细胞的传代培养
细胞的传代培养和细胞计数法
人癌细胞系传代培养
• 1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染； • 2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体； • 3. 漂洗：加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消 •
化液； 4. 消化：再加 1ml 消化液漂洗 1 次 , 倒掉大部分消化液 , 保留约0.3ml,室温放置3～5min； 5. 吹打：镜下看到细胞收缩变园 , 加 1 ～ 2ml 含血清培 养液, 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫； 6. 计数：取样,计数,调整细胞浓度； 7. 接种及培养：按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 ，饱 和湿度条件下培养。
细胞活力测定－台盼蓝染色法
• 制备单个细胞悬液：105～106／ml • 染色：0.04%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液 • •
＋1滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数 计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染 料拒染）和死细胞（呈淡蓝色） 计算细胞活力： 活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋ 死细胞数）］×100
© ¨X 104£ Cell number£
M3SP2 M3SP2-pBp M3SP2-PTEN
2 3 4 5 6 Days in culture
7
8
DT = t × lg2 ÷ (lgNt－lgNo)
培养细胞的纯化方法
• • • • • • • •
机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞 差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞 选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞 密度梯度离心法：细胞漂浮密度， Ficoll, Percoll 克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法 免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠 速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术 电泳分离法：细胞表面电荷
细胞传代培养和原代培养
细胞传代培养和原代培养一：原代细胞培养(一)原理：细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。
由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。
原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。
一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
(二)操作：1．取材：用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。
然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
用消过毒的剪刀剪开用和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。
置于无菌平皿中。
2．切割：用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。
移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
3．消化、接种培养：吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。
(三)结果:细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。
二：传代细胞培养(一)原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞的原代培养和传代培养
实验五细胞的原代培养和传代培养1. 实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。
2. 实验指导细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。
进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。
细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。
所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。
