QC-7129B鲎试剂灵敏度复核操作规程
细菌内毒素测定技术—鲎试剂灵敏度复核和方法验证试验
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
二、鲎试剂灵敏度的复核 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低
知识点：鲎试剂灵敏度复核试验
当λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于内毒素 检查。但是注意要以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
知识点：干扰试验
一、干扰试验 是为了确定供试品在多大的稀释倍数或 浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为产 品能否用细菌内毒素检查法提供依据，并且验证供试品 的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对 照结果呈阴性时，供试品是否存在干扰作用。
编号
内毒素浓度
被加入内毒素的溶液 平行管数
A
无
供试品溶液
至少2
标准曲线的中点（或附近点
B
）的浓度（设为λm）
C
至少3个浓度 （最低一点设定为λ）
供试品溶液 检查用水
至少2 每一浓度至少2
D
无
检查用水
至少2
A 为稀释倍数不超过MVD 的供试品溶液。B 为加入了标准曲线中点或 靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A 有相同稀释倍数的供 试品溶液。C 为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备 标准曲线的标准内毒素溶液。D 为阴性对照。
浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml 表示。当使用新批号的 鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进 行鲎试剂灵敏度复核试验。
复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检 验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。
QC-7129B鲎试剂灵敏度复核操作规程
正文规范鲎试剂灵敏度复核的操作过程和要求，确保鲎试剂灵敏度复核结果的可靠性。
适用于质监处药理室对鲎试剂灵敏度的复核。
质监处药理室分析人员负责本规程的实施和完成相关记录。
USP版附录85；CP版附录Ⅺ E 。
细菌内毒素检查法：本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
鲎试剂：是鲎变形细胞的溶出物经提取而成。
鲎试剂灵敏度：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。
细菌内毒素检查用水(BET水)：系指与灵敏度为0.03EU/ml 或更高灵敏度的鲎试剂在37 1 C 条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
细菌内毒素标准品：USP细菌内毒素参考标准品(RSE)或已标定的细菌内毒素工作标准品(CSE)。
反应终点浓度：是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈现阳性结果的浓度。
一、试剂、材料与仪器设备试剂：鲎试剂批号、灵敏度、规格、生产商。
细菌内毒素检查用水(BET水) 批号、规格、生产商。
细菌内毒素标准品批号、效价、生产商。
材料及仪器设备：电热恒温水箱型号、设备编号。
电热鼓风干燥箱型号、设备编号。
漩涡混合器型号。
无热原试管规格：1075mm。
正文无热原玻璃瓶规格：25ml。
无热原玻璃吸管规格：1ml、2ml、5ml、10ml。
试管架、无热原封口膜、洗耳球、酒精棉球、砂轮片。
二、试验准备试验所用的容器、用具都必须经过处理，250C以上干烤至少1小时，以去除外源性内毒素。
试验操作过程应避免微生物的污染。
三、内毒素溶液配制细菌内毒素标准品系列溶液配制取RSE或CSE 1瓶，按照使用说明书加入规定量的细菌内毒素检查用水使溶，并用漩涡混合器间歇混匀30分钟，然后用细菌内毒素检查用水进一步稀释至2.0、、 0.5、 0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每一步稀释应混匀至少30秒钟。
鲎试剂灵敏度复核记录
结果是否有效
计算结果
结果判断
检验人员
BET水批号：12011305
规格：mL/支来源：福州新北化工业有限公司
内毒素标准品复溶时的体积为mL，稀释方法为：用刻度吸管准确吸取内毒素检查用水1mL制成细菌内毒素标准液0λ1.0λ0.5λ0.25λ
