力管进行酸度测定。
用移液管移取10ml样品至100ml三角瓶中，用20ml纯净水将移液管润洗干净后，一并倒入100ml三角瓶中，加入3滴0.5%酚酞，开始滴定。
用0.1 mol/mlNaOH标准溶液滴定至微红色，并在30秒内不退色。
消耗的0.1 mol/mlNaOH标准溶液毫升数乘以10，即为酸度。
1.2.4计算：菌种活力=0.087×消耗氢氧化钠毫升数。
一般菌种活力要求在0.6
以上。
1.2.5其他要求：氢氧化钠标准液=0.1N (N保留第四位小数，要求在0.0995-0.1005范围）。
微生物酶活性试验方法
微生物酶活性试验方法脱氢酶活性测定方法参考：【周春生, 尹军. 一脱氢酶活性检测方法的研究[J]. 环境科学学报, 1996, 4: 400-405.】以及【环境工程微生物检验手册[M]. 中国环境科学出版社, 1990.】（一）试验方法：（1）水样预处理：取污泥混合液10ml，放入离心管中离心5min后去除上清液，用纯水反复清洗三次，最后向样品中加入纯水至10ml搅拌均匀。
（2）加试剂：将处理后样品转移至25ml比色管中，依次加入7.5mlTris-HCl 缓冲液（PH=8.4）、2.5ml硫酸钠溶液（0.36%）、2.5ml纯水以及2.5mlTTC溶液（0.4%）、混匀。
（3）样品培养：将比色管置于37℃条件下水浴恒温振荡器中培养，培养5min 后吸取5ml于离心管内，加0.5ml甲醛固定以作样品空白；（4）终止酶反应：继续培养30min，然后向管中加入2ml甲醛终止酶反应；（5）样品萃取：将样品培养液以5.5ml为1份分装在四个离心管中，连同样品空白对照管一道离心5min, 弃去上清液向各离心管内加6ml丙酮, 研磨搅拌混合, 于37℃条件下萃取TF10min后；（6）比色分析：将萃取液进行离心5min,用1cm的比色皿取上清液显色液, 于波长485nm处进行比色, 记录吸光值,根据样品显色液与样品空白的吸光值之差, 查标准曲线, 进而计算出TF的生成速度, 即脱氢酶活性(mg/(L*h))（二）试剂：（1）0.4％三苯基四氮唑氯化物溶液（氯化三苯基四氮唑，TTC）:4g-2、3、5-氯化三苯基四氮唑，稀释至1L至容量瓶中，棕色瓶保存；（2）Tris-HCl缓冲液：称取6.057g Tris（三羟甲基氨基甲烷, 分析纯, 北京化学试剂厂），加入20ml 1mol/L HCl溶液, 再定容至1L；（3）硫酸钠溶液（0.36%）：3.6g硫酸钠（Na2SO3）稀释至1L容量瓶中；（4）TTC标准溶液：称取0.05gTTC定容与50ml茶色容量瓶中此溶液即为1mg/L的标准溶液。
实验报告微生物的酶活性实验
实验报告微生物的酶活性实验实验报告：微生物的酶活性实验摘要：酶是生物体内一种特殊的蛋白质催化剂，能够加速生物反应的进行。
本实验旨在探究不同微生物对于葡萄糖的酶活性差异，并通过测定酶活性的指标来比较微生物的酶活性。
1. 引言酶是一类高效的催化剂，能够加速化学反应的进行，常见于各种生物体内。
微生物作为一类广泛存在的生物体，其内部是否含有酶并且酶能够发挥的活性如何，对于科研人员来说是一个有趣且重要的课题。
本实验将通过测定微生物对于葡萄糖的酶活性，进一步了解微生物的代谢能力。
2. 实验材料与方法2.1 实验材料- 葡萄糖底物- 不同微生物样品- 甲基红指示剂- 葡萄糖酶提取液- 盐酸2.2 实验方法2.2.1 微生物培养将不同微生物样品分别接种在培养基上，经过一定时间的培养，待微生物充分生长后，可进行下一步操作。
2.2.2 酶提取取适量微生物样品，加入适量生理盐水进行均匀悬浮，离心后获取上清液，作为酶提取液备用。
2.2.3 酶活性测定取适量葡萄糖底物溶液，加入甲基红指示剂，并分别加入微生物样品的酶提取液，混匀后加入适量盐酸停止反应。
最后通过测定反应液的吸光度来计算酶活性。
3. 结果与讨论经过实验操作，我们得到了微生物样品A、B、C的酶活性数据如下：微生物A：酶活性=0.14微生物B：酶活性=0.08微生物C：酶活性=0.12从实验结果可以看出，微生物A的酶活性最高，而微生物B的酶活性最低。
这说明微生物A在代谢葡萄糖过程中具有更高的催化效率，而微生物B相对较低。
微生物C的酶活性介于微生物A与微生物B之间。
进一步讨论可以考虑酶的生物学特性，比如酶的结构、活性中心以及微生物的生理特点等因素。
酶活性的差异可能是由于这些因素导致的。
此外，也可以针对不同环境因素对微生物酶活性的影响进行研究，探究酶活性的调控机制。
4. 结论通过实验测定不同微生物样品对葡萄糖的酶活性，我们发现微生物A的酶活性相对较高，微生物B的酶活性相对较低，微生物C的酶活性介于两者之间。
活力测定实验报告
一、实验目的1. 了解活力测定的基本原理和方法。
2. 掌握不同活力测定方法的操作步骤。
3. 通过实验，学会运用活力测定方法分析生物样品。
二、实验原理活力测定是研究生物样品中酶、微生物等生物活性的一种方法。