原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。
一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。
传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。
细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。
培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。
将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。
要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、生长因子等也至关重要。
此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。
贴壁细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。
加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。
但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。
常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。
二者可分别使用，也可共同使用。
钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。
细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增3～6次。
细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。
传代培养法
传代培养法是一种细胞培养技术，用于将原代细胞转化为可反复传代的细胞系。
这种方法的步骤如下：
1. 原代细胞适应阶段：原代细胞从组织中分离出来后，需要经过适应阶段以适应该培养环境。
在此期间，细胞逐渐适应贴壁生长，并逐渐分裂增殖。
2. 传代阶段：当原代细胞生长到一定阶段后，需要进行传代。
传代是将原代细胞接种到新的培养液中，以继续增殖生长。
传代过程中需要注意细胞的生长状态和密度，以避免过度生长或污染。
3. 维持培养：传代后的细胞系需要继续培养，以维持其生长和增殖。
在此过程中，需要定期更换培养液，以避免代谢产物的积累和细菌污染。
4. 细胞冻存：为了保持细胞的活力和稳定性，需要进行细胞冻存。
细胞冻存是将细胞保存在低温下，以延长细胞的寿命并保持其遗传稳定性。
传代培养法是一种常用的细胞培养技术，可以用于原代细胞的扩大培养和细胞的遗传稳定性研究。
同时，传代培养法还可以用于制备疫苗、基因治疗和组织工程等领域。
实验五 细胞的传代培养
实验5 细胞的传代培养一、实验目的熟练掌握动物细胞的传代培养法。
二、实验原理哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。
当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。
传代培养可获得大量细胞供实验所需。
三、仪器、材料与试剂1仪器CO2培养箱，倒置显微镜，超净台2材料培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。
3试剂完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。
四、实验步骤1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。
2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
将培养用液置37℃下预热。
3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。
4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。
5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。
6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
7.倒掉培养细胞的旧培养基。
酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。
8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。
注意勿使细胞提早脱落入消化液。
9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。
盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。
可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。
五、注意事项1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。
所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。