（）（）（）（）
NC
反应终点浓度
重1
复2
管3
鲎试剂灵敏度复核试验记录
一仪器设备
试管恒温仪
二鲎试剂检验日期：年月日
批号：
灵敏度：EU/mL
供养单位：
规格：mL/支（瓶）
生产单位：
有效期：年
检验目的：灵敏度考核
检验数量：支（瓶）
检验依据：中国药典年版
三标准品
NES批号：
效价：EU来源：
WSE批号：150601-201072
效价：EU来源：中国药品生物制品检定所
美国USP鲎试剂检测方法
USP这一章节的部分内容已与欧洲药典和日本药典协调一致，不一致的部分以符号*标出。
本章阐述了关于检查和定量供试品内毒素的方法。
本法利用鲎（Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus）血细胞提取物制备的用于内毒素检测的鲎试剂（LAL）检定内毒素。
*1该检查包括两种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；另一种为光度测定法，该法利用鲎试剂与内毒素反应过程中的光学变化来实现内毒素的测定，这种方法又可分为浊度法（基于形成凝胶的过程中，溶菌液的浊度变化）和显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。
检测时，可用其中任一种方法进行试验。
当测定结果可疑或有争议时，除非各论中另有规定，以凝胶法测定结果为准。
直接比较供试品溶液与标准内毒素溶液，判断凝胶法的反应终点。
内毒素含量以USP内毒素单位（USP-EU）表示。
[注-1USP EU相当于1个内毒素单位。
]LAL试剂专用于浊度检查法或显色法，因此，使用这两种方法进行检定时，必须符合它们各自的要求。
两种检查法都要求建立标准曲线，以检定供试品的内毒素含量。
主要的实验步骤有：在预定的时间内将内毒素和对照品分别与LAL试剂保温培养；读取相应波长处的吸光度等。
使用终点浊度法时，应在孵育时间结束时马上读数；对终点显色法，则要在孵育终止时添加酶反应-终止制剂，反应停止后，方可读数。
动态浊度法和动态显色法分析整个反应时间内吸光度的变化，并通过这些读数计算比值。
仪器所有玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。
*2去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。
若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。
[注-本章内，“管”也包括任何其他反应容器，如微孔板的孔等。
]内毒素储备标准溶液和内毒素标准溶液的制备USP内毒素RS的效价规定为10000 USP内毒素单位（EU）/西林瓶。
培养基的灵敏度检查操作SOP
培养基的灵敏度检查操作SOP1 目的建立培养基灵敏度试验的操作规程，是为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全进行。
2 适用范围本标准适用于2015版中国药典培养基灵的敏度检查。
3 责任者 QC检验人员。
4 内容试验设备及用具：无菌培养皿、移液枪或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、培养箱等。
使用的菌株：金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003,铜绿假单胞菌CMCC(B)10104，枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501，·生孢梭菌CMCC(B)64941，白色念珠菌CMCC(F)98001，黑曲霉CMCC(F)98003，培养基灵敏度检测所用的菌株传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验用菌株的生物学特性。
检测频率每批新买的培养基配制、灭菌后均应做灵敏度测试。
操作方法对照标准培养基用已经过试验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基。
试验培养基将琼脂类的试验培养基加热融化后，冷却至45℃左右，以无菌的方式在无菌培养皿中注入15～20mL，备用。
液体类的培养基直接使用。
'菌悬液的制备购买对应的商业化定量菌株。
使用时直接稀释成规定菌含量的菌悬液。
目前有进口的bioball和国产的microball等。
使用方便，定量精确。
培养基的生长促进实验琼脂类培养基的生长促进试验每株菌用2个试验培养基平皿，用表面涂布法在每个平皿表面接种的菌悬液（约10-100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，取出平皿点计菌落数。
试验培养基上的微生物数量应为对照培养基上微生物生长数量的70%-150%范围内。
