09T-I660-01细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程
细菌内毒素检测标准操作
细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量。
范围：适用于所有从治疗中心发放的细胞（包括CIK、DC、干细胞等）内毒素限量检测。
责任人：质量检测人员材料：一、电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能达到180℃。
二、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。
三、水银温度计，精度在1℃以下，量程不小于50℃。
四、旋涡混合器。
五、可调式移液器六、0.25EU/ml鲎试剂。
七、细菌内毒素工作品。
八、凝胶法细菌内毒素检查用水。
九、实验用具无热原吸头（1000μl、200μl）、带铝盖的凝集管（10mm×75mm）、试管架、计时器、75%酒精棉球、封口膜、剪刀、镊子、砂轮。
所用玻璃器皿使用前须经250℃干烤至少1小时或180℃干烤至少4小时。
操作方法一、取样1、细胞发放前3天，取细胞培养液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放（可存放多长时间）。
2、细胞发放当天，取细胞生理盐水混悬液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放。
（可存放多长时间）。
3、取样应以无菌操作技术取样，所用器材在使用前应无热原或已去除热原。
二、鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的是考察鲎试剂的灵敏度是否正确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。
在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。
（一）实验操作1、细菌内毒素工作品溶液的制备取细菌内毒素工作品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。
按照工作品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。
然后用倍倍稀释方式进行稀释，即0.5ml各浓度工作品溶液+0.5ml检查用水（以下稀释方式同此法），制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
细菌内毒素工作标准品检验操作规程
细菌内毒素工作标准品检验操作规程部门质量控制部题目细菌内毒素工作标准品检验操作规程起草审阅批准共2页编号 HY/02-ZK-203 执行日期页码第1页细菌内毒素工作标准品检验操作规程一、范围:本标准规定了细菌内毒素工作标准品的测定方法和操作要求;适用于本公司细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素质控品的质检测定。
二、引用标准:2010年版《中国药典》附录“细菌内毒素检查法”三、要求:1、操作环境:温度不得高于26?，湿度不得高于75%;2、标准品:细菌内毒素国家标准品。
五、操作步骤:3(效价测定以国家标准品为基准，随机取本品2支，使用同一批鲎试剂参考品测定，2支反应终点的均值应与国家标准品的效价相平行或一致。
3.1 凝胶法3.1.1 根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ)，将细菌内毒素国家标准品用检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成4个浓度的标准内毒素溶液，即2λ、λ、0.5λ和0.25λ备用,每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。
3.1.2 设待复核的细菌内毒素工作标准品效价为P，用1ml检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成6个浓度的内毒素溶液，即(P/4λ)倍、(P/2λ)倍、(P/λ)倍、(2P/λ)倍、(4P/λ)倍和(8P/λ)倍备用,每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒。
3.1.3 细菌内毒素国家标准品和细菌内毒素工作标准品稀释须同时进行。
3.1.4 按《细菌内毒素检查法》项下操作，每一个内毒素浓度平行做4管。
如细菌内毒素国家标准品和细菌内毒素工作标准品的最大浓度4管均为阳性，最低浓度4管均为阴性，按下式计算细菌内毒素国家标准品反应终点浓度的几何平均值(E)和细菌内毒素工作标准品反应终点浓度对应的稀释倍数的几何平均值(D)。
-1其中E=1g(?X/4)式中 X为细菌内毒素国家标准品反应终点浓度的对数值(1g);-1D=1g(?X/4) 1式中 X为细菌内毒素工作标准品反应终点浓度对应的稀释倍数的对数值(1g)。
细菌内毒素检查法和操作规程
******有限公司标准操作规程目的建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。
适用范围所有原料、成品的细菌内毒素检查。
责任人QC检验员内容1 简述1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。
1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。
供试品检测时可使用其中任何一种方法。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
1.3 本规范适用于凝胶法检查。
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。
光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005Eu/ml。
1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素******有限公司标准操作规程的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。
1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。
阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。
2实验材料及用具2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。
2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。
细菌内毒素检查法
版本号：V01质量控制文件—检验方法禁止复印受控号：细菌内毒素检查法颁发部门：质量保证部生效日期：年月日分发清单:质量控制部责任人起草人审核人审核人批准人部门质量控制部质量控制部质量保证部质量负责人姓名签名日期版本号：V01质量控制文件—检验方法禁止复印1 目的为确保药品检验的准确有效，建立细菌内毒素检查法的标准操作规程。
2 范围适用于细菌内毒素的检查。
3 定义与缩写3.1细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
3.2细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品：除另有规定外，应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。
3.3细菌内毒素检查用水：系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。
4 职责4.1 质量控制部QC人员：负责执行本规程。
4.2 QC主管：负责监督本规程的实施。
5 内容5.1设备用具5.1.1实验设备：电热干燥箱（250℃以上）、内毒素凝胶法测定仪（37±1℃）、旋涡混合器。