每次最好只进行一种细胞的操作。
细胞培养—传代—冻存—western blot等实验相关步骤
围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结实验一：细胞传代培养材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10%FBS 的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（SKOV-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10%FBS的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。
3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长，以免损伤细胞）。
4、往培养瓶中加入1640 1~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。
5、弃上清液，加入少量10%FBS的1640培养基使成细胞悬液。
6、分装，按1:2~3传代，每瓶4~5ml。
倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形，细胞间隙等距），标记。
7、放入CO2培养箱中培养，第二天观察生长状况。
总结：1、在用离心机时，看清楚是RCF还是RPM；调节Temp.以及Time。
2、在用移液枪吸出trypsin充分消化后的细胞后，须知用少量培养液清洗一下培养瓶，并将清洗液移入离心管中。
3、每取用一个容器，拧开或者拧上盖子时，注意在酒精灯上旋转一圈。
另外，记住用酒精棉球经常擦拭台面。
4、在用移液枪或者吸管混匀细胞悬液过程中，动作轻柔，避免产生气泡等。
实验二：细胞冻存材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、冻存管、RPMI —1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、FBS、PBS、trypsin、DMSO等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（OVCAR-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；FBS、RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
细胞传代培养实验步骤
细胞传代培养是生物学研究中常用的实验技术，用于保持细胞系的稳定性和活力。
以下是细胞传代培养的一般步骤：
培养基准备：准备适当的培养基，包括生长因子、营养物质和抗生素（如果需要）。
确保培养基的配制符合细胞系的特殊需求。
细胞检查：使用显微镜检查细胞的形态、数量和健康状态。
确保细胞处于适当的生长状态，没有受到感染或其他异常。
细胞收获：从之前的培养瓶中将细胞收获下来。
这通常涉及用胰酶等酶类来解离细胞，使其从培养瓶表面脱离。
细胞计数：使用血球计数板或自动细胞计数仪等工具，计算细胞的数量。
这有助于确定传代时应该用多少细胞。
传代操作：将收获的细胞按照既定的比例重新分配到新的培养瓶中。
传代的目的是dilution 细胞，以确保它们能够继续健康地生长。
培养新的细胞群：将传代后的细胞放入培养箱中，提供适当的环境条件（温度、湿度、CO2浓度等），促使细胞继续生长。
观察细胞生长：在培养过程中，通过定期使用显微镜观察细胞的形态和生长状态。
确保它们没有发生异常变化。
培养基更替：根据需要，定期更换培养基，以提供新的营养物质和保持适当的环境条件。
细胞冻存（可选）：如果需要，可以将一部分细胞冻存起来，以备将来的实验使用。
冻存细胞是为了防止细胞系的丧失或污染。
以上步骤是一般细胞传代培养的基本流程，具体操作可能会根据不同的细胞系、实验目的和实验室条件而有所调整。
在进行实验前，请确保你了解所使用细胞系的特性和培养条件。
细胞传代的过程及注意事项
细胞传代的过程及注意事项
细胞传代是细胞培养中最常见的操作，它是将已经在体外培养的细胞
放置到新的培养基中，继续生长繁殖的一种方法。
传代的过程一般包括准
备培养基、细胞膜解析、细胞数量细胞的复制、再次放置细胞、监测细胞
增殖等步骤。
1、培养基的准备：通常，将培养基煮沸后冷却至室温，加入必要的
抗生素和其他物质后进行搅拌均匀。
2、细胞膜解析：将要传代的细胞用叉子放入悬浮于培养液中，再加
入过氧化氢酶以解析细胞膜，具体方法是将培养基中的细胞分散成一个单层，逐步加入过氧化氢酶直到达到细胞解析的程度。
3、细胞数量细胞的复制：将细胞数量复制到前面所预定的细胞比例，使细胞保持初始比例，为传代提供有利条件。
4、再次放置细胞：将复制完成的细胞液再次放置在新的培养基中，
细胞培养室中的空气湿度和温度都必须维持在合适的范围，使细胞繁殖进
行得顺畅。
5、监测细胞增殖：在每次传代后，一定要记录下新培养基中细胞的
数量、形态和其他特征，以便确定新培养基的质量。
细胞传代培养实验报告
细胞传代培养实验报告一、实验目的。
本实验旨在探究细胞传代培养的方法和技巧，以及观察细胞在不同代数下的生长情况和形态变化，为细胞生物学研究提供实验数据和参考。
二、实验材料和方法。
1. 实验材料，培养皿、培养基、细胞传代培养液、显微镜等。
2. 实验方法：a. 将细胞传代培养液均匀涂抹在培养皿上；b. 将待传代的细胞悬浮液加入培养皿中；c. 放入培养箱内，控制好温度和湿度；d. 每隔一定时间观察细胞的生长情况和形态变化。