（注：每种培养基生长促进实验的具体菌株见附录1）液体类培养基的生长促进实验每株菌用2管（或瓶）试验培养基，接种的菌悬液（约10-100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基或用已知合格的酪蛋白大豆消化琼脂平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，对比或计数，在规定时间内能生长菌落为合格。
细菌内毒素检查法标准操作规程
错误！未找到引用源。
1.目的建立细菌内毒素检查法的操作标准，以免操作不当而造成损失及减少误差的来源。
2.范围本规程适用于各品种的细菌内毒素检查。
3.职责QC负责本规程的实施，QC主管对本规程的实施进行监督。
4.内容4.1实验材料及用具4.1.1天平（精度0.1mg）；电热干燥箱（用于去除外源性内毒素，温度应能达到250℃）；恒温水浴箱货适宜的恒温器（37℃±1℃）；水银温度计或酒精温度计（精度1℃以下）；旋涡混合器；鲎试剂（应有国家主管部门的批准文号）；4.1.2细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品；4.1.3细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
4.1.4实验用具：移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10mm ×75mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、时钟、75%乙醇棉、剪刀、砂轮。
所用玻璃器皿须经250℃干烤30分钟以上。
若使用塑料器械、如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
4.2实验准备4.2.1玻璃器皿的洗涤：将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置人电热干燥箱。
4.2.2玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素的去除：玻璃器皿置干燥箱后，将干燥箱调至250℃，待干燥箱温度升至设定的温度后开始计时，250℃干烤30分钟以上。
达到规定时间后，关断电源，待干燥箱温度自然降至室温。
在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。
4.2.3供试品溶液的制备：某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
标准品、鲎试剂操作规程
标准品、鲎试剂操作规程目的：建立标准品、鲎试剂操作规程，指导检验员正确执行标准品、鲎试剂操作。
1.适用范围：适用于标准品、鲎试剂操作。
2.定义2.1标准品系以细菌内毒素国家标准品为基础标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
3.责任：QC人员。
4.规程4.1申购4.1.1标准品采购：按《对照品操作规程》中对照品申购程序，进行采购。
到药品检验所或中国生物制品检定所统一订购。
4.1.2鲎试剂采购：由管理员根据检验需要，填写申购单，注明：品名、规格、灵敏度、数量、购回日期。
交化验室主任核准后，交物料部采购。
4.2接收4.2.1物料部将鲎试剂与标准品购回后，管理员接通知，开具领料单。
4.2.2经化验室主任签字后，凭领料单到仓库领用。
4.2.3接收前，管理员仔细核对所领细菌内毒素工作标准品或鲎试剂的规格、数量、有效期和灵敏度，检查外包装、标签有无损坏或泄漏。
无误后，方可接收。
4.3贮存4.3.1接收的标准品与鲎试剂根据其特性存放在适宜的条件下，且根据批号、灵敏度分类摆放。
4.3.2管理员及时登记《标准品、鲎试剂接收、使用记录》。
4.4发放、使用4.4.1检验员根据检品需要，向管理员申请试验用量的标准品、鲎试剂。
4.4.2管理员在核实申请情况后，方可发放。
4.4.3领用后，检验员登记《标准品、鲎试剂接收、使用记录》，管理员签名确认。
4.4.4每批入库的鲎试剂必须按药典规定，进行灵敏度复核试验，符合规定后方可发放、使用。
4.4.5鲎试剂灵敏度复核4.4.5.1根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每步混匀30秒。
4.4.5.2取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个浓度平行做4管；另两管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
鲎试剂灵敏度复核SOP
鲎试剂灵敏度复核SOP1.目的为规范鲎试剂标示灵敏度复核的操作，确保鲎试剂试验的准确性，特制定此操作规程。
2.范围本标准操作规程适用于新批号鲎试剂使用前对标示灵敏度的复核以及试验条件发生任何可能影响检验结果的改变时，对鲎试剂标示灵敏度的复核。