实验中，通过加入特定底物，使生物样品中的活性成分发挥作用，从而产生一系列可检测的产物。
根据产物的变化，可以计算出生物样品的活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：酶、微生物、底物、缓冲液、指示剂等。
2. 仪器：恒温水浴锅、分光光度计、离心机、移液器、试管等。
四、实验方法1. 酶活力测定（1）实验原理：酶催化底物反应，产生可检测的产物。
通过测定产物浓度，计算出酶的活力。
（2）实验步骤：① 准备酶液、底物、缓冲液等。
② 将酶液、底物、缓冲液混合，置于恒温水浴锅中反应。
③ 反应结束后，取出反应液，测定产物浓度。
④ 根据产物浓度和反应条件，计算出酶的活力。
2. 微生物活力测定（1）实验原理：微生物在一定条件下，能够利用底物进行代谢，产生可检测的产物。
通过测定产物浓度，计算出微生物的活力。
（2）实验步骤：① 准备微生物培养液、底物、缓冲液等。
② 将微生物培养液接种到含有底物的培养基中。
③ 在适宜的温度和pH条件下培养微生物。
④ 收集培养液，测定产物浓度。
⑤ 根据产物浓度和培养条件，计算出微生物的活力。
3. 活力测定方法比较（1）实验原理：比较不同活力测定方法的优缺点，选择合适的测定方法。
（2）实验步骤：① 分别采用不同的活力测定方法对同一生物样品进行测定。
② 比较不同方法的测定结果，分析优缺点。
五、实验结果与分析1. 酶活力测定结果根据实验数据，计算出酶的活力。
分析酶活力与底物浓度、温度、pH等条件的关系。
2. 微生物活力测定结果根据实验数据，计算出微生物的活力。
分析微生物活力与底物浓度、温度、pH等条件的关系。
3. 活力测定方法比较结果比较不同活力测定方法的优缺点，分析适用范围。
六、实验结论1. 酶活力测定方法适用于测定酶的催化活性。
基于 3H 放射性同位素的微生物活性的测定
基于3H 放射性同位素的微生物活性的测定以3H -亮氨酸作为水体环境样品的培养底物，通过测定用于合成微生物细胞生物量中的3H -亮氨酸的放射性，来计算水体环境微生物生物量碳周转速率，以此衡量微生物活性或生长速率[1]。
每个水体样品，均进行三个技术重复。
在1.5mL 的水中加入20 μL 放射性每分钟衰变数（disintegrations per minute）为5×104 dpm 的3H -亮氨酸溶液，并在采样时的原位温度下孵育 2 h。
加入100 μL100％三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA，终浓度为 6.25％v / v TCA）终止孵育过程。
该实验设置了非生物对照组，向 2 mL 离心管中加 1.5 mL 水，然后立即加入100 μL 100％的TCA（终浓度为 6.25％v / v TCA）用于灭活微生物，并加入与实验组相同剂量的3H -亮氨酸，将样品保存在4 ℃，待分析。
将培育过后的水体样品，10300 rpm 离心15 min，使水样中的微生物细胞沉降至离心管底部，弃上清液。
为了将吸附于细胞表面的3H-亮氨酸洗出，加入1mL 5% TCA 溶液，混匀，在离心机上10300 rpm，离心5 min，弃上清液。
加入1 mL 80% 乙醇，充分混匀后，在离心机上10300 rpm，离心5 min，弃上清液，打开离心管盖子，然后置于通风橱过夜，风干残留的乙醇。
在离心管中加入 1.75 mL 荧光剂(Ultima Gold™, Perkin Elmer)，充分混匀后，用Beckman LS-6500 液体闪烁计数器（Beckman, Fullerton, CA）测量其放射性。
通过蛋白质的合成代谢速率来衡量微生物生物量的代谢速率，将亮氨酸（蛋白质标记物）作为蛋白质标记物用作中间转化量来进行计算，基于此计算公式[1]：其中，细胞中3H -亮氨酸的量可以根据测定的细胞放射性（dpm）与亮氨酸的量（每nM 3H -亮氨酸的放射性为1.33×108dpm）之间的关系式算出。
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活性测定
一、测定方法
分离出的单菌落后，用打孔器在单菌落上打取菌落块儿分别将菌落块儿以菌落面向上的方式放置在已经涂布有大肠杆菌的平板上，培养48小时后测量抑菌圈的直径。
二、测定结果及分析
根据平板上色素的有无和抑菌圈的有无可将实验得到的放线菌分为三种：产黑色素和抗生素的放线菌、只产黑色素的放线菌和既不产黑色素又不产抗生素的放线菌。
1.产黑色素和抗生素的放线菌
由图可知，此种放线菌对大肠杆菌的抑菌圈直径在13mm左右，具有比较强的抑菌作用。
并且在产生抗生素的同时产生了黑色素。
2.只产黑色素的放线菌
由实验结果初步判定该菌株为只产黑色素的放线菌。
但是经分析也有可能是实验过程中，与测定第一种放线菌所用的大肠杆菌不同，
大肠杆菌可能产生了抗药性，才会导致没有抑菌圈的出现。
所以有“此菌株与第一种放线菌是相同”的猜想，需要后续鉴定过程鉴定。