三、实验结果。
经过连续传代培养，我们观察到细胞在不同代数下的生长情况和形态变化。
随着传代次数的增加，细胞的数量逐渐增多，细胞形态也发生了一定的变化。
初代细胞呈现出较大的细胞体积和规则的形态，而随着传代次数的增加，细胞体积逐渐减小，形态也变得不规则起来。
四、实验分析。
细胞传代培养是细胞生物学研究中常用的实验方法之一，通过连续传代培养可以观察到细胞的生长情况和形态变化，为细胞的生物学特性和行为提供了重要的数据。
在实际应用中，细胞传代培养也被广泛应用于细胞培养、细胞生长动力学研究、细胞毒性试验等领域。
五、实验结论。
通过本次实验，我们成功地进行了细胞传代培养实验，并观察到了细胞在不同代数下的生长情况和形态变化。
细胞传代培养是一项重要的实验方法，对于细胞生物学研究具有重要的意义。
六、实验总结。
细胞传代培养是细胞生物学研究中的重要实验方法，通过本次实验，我们对细胞传代培养的方法和技巧有了更深入的了解，也为今后的细胞生物学研究提供了重要的实验数据和参考。
七、参考文献。
1. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science; 2002.2. Freshney R. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 5th edition. New York: Wiley-Liss; 2005.以上为本次实验的全部内容，感谢各位老师和同学的关注和支持。
细胞的传代培养
细胞的传代培养细胞的传代培养是指在体外将原始细胞（母代细胞）分离，以无菌技术进行培养，继续增殖后得到后代细胞（子代细胞）的过程。
这种细胞培养是细胞研究和药物开发中必需的基础方法。
细胞传代培养的过程需要严格控制培养条件，使得细胞能够在最适宜的环境中不断增殖和分裂。
细胞传代培养的难点不仅仅是掌握基本操作技巧，更重要的是要了解细胞的特性以及培养条件对细胞的影响。
在细胞的传代培养中，常见的问题包括细胞老化、细胞突变、感染等，因此，必须加入合适的应对措施。
首先要获得要培养的细胞，可以从正常的组织、肿瘤、胚胎等来源中获得。
将取得的组织切成小块，然后将其浸泡在含有酶的溶液中消化。
消化后的细胞经过筛选，得到单个的细胞，可以进行传代培养。
在细胞传代培养的过程中，分为以下几个步骤：1.细胞初始移植将细胞接种至培养基中并放回培养箱中，为新的细胞层提供养分。
2.准备接种的细胞通常包括细胞的检测、数目、结构和活性等，确保细胞品类和纯度。
取出细胞液，加入培养基中，使细胞平均分散。
4.培养培养箱的温度和CO2的含量等环境参数都十分重要，必须要经过细致的调整。
5.观察细胞会否暴增或减少若出现这种情况，必须采取适当的措施，如调整培养条件等。
6.进行传代培养在细胞开始分化时，必须加入新的培养基和胶原酶，以保证细胞的持续增殖。
1.培养温度细胞对温度的敏感性非常高，必须要严格控制温度以保证细胞的正常生长。
大多数细胞对温度的要求在37℃左右，但有些细胞对温度的敏感度更高，需要在低于37℃的条件下培养。
培养基中的营养物质和其他成分会影响细胞的生长和分裂，其中最为关键的部分是细胞营养。
潜在的毒性和细菌感染也是需要注意的因素，所以不可盲目选用培养基。
3.CO2含量CO2的含量是细胞需求的重要生长因素，适当的CO2浓度可以促进细胞的增殖和多种生物化学反应。
对细胞而言，CO2含量的改变会对胞内平衡产生重要的影响，从而对细胞的生长和存活产生不同的影响。
细胞传代培养的步骤
1.准备试剂和培养基：确保DMEM或其他基础培养基、胰酶、完全培养液（含
血清和必要的添加剂）以及PBS等试剂准备就绪。
2.观察细胞状态：在显微镜下检查细胞密度、生长状态和健康状况。
如果细胞
长满至80%~90%，且看起来健康、有活力，则可以进行传代。
3.消化细胞：向培养瓶中加入适量的胰酶溶液，使细胞被充分覆盖。
消化时间
根据细胞类型和培养条件有所不同，通常为1至3分钟。
4.终止消化：加入完全培养液终止消化过程。
这有助于将细胞从消化液中悬浮
起来。
5.离心处理细胞：将细胞悬液在1500至1000 rpm下离心，以收集细胞。
6.调整细胞悬液：弃去上清液，用新鲜培养液重悬细胞。
7.计数和接种细胞：使用细胞计数板对细胞进行计数，并根据所需密度调整细
胞悬液体积。
8.接种细胞：将细胞悬液加入新的培养瓶中，每个瓶中的细胞数量应适当，以
避免过密或过稀。
9.培养和观察：将培养瓶放入培养箱中，定期观察细胞生长和状态，确保它们
健康且生长良好。
细胞的传代培养
潜伏期 停滞期
指数增长期
细胞的传代培养操作
1、悬浮细胞
可采用加入等量新鲜培养基后直接吹
打分散进行传代，或用离心法后，加入新
培养基后再吹打分散进行传代 2、贴壁细胞（重点）
贴壁细胞传代培养过程
1、实验准备：细胞培养用的器材灭菌、超净工作 台准备、试剂预温、操作人员准备。
2、倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的PBS缓冲 液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的 碎片和培养液。 3、加入500ul胰蛋白酶消化液，37℃恒温箱消化 30s，拍打瓶底，将贴壁的细胞拍落，可观察到液 体变混浊（注意避免过消化）。
培养细胞一代生长过程
（一）潜伏期（Latent phase）： 细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段 时间。