3.定义无4.职责4.1QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。
4.2QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。
4.3质量总监负责批准本规程。
4.4QA负责本规程执行的监督。
5.引用标准《中华人民共和国药典》2020年版二部6.材料见8.程序。
7.流程图无8.程序8.1试剂：细菌内毒素工作标准品、鲎试剂溶解水、待复核灵敏度的鲎试剂。
8.2仪器与设备：恒温水浴箱、烤箱、小试管、中管、半中管。
8.3操作步骤8.3.1试验前准备试验用吸管、小管等玻璃器皿应在试验前1～2天内包好，经200℃干烤2小时除内毒素备用。
8.3.2鲎试剂灵敏度复核根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30秒钟；取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×100mm试管18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照；将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。
8.4结果判定8.4.1将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
8.4.2当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。
中国药典2020版鲎试剂细菌内毒素检查预试验SOP
1目的建立细菌内毒素预试验操作规程，以指导检验人员的正确规范操作，为保证细菌内毒素检查凝胶法的准确性提供依据。
2适用范围适用于细菌内毒素检查法的“鲎试剂灵敏度复核试验”和“干扰试验”。
本规程参照《中国药典》2020年版四部-1143细菌内毒素检查法制定。
3职责进行细菌内毒素检查的操作人员严格按本规程进行操作。
4内容4.1基本原理4.1.1本法采用凝胶法，系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。
4.1.2鲎试剂灵敏度复核试验：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
4.1.3干扰试验：当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项目的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
4.1.4本试验操作过程应防止内毒素的污染。
4.1.5EU：内毒素单位，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
4.1.6λ：鲎试剂的标示灵敏度，单位：EU/ml。
4.1.7MVD：最大有效稀释倍数，指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数。
4.2材料准备4.2.1细菌内毒素工作标准品：应经细菌内毒素国家标准品为基准标定效价；4.2.2鲎试剂：当使用新批号前，按《细菌内毒素预试验SOP》进行灵敏度检查；4.2.3细菌内毒素检查用水（BET水）：内毒素含量应＜0.015EU/ml，且对内毒素试验无干扰作用；4.2.4供试品溶液：pH宜在6.0~8.0范围内，否则用已去除内毒素和干扰因子的酸、碱溶液或缓冲液调节。
4.3器具准备4.3.1移液枪、一次性除热源枪头（1000μL、200μL）；4.3.2剪刀、砂轮片、试管架、除热源试管、医用胶布；4.3.3恒温培养箱（37℃±1℃）、旋涡混合器、洁净工作台。
4.4鲎试剂灵敏度复核试验4.4.1试验过程：4.4.1.1根据当批鲎试剂的标示灵敏度（λ），把细菌内毒素工作标准品用适量BET水充分溶解，避免产生气泡，在旋涡混合器上混匀15分钟。
鲎试剂灵敏度
▪ 鲎的血变形细胞中含有两种物质，即高相对分子质量的凝固 酶原和凝固蛋白原，凝固酶原被内毒素激活转化成具有活性 的凝固酶，在凝固酶的酶解作用下，将凝固蛋白原转化成凝 固蛋白，凝固蛋白又通过交联酶作用互相聚合而形成牢固的 凝胶。可简单表示如下： 内毒素
↓ 凝固酶原-----→凝固酶
↓ 凝固蛋白质-----→凝固蛋白
死某些其他微生物或癌细胞的物质，称抗生素。抗 生素多由放线菌和真菌产生，细菌仅产生少数几种，
如多粘菌素、杆菌肽等。
（5）细菌素
某些细菌能产生一种仅作用于有近缘关系的细菌 的抗菌物质，称细菌素。细菌素为蛋白类物质，抗 菌范围很窄，无治疗意义，但可用于细菌分型和流 行病学调查。细菌素以生产菌而命名。大肠埃希菌 产生的细菌素称大肠菌素，绿脓杆菌产生的称绿脓 菌素，霍乱弧菌产生的称霍乱菌素。
交联酶↓ 凝胶
三、操作用仪器及试剂
1．仪器 超净工作台，分析天平（万分之一） ， 细菌
内毒素定量测定仪 ，电热干燥箱， 旋涡混合器， 三角瓶， 凝集管（10mm×75mm）， 小试管 （16mm×100mm）， 移液管（或刻度吸管、 定量移液器）, 大口径试管，水浴恒温器或干热 恒温器， 试管架， 计时器, 洗耳球, 封口膜 或金属试管帽 , 脱脂棉，吸水纸，剪刀，砂轮等。
第二节 微生物内毒素测定的操作
可作为部分注射剂热原检查的代替方法，与
一、操作目的 家兔热原检查法相比，有快速、灵敏、重现
性好、简便易行等优点，并有利于热原检查 标准化。
二、操作原理
鲎,属节肢动物，肢口纲。在3亿中前的泥盆纪末期，鲎就问世 了，堪称海洋里的远古遗民。鲎是用鳃呼吸的节肢动物,目前 世界上仅有4种：中国鲎、美洲鲎、马来鲎和圆尾鲎。
通常利用生化试验的方法，检测微生物对 各种物质的代谢作用及其代谢产物，称为微 生物的生化反应。这一反应通常用于微生物 的鉴别。
QC-7130B细菌内毒素工作标准品标定操作规程
正文规范细菌内毒素工作标准品效价的标定程序，确保细菌内毒素检查结果的可靠性。
适用于质监处药理室对细菌内毒素工作标准品效价的标定。
质监处药理室分析人员负责本规程的实施和完成相关记录。
USP版附录85；CP版附录Ⅺ E 。
细菌内毒素检查法：本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
鲎试剂：是鲎变形细胞的溶出物经提取而成。
鲎试剂灵敏度：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。
细菌内毒素检查用水(BET水)：系指与灵敏度为0.03EU/ml 或更高灵敏度的鲎试剂在37 1 C 条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
细菌内毒素参考标准品(RSE)：RSE 是USP细菌内毒素参考标准品，每瓶有10,000个USP 内毒素单位。
细菌内毒素工作标准品(CSE)：是除RSE 之外的内毒素标准品。
反应终点浓度：是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈现阳性结果的浓度。
一、试剂、材料与仪器设备试剂：鲎试剂批号、灵敏度、规格、生产商。
细菌内毒素检查用水(BET水) 批号、规格、生产商。
细菌内毒素工作标准品(CSE) 批号、效价、生产商。
细菌内毒素参考标准品(RSE) 批号、效价、生产商。
材料及仪器设备：电热恒温水箱型号、设备编号。
电热鼓风干燥箱型号、设备编号。
正文漩涡混合器型号。
无热原试管规格：1075mm。
无热原玻璃瓶规格：25ml。
无热原玻璃吸管规格：1ml、2ml、5ml、10ml。
试管架、无热原封口膜、洗耳球、酒精棉球、砂轮片。
二、试验准备试验所用的容器、用具都必须经过处理，250C以上干烤至少1小时，以去除外源性内毒素。
试验操作过程应避免微生物的污染。
三、内毒素溶液配制USP细菌内毒素参考标准品(RSE)系列溶液配制取RSE 1瓶，加入5ml细菌内毒素检查用水溶解并用漩涡混合器间歇混匀30分钟，然后用细菌内毒素检查用水进一步稀释至2.0、、 0.5、 0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每一步稀释应混匀至少30秒钟。
G试验和鲎实验操作技术
五、血样检测过程
7、葡聚糖参考标准： 100.5pg/ml为正常值； 100.5~151.5pg/ml之间，为病变期 ，应连续检测； 151.5pg/ml以上，为念珠菌或曲霉菌 深部感染。 灵敏度：最小有效检出值10pg/ml 特异性：对小于或等于1.0EU/ml，脂多糖不反 应 标准曲线范围：10~500pg/ml
3
一、前期的准备工作
8、反应试管（储备量是两倍左右） 9、高低试管架各两个 10、采血管（看院方情况，可用BD 管，可用我们的采血管） 11、工作服两套 12、一次性塑料手套、一次性乳胶 手套各一盒
一、前期的准备工作
。
三、仪器（装机）：
1、动态试管器有两线线，一条接 电脑，一条接电源，另外电脑也 接上电源线； 2、先把仪器提前接上，以便让温 度快速达到37°C，再把恒温仪接 上电源，以便让温度快速到达 75°C。
6
五、血样检测过程
临床操作规程：B-G检测 1、采血2ml --离心（1500转/10分钟；3000 转/分钟） --样品稀释液0.9ml+0.1血浆（稀释10倍） --放在漩涡器上混匀，3秒 --避光转移到恒温仪加热（75度，10分钟） --冷却（冷却区2~8度或常温冷却，10 分钟）；
注意：桌子要平稳、水平，不能摇晃
五、血样检测过程
8、LPG参考标准： 10pg/ml以下，为健康人群； 10~20pg/ml之间，为病变观察期，应连续检测； 20pg/ml以上，为深部真菌感染症状，需对症治疗。 灵敏度：最小有效检出值5pg/ml 精密度：批间 CV≤10% 准确性：回收率平均75-125%
Hale Waihona Puke 127五、血样检测过程