（二）指数生长期：
细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞 分裂指数（Mitotic index，MI）表示， 即细胞群中每 1000 个细胞中的分裂相数。
体 外 培 养 细 胞 分 裂 指 数 介 于 0.10.5% ，且受细胞种类培养液成分、 pH 、 温度等影响。
细胞的传代培养
细胞传代培养
概念：培养的细胞由于细胞增殖，数量增加，细 胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，将培 养的细胞分散，以1:2或l:3以上的比率转移到另 外的容器中进行培养，即为传代培养，也叫做继 代培养。传代的频率与接种细胞数量、细胞生物 特性以及营养液的性质等有关。 一般细胞可传代10-50代。 所谓细胞“一代”，即从细胞接种到分离再培养 的一段时间。它与细胞的世代或倍增不同。在细 胞的一代中，细胞能倍增3~6次。
养液，并在培养瓶上做好标记，注明代号、
日期，轻轻摇匀，37 ℃恒温培养箱培养。
细胞传代培养原理
细胞传代培养原理
细胞传代培养是一种将细胞在体外不断分裂和繁殖的方法。
它的原理基于细胞的特性和增殖机制。
首先，细胞传代培养需要一种培养基，其中包含了细胞生长所需的营养物质和生长因子。
细胞在培养基中可以吸收这些营养物质，并利用它们进行新的细胞的合成和生长。
然后，细胞在培养基中需要提供适当的环境条件。
温度、湿度和气体组成等因素对细胞的生长和繁殖至关重要。
一般来说，细胞传代培养需要在恒定的体温下进行，通常为37°C。
此外，细胞还需要适当的气体组成，例如5% CO2和95%空气的混
合物，以提供细胞所需的氧气。
在传代培养中，细胞会经历一系列的生长和分裂过程。
当细胞数目增加到一定程度时，细胞会停止生长并进入分裂阶段。
在细胞分裂过程中，细胞会将自身的遗传信息复制，并通过细胞分裂将这些信息传递给下一代细胞。
这样，新的细胞就会生成，并继续进行生长和分裂。
细胞传代培养的目的是获得大量的同一类型的细胞。
通过每一代细胞的分裂和繁殖，可以得到足够数量的同质细胞，用于后续的实验研究。
细胞传代培养的成功与否取决于细胞的生长状态、培养条件和培养器具的选择等因素。
总之，细胞传代培养通过提供适当的培养基和环境条件，使细胞能够不断进行生长和分裂，从而实现大量同质细胞的获取。
传代培养的注意事项
传代培养的注意事项传代培养是细胞生物学实验中常用的方法之一，用于维持和繁殖细胞株。
在进行传代培养时，有一些注意事项需要遵守，以确保细胞的健康和稳定生长。
以下是传代培养的一些重要注意事项。
1. 无菌操作：在进行传代培养之前，必须进行彻底的无菌操作，以避免细胞受到细菌、真菌或其他微生物的污染。
在进行培养操作前，应该使用消毒剂擦拭工作台面，并穿戴好相应的个人防护装备，如实验手套和口罩。
2. 培养皿和培养物质的选择：在进行传代培养时，应选择适当的培养皿和培养物质。
常见的培养皿有培养瓶、培养皿和多孔板等。
培养物质主要包括培养基、培养液和培养辅助物质。
根据细胞类型和特殊要求选择合适的培养皿和培养物质。
3. 细胞密度的控制：在进行传代培养时，要注意细胞的密度控制。
细胞密度太高会导致细胞过度接触和竞争，从而影响细胞生长和增殖。
细胞密度太低则会增加传代消耗的时间和工作量。
根据细胞的生长速率和传代的目的，确定合适的细胞密度。
4. 传代的时间点：传代时应选择合适的时间点。
细胞应在处于活跃的生长期进行传代，一般选择细胞达到对数生长期时进行传代。
此时，细胞的代谢活跃，增殖能力强，对培养环境的适应能力也较强。
5. 传代的方法：常见的传代方法有机械传代和酶消化传代等。
机械传代是通过离心去除培养基，然后用细胞分离剂或刮棒等工具将细胞从培养皿上分离下来。
酶消化传代是使用相应的消化酶将细胞与培养皿分离。
选择合适的传代方法，并根据细胞类型和需要进行操作。
6. 培养条件的控制：在进行细胞传代培养时，要注意细胞的培养条件。
包括培养基配方的控制，培养基温度和pH值的调节，培养皿存放位置和通气情况的控制等。
这些因素直接影响细胞的生长和繁殖，应根据具体要求进行调节和控制。
7. 传代次数的控制：每个细胞株都有一定的传代次数限制，超过限制次数后细胞会发生衰老和突变，影响其生长和功能。
因此，在进行传代培养时应注意记录传代的次数，并根据实验的需要合理控制传代次数。
细胞的传代培养
实验二细胞的传代培养【实验目的】1. 掌握贴壁细胞换液和细胞传代的方法。
2. 了解细胞传代培养的意义。
【实验原理】细胞在培养瓶里的生长，分为贴壁生长和悬浮生长。
贴壁生长细胞在培养瓶中生长数天后，就会在培养瓶底部长满，如果不进行处理，就会继续生长而产生堆积，最后因缺乏营养供给而死亡。
因此当细胞生长贴满瓶底时，就需要将细胞消化下来，并接种成多瓶细胞，使细胞继续生长。
这一处理接种的过程就叫传代，每接种一次就叫做传一代。
细胞传代培养使得细胞增殖，可获得大量细胞供实验所需。
传代培养是组织培养常规保种方法之一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。
接种后的细胞放在培养箱里静置培养，培养的温度视动物种类而定。
一般，温水性鱼类细胞的最适培养温度为25℃，热带鱼类细胞为30℃，冷水鱼类细胞为20℃，哺乳动物细胞为37℃。
细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏、代谢产物增多、变酸等不适宜细胞生长因素，而此时细胞还未生长达到饱和密度（没有贴满底部），仍需继续培养，因而需要更新营养液来更新营养成分，以满足细胞继续生长繁殖的需要，这一过程叫换液。