2、试剂干粉0.25+试剂复溶剂 0.25ml(不能用漩涡混合机， 自动沉清1分钟； 3、打开反应试管（每一个样品 取两根，只能用手指夹试管 中间，头部避免污染，底部 怕影响透光度，影响结果）
鲎试剂灵敏度复核标准操作规程
范围：鲎试剂职责：检验室对本规程的实施负责正文：1.内毒素标准溶液的制备1.1取细菌内毒素国家标准品（NSE）或内毒素工作标准品（WSE）一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。
1.2按标准品使用说明书用移液管加入规定量的细菌内毒素检查用水（BET）溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。
置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。
若为NSE，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装并保存。
2.待复核鲎试剂的准备2.1在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，加入0.1mlBET水复溶，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
2.2若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入BET水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混匀后每0.1ml分配到10×75mm凝聚管中，要求至少分配18支管备用。
3.加样3.1将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4支（管）4列分别加入2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；2支（管）1列分别加入BET水。
内毒素标准溶液和BET水的加样量均为0.1ml/支。
4.加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟，观察结果。
5.鲎试剂灵敏度复核如最大浓度2.0λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）。
λc＝lg- 1 （∑X/4）式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。
鲎试剂灵敏度复核原理
鲎试剂灵敏度复核原理1 鲎试剂的灵敏度复核鲎试剂是一种病原体检测试剂，用于分析样品中是否存在鲎病毒。
它提供了有效、准确、可靠的检测，并且能够快速和准确地检测出鲎病毒的存在。
灵敏度复核是对鲎试剂灵敏度的一种检验。
本文将简要介绍鲎试剂灵敏度复核的原理。
2 鲎试剂灵敏度复核原理鲎试剂灵敏度复核是通过检测与水力均一系数和介质比容量（VCR）之间的相互关系来进行的。
水力均一系数（FDP）用来衡量样品的灵敏度，是一种量化的指标，它可以测量出检测样品中样品分子数量的值，它可以作为检测决策的依据。
介质比容量（VCR）指标可以衡量检测样品中DNA的质量，它可以用来测量检测分子的大小，它可以作为衡量检测样品的灵敏度的重要参数。
3 所用材料和实验方法用于鲎试剂灵敏度复核的材料包括：NIGP-9576流式细胞术引物、标准分子颗粒（SM）、即用型DNA表达质粒质粒（CTP）、库夫特—威尔斯质粒（KV）及它的完整酶切体（kVCF）、抗体制剂（AM）、核酸定量试剂盒（H∅QT）。
实验步骤主要包括：①用NIGP-9576流式细胞术引物按照要求（1∶15~2∶30）制备测定鲎病毒目标易位基因（TG）的反应混合液，加入与VCR和FDP相对应的原液；②进行表达质粒PCR，并且结合抗体进行抗体表达；③进行激活反应，并以KV或kVF为模版，分解样品；④将所有步骤重复10次，获得完整的酶的灵敏度复核试剂（V∅PoP）；⑤最后，用H∅QT试剂盒进行检测，以获得定量的VCR和FDP值，便可得到灵敏度复核结果。
4 结论鲎试剂的灵敏度复核原理是通过VCR和FDP来衡量检测样品中分子数量和大小的，并用H∅QT试剂盒进行检测，以获取定性结果。
只有通过严格的技术测试才能确定样品中分子的灵敏度，确保安全操作。
鲎试剂灵敏度复核试验
精心整理文件编号：版本：鲎试剂灵敏度复核试验作业指导书1.0 目的对细菌内毒素检查试验所用的鲎试剂的灵敏度进行复核。
2.0 职责质量与法规部负责本规程的起草，QC及相关人员执行本规程。
3.0 范围适用于本公司细菌内毒素检查法。
4.0 参考文件2010年版《中国药典》二部附录ⅪE细菌内毒素检查法2010年版《中国药品检验标准操作规范》细菌内毒素检查法《细菌内毒素检查法及其应用》第一版，气象出版社5.06.06.16.2 料6.2.1 细菌内毒素工作标准品除另有规定外，使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。