单纯换液不需要接种细胞。
【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基（PRMI-1640 或MEM，添加10% 小牛血清或胎牛血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL、10 mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
【实验步骤】工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30 分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。
在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶等。
1．观察细胞：倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代，当细胞长满瓶底时可以传代；2．超净工作台准备：将试剂瓶、培养瓶等培养用具用酒精喷洒，用消毒纱布擦净，置于超净工作台酒精灯左侧；3．开盖：旋开细胞培养瓶瓶盖，将瓶盖侧立于（严禁倒扣放置）酒精灯旁，培养瓶瓶口、瓶盖均需过酒精灯火焰后再盖好；4．清洗细胞表面：打开移液管盒，用普镊捏住移液管（5mL）后部从盒子中拖出（注意移液管的管壁和管口不能碰到其他物品），安装好加液枪，移液管管口和管壁均过酒精灯火焰。
细胞传代培养
细胞传代培养1.细胞传代概念传代即去除原培养基并将细胞从原培养体系转移到新鲜的生长培养基中，该过程可使细胞系或细胞株进一步增殖。
接种后培养细胞的生长将从延滞期进入对数期，即：细胞呈指数增殖。
当贴壁培养的细胞已占据所有可用基质、没有扩增空间，或者悬浮培养的细胞已超过培养基所能支撑的能力，无法进一步生长时，细胞增殖速度将大大降低甚至完全停止(参见下图)。
为了将细胞密度维持在最佳水平，以便细胞继续生长，并且刺激其进一步增殖，必须将培养物分成若干部分，并添加新鲜培养基。
2.细胞传代标准（1）细胞密度哺乳动物细胞：贴壁培养细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时即应进行传代。
正常细胞达到汇合状态时会停止生长(接触抑制),重新接种后需要较长时间才能恢复。
转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖，但是在经过大约两个倍增时间后通常会变质。
类似地，悬浮培养的细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时也应进行传代。
到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。
昆虫动物细胞：昆虫细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时应进行传代。
牢固贴壁的昆虫细胞达到汇合状态时也可传代，虽然此时细胞更容易从培养容器上解离下来，但是如果反复将昆虫细胞在密度超过汇合的状态下传代，细胞的倍增次数会减少，活力会降低，贴壁能力也会下降。
另一方面，将贴壁培养的昆虫细胞在达到汇合状态前传代要较大的机械力，才能使细胞从单细胞层中脱离。
反复在达到汇合状态前传代，会导致细胞倍增次数减少，活力降低，健康度较差。
（2）培养基耗竭哺乳动物细胞：生长培养基pH 值降低通常表示乳酸蓄积，乳酸是细胞代谢的副产物。
乳酸有细胞毒性，而且pH值降低也是细胞生长的不利因素。
pH值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度，细胞浓度越高，培养基耗竭的速度越快。
如果发现 pH 值迅速降低(>0.1-0.2 pH 单位),同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。
昆虫细胞：用于昆虫细胞培养的生长培养基通常比哺乳动物细胞培养基酸度大。
细胞传代培养的原理及操作步骤
一．细胞传代培养的原理及操作步骤
（一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
（二）细胞传代培养具体操作
1、细胞：贴壁细胞株
2、操作步骤
1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。
随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。
观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。
一般室温消化时间约为1-3分钟。
4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。
第二天观察贴壁生长情况。
细胞传代培养的意义
细胞传代培养的意义
细胞传代培养是指将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿中，并在新的培养基中继续生长和繁殖的过程。
这种方法广泛应用于细胞学、生物学、医学等领域中。
其意义主要如下：
1.保持细胞的稳定性：细胞传代培养可以保持细胞的稳定性，防止细胞在长期培养过程中突变、退化等现象的发生。
2.扩大细胞数量：细胞传代培养可以将含有少量细胞的培养皿转移到大量培养基中，从而扩大细胞数量，方便进行各种实验和应用。
3.维持细胞功能和特性：细胞传代培养可以保持细胞所具有的特性和功能，如分泌物的产生、受体的表达等。
4.研究细胞生物学：细胞传代培养为细胞生物学研究提供了基础，可以研究细胞的生长、分化、死亡等各种生物学过程。
5.应用于医学：细胞传代培养在医学中有广泛的应用，如制备疫苗、药物筛选等。
总之，细胞传代培养是一种重要的细胞学技术，具有广泛的应用前景。
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产物的影响而发生密度抑制
（三）停滞期： 即细胞数量达到饱和密度后，细胞 与营养液的交换面积减少，代谢产物积 累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。 在此时应及时进行传代，否则因细胞 中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再 传1-2代后，细胞才能恢复。
细胞的传代培养操作
1、悬浮细胞
可采用加入等量新鲜培养基后直接吹
（二）指数生长期：
细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞 分裂指数（Mitotic index，MI）表示， 即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。
体 外 培 养 细 胞 分 裂 指 数 介 于 0.10.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、 温度等影响。
指数生长期是细胞活力最好的时期，可对 细胞进行各种实验 指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断 增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触 汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则 无接触抑制现象。 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢
刚加入
合适
过头
4、加入1～2滴管含有血清的培养液，反
复吹打细胞，使其成细胞悬液。
5、以1：2或1：3进行分装，补充新鲜培
养基，并在培养瓶上做好标记，注明代号、
日期，轻轻摇匀，37 ℃CO2培养箱培养。
6、观察：细胞培养24h后，即可观察培养
液的颜色及细胞的生长情况。
注意事项
1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间 的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。 每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使
所谓细胞“一代”，即从细胞接种到分离再培养 的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已传 代50次。
贴壁细胞的生长规律
贴壁过程
培养细胞一代生长过程
（一）潜伏期（Latent phase）： 细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段 时间。 二倍体细胞该期时间长（24-96h） 连续细胞系时间短（10-30min）
用一套器材。培养用液应严格分开。
2．传代时间的掌握：每天观察细胞形态，掌握
好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，
折光性好，生长致密时即可传代。 3、消化时间的掌握
思考题
1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出 哪些是关键步骤?
2.细胞胞传代培养的目的是什么? 3.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不 同? 4.如何估计是否传代和传代的方式?
细胞的传代培养
本次课内容
复习细胞原代培养基本知识 细胞生长的规律 重点：细胞传代培养的操作过程 操作：HepG-2细胞的传代
原代培养
什么是原法的主要过程
细胞传代培养
概念：培养的细胞由于细胞增殖，数量增加，细 胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，将培 养的细胞分散，以1:2或l:3以上的比率转移到另 外的容器中进行培养，即为传代培养，也叫做继 代培养 一般细胞可传代10-50代。
打分散进行传代，或用离心法后，加入新
培养基后再吹打分散进行传代 2、贴壁细胞（重点）
贴壁细胞传代培养过程
1、实验准备：细胞培养用的器材灭菌、超净工作 台准备、实际预温、操作人员准备。
2、倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的D-Hanks 液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的 碎片。 3、加入2滴管0.25％胰蛋白酶消化液，消化2～ 3min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起 出现空隙时，倒去酶液。