6.2.2 细菌内毒素检查用水指内毒素含量小于0.015EU/ml（凝胶法）且对内毒素试验无干扰的灭菌注射用水。
6.2.3 鲎试剂规格一般选用0.25EU/ml。
7.0 操作步骤7.1 提前30min开启超净工作台，试验操作过程中不要开启风机，完毕后用75%乙醇擦拭超净工作台。
试验操作过程应防止微生物和细菌内毒素污染。
7.2 制备细菌内毒素标准溶液7.2.1 取细菌内毒素工作标准品1支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈上部划痕，用75%乙醇擦拭后启开，避免玻璃屑落入瓶内。
7.2.2 按照工作标准品说明书，加入细菌内毒素检查用水溶解。
封口膜封口，置漩涡混合器上混匀15min后用细菌内毒素检查用水进行稀释，制成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液。
每稀释一步均应在漩涡混合器上混匀30s。
注：在使用过程中，标准品溶液若静置超10min，必须重新混匀30s再重新使用。
7.2.3 试验举例设细菌内毒素工作标准品为100EU/支；待测鲎试剂λ=0.25EU/ml。
稀释过程如下：取细菌内毒素标准品100EU/支+1ml检查用水100EU/ml取0.2ml100EU/ml溶液+1.8ml检查用水10EU/ml取0.2ml10EU/ml溶液+1.8ml检查用水1EU/ml0.5EU/ml7.4浓度的第毒第毒第注：每次加样浓度必须是从高到低，加不同浓度的样品需更换新的移液器吸嘴。
美国USP鲎试剂检测方法
USP这一章节的部分内容已与欧洲药典和日本药典协调一致，不一致的部分以符号*标出。
本章阐述了关于检查和定量供试品内毒素的方法。
本法利用鲎（Limuluspolyhemus或 Tachypleus tridentatus）血细胞提取物制备的用于内毒素检测的鲎试剂（LAL）检定内毒素。
*1该检查包括两种方法：一为凝胶法，系利用鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理；另一种为光度测定法，该法利用鲎试剂与内毒素反应过程中的光学变化来实现内毒素的测定，这种方法又可分为浊度法（基于形成凝胶的过程中，溶菌液的浊度变化）和显色法（得到的肽－呈色基团复合物断裂后，检测反应混合物的色度）。
检测时，可用其中任一种方法进行试验。
当测定结果可疑或有争议时，除非各论中另有规定，以凝胶法测定结果为准。
直接比较供试品溶液与标准内毒素溶液，判断凝胶法的反应终点。
内毒素含量以USP内毒素单位（USP-EU）表示。
[注-1USP EU相当于1个内毒素单位。
]LAL试剂专用于浊度检查法或显色法，因此，使用这两种方法进行检定时，必须符合它们各自的要求。
两种检查法都要求建立标准曲线，以检定供试品的内毒素含量。
主要的实验步骤有：在预定的时间内将内毒素和对照品分别与LAL试剂保温培养；读取相应波长处的吸光度等。
使用终点浊度法时，应在孵育时间结束时马上读数；对终点显色法，则要在孵育终止时添加酶反应-终止制剂，反应停止后，方可读数。
动态浊度法和动态显色法分析整个反应时间内吸光度的变化，并通过这些读数计算比值。
仪器所有玻璃器皿及由其他耐热材料制成的器皿需用已验证的工艺在热烘箱内进行去热原处理。
*2去热原时，常用的最小时间和温度设置分别为30分钟和250℃。
若使用塑料器械，如微孔板和微量进样器配套的吸头等，它们必须标明无内毒素并确对试验无干扰。
[注-本章内，“管”也包括任何其他反应容器，如微孔板的孔等。
]内毒素储备标准溶液和内毒素标准溶液的制备USP内毒素RS的效价规定为10000 USP内毒素单位（EU）/西林瓶。
鲎试剂灵敏度复核excel计算公式
鲎试剂灵敏度复核excel计算公式以鲎试剂灵敏度复核Excel计算公式为标题鲎试剂灵敏度复核是在实验室中常见的质量控制程序之一，它用于检验鲎试剂的灵敏度是否符合规定的标准要求。
在进行鲎试剂灵敏度复核时，我们可以利用Excel软件来进行计算和分析。
本文将介绍如何使用Excel计算公式进行鲎试剂灵敏度复核。
我们需要准备一些实验数据，包括试剂的浓度和相应的反应结果。
假设我们有10个不同浓度的鲎试剂样本，我们可以将浓度和反应结果分别记录在Excel的两列中。
为了方便计算，我们可以将浓度列命名为“浓度”，将反应结果列命名为“反应结果”。
接下来，我们需要计算每个浓度对应的平均反应结果。
在Excel中，可以使用“平均”函数来实现。
我们可以在下方的空白单元格中输入“=AVERAGE(反应结果列的数据范围)”来计算平均值。
例如，如果反应结果列的数据范围是B2到B11，则我们可以输入“=AVERAGE(B2:B11)”。
计算平均反应结果后，我们还需要计算每个浓度对应的标准偏差。
标准偏差可以反映实验数据的离散程度，用于评估实验的稳定性。
在Excel中，可以使用“STDEV.S”函数来计算样本标准偏差。
我们可以在下方的空白单元格中输入“=STDEV.S(反应结果列的数据范围)”来计算标准偏差。
例如，如果反应结果列的数据范围是B2到B11，则我们可以输入“=STDEV.S(B2:B11)”。
计算平均反应结果和标准偏差后，我们可以根据实验要求来判断鲎试剂的灵敏度是否符合要求。
一般来说，如果平均反应结果在规定的范围内，并且标准偏差较小，则可认为鲎试剂的灵敏度符合要求。
否则，就需要进行进一步的调整或处理。
除了计算平均反应结果和标准偏差外，我们还可以使用其他的Excel 函数来进一步分析实验数据。
例如，我们可以使用“MAX”函数来计算反应结果的最大值，使用“MIN”函数来计算反应结果的最小值，以及使用“COUNT”函数来计算反应结果的个数。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
CP版附录ⅪE。
细菌内毒素检查法：本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
鲎试剂：是鲎变形细胞的溶出物经提取而成。
鲎试剂灵敏度：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。
一、试剂、材料与仪器设备
试剂：
鲎试剂批号、灵敏度、规格、生产商。
细菌内毒素检查用水(BET水)批号、规格、生产商。
细菌内毒素标准品批号、效价、生产商。
材料及仪器设备：
电热恒温水箱型号、设备编号。
电热鼓风干燥箱型号、设备编号。
漩涡混合器型号。
无热原试管规格：1075mm。
正文
无热原玻璃瓶规格：25ml。
五、试验结果观察和有效性
结果观察将安瓿从电热恒温水箱中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为(+)；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为(–)。保温和拿取安瓿过程应避免受到振动造成假阴性结果。
有效性对于细菌内毒素标准品系列溶液，如果最大浓度2.0管均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照管均为阴性，试验方为有效。
标题：
1.目的
2.范围
3.职责
4.参考资料
5.定义
6.鲎试剂灵敏度的复核
标题：
标题：
7.鲎试剂的有效期
8.鲎试剂的保存
9.需复核的情况
10.相关记录
正文
规范鲎试剂灵敏度复核的操作过程和要求，确保鲎试剂灵敏度复核结果的可靠性。
适用于质监处药理室对鲎试剂灵敏度的复核。
质监处药理室分析人员负责本规程的实施和完成相关记录。
细菌内毒素检查用水(BET水)：系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在371C条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
细菌内毒素标准品：USP细菌内毒素参考标准品(RSE)或已源自定的细菌内毒素工作标准品(CSE)。
反应终点浓度：是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈现阳性结果的浓度。
四、试验过程
取被复核的鲎试剂原安瓿18支，分别用0.1ml细菌内毒素检查用水复溶。其中16支加入0.1ml细菌内毒素系列标准溶液，每浓度溶液平行做4支；另外2支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将安瓿中的溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入371℃电热恒温水箱中，保温602分钟。反应结果记录在鲎试剂灵敏度复核记录中。
无热原玻璃吸管规格：1ml、2ml、5ml、10ml。
试管架、无热原封口膜、洗耳球、酒精棉球、砂轮片。
二、试验准备
试验所用的容器、用具都必须经过处理，250C以上干烤至少1小时，以去除外源性内毒素。试验操作过程应避免微生物的污染。
三、内毒素溶液配制
细菌内毒素标准品系列溶液配制取RSE或CSE 1瓶，按照使用说明书加入规定量的细菌内毒素检查用水使溶，并用漩涡混合器间歇混匀30分钟，然后用细菌内毒素检查用水进一步稀释至2.0、、0.5、0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每一步稀释应混匀至少30秒钟。
当细菌内毒素标准品的批号改变时需进行鲎试剂灵敏度的复核。
鲎试剂灵敏度复核记录(表格编号：QCFP04-02)。
六、灵敏度复核结果的计算
计算公式为：
c=lg-1(Σe/4)
正文
式中e为细菌内毒素标准品反应终点浓度的对数值。
合格标准当0.5≤c<1.3时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。
鲎试剂有效期按厂家规定执行。
鲎试剂应在2～10℃条件下保存。
当鲎试剂的批号改变时需进行鲎试剂灵敏度的复核。