5.1.2实验用具：刻度吸管、吸耳球、试管、试管架、封口胶、砂轮、75%酒精棉球、金属直镊、秒表、记号笔、取样瓶、可调微量移液器及配套玻璃吸头。
5.2试剂：鲎试剂（其标示值用λ表示）、内毒素工作标准品、内毒素检查用水。
5.3试验准备5.3.1洗液的配制：称取重铬酸钾200g，用少许热水溶解后，加浓硫酸至5000ml。
5.3.2 玻璃器皿的洗涤：将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗版本号：V01质量控制文件—检验方法禁止复印液中泡至少4小时取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲后置适宜的密闭金属容器，迅速置烤箱中。
5.3.3除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素：玻璃器皿置烤箱后经250℃干烤30分钟以上，除去热原。
5.4 鲎试剂灵敏度复核试验5.4.1在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU／ml表示。
中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》
中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》――凝胶法凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
在本检验方法规定的条件下，使鲎试剂凝集的内毒素最低浓度为鲎试剂的标记灵敏度，以EU/ml表示。
当使用新一批鲎试剂或试验条件发生任何可能影响试验结果的变化时，应进行鲎试剂的灵敏度审查试验。
根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。
取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。
将试管轻轻地从恒温器中取出，并缓慢地翻转180度。
如果凝胶是在管中形成的，则凝胶不会变形，也不会从管壁上滑落。
形成或形成的凝胶不牢固，变形，并从壁上滑落。
在保温和取试管的过程中，应避免因振动引起的假阴性结果。
当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。
按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc).λc=1g-1(∑x/4）式中x为反应终点浓度的对数值（1g）。
反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λC在0.5λ-2λ（包括0.5λ和2λ）时，可用于细菌内毒素检查，并标记灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验按表1制备溶液a、b、c和d，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（mvd）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
细菌内毒素检查操作规程
GMP管理文件一、引用标准：中华人民共和国S药典（2005年版）一部。
二、目的：本标准规定了细菌内毒素检查法标准操作规程。
三、适用范围：适用于细菌内素毒素的检查。
四、责任者：质检人员。
五、正文：1、简述本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以供试吕中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。
光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
试验操作过程应防止微生物的污染。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，何使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节PH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
最大有效稀释倍数（MVD）的确定最大有效稀释倍数是指在试验中供试品被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。
细菌内毒素检查法
三、细菌内毒素检验法
❖ （一）概述
❖ 1.内毒素(Endotoxin)： 即革兰氏阴性菌细胞壁旳脂多糖，其毒性成份为类脂A，菌体死亡崩解后释放 出来。
❖ 2.细菌内毒素检验法：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生 旳细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素旳限量是否符合要求旳一种措施。
❖ 3.什么是鲎试剂？鲎试剂是由海洋生物鲎旳血液变形细胞溶解物制成旳无菌 冷冻干燥品，具有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活旳凝固酶原，凝固 蛋白原，能够精确、迅速地定性或定量检测样品中是否具有细菌内毒素和 （1,3）-β-葡聚糖激。
❖ 鲎旳图片
鲎旳长相既像虾又像蟹，人称之为“马蹄蟹”,是一类与三叶虫(目前只有化 石)一样古老旳动物。 鲎旳血液中具有铜离子，它旳血液是蓝色旳。这种蓝色血液旳提取物——“鲎试 剂”，能够精确、迅速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品 工业中，可用它对毒素污染进行监测。
s1
s2
阳性对照
阳性产品对照
0.1ml水 0.1ml水
+0.1ml +0.1ml
SMVD1 SMVD1
6
6
0.1ml水 +0.1ml E2入
0.1mlE2入
+0.1ml SMVD16
阴性对照 0.2ml水
❖ （5）封闭管口，摇匀，放入37±1℃旳恒温水浴保温 60±2分钟，取出观察成果，统计成果。
毒素旳措施。(限量、阳性对照、敏捷度、溶剂、稀释倍数） ❖ 内毒素旳量用内毒素单位(EU)表达。 ❖ 该法优点：迅速、敏捷。 ❖ 2.细菌内毒素检验过程中用到旳原则品和试剂 ❖ ①细菌内毒素国标品（RSE）：系自大肠杆菌提取精制得到旳内毒素。
细菌内毒素检查法标准操作规程
错误！未找到引用源。
1.目的建立细菌内毒素检查法的操作标准，以免操作不当而造成损失及减少误差的来源。
2.范围本规程适用于各品种的细菌内毒素检查。
3.职责QC负责本规程的实施，QC主管对本规程的实施进行监督。
4.内容4.1实验材料及用具4.1.1天平（精度0.1mg）；电热干燥箱（用于去除外源性内毒素，温度应能达到250℃）；恒温水浴箱货适宜的恒温器（37℃±1℃）；水银温度计或酒精温度计（精度1℃以下）；旋涡混合器；鲎试剂（应有国家主管部门的批准文号）；4.1.2细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品；4.1.3细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
4.1.4实验用具：移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10mm ×75mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、时钟、75%乙醇棉、剪刀、砂轮。
所用玻璃器皿须经250℃干烤30分钟以上。
若使用塑料器械、如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
4.2实验准备4.2.1玻璃器皿的洗涤：将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置人电热干燥箱。
4.2.2玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素的去除：玻璃器皿置干燥箱后，将干燥箱调至250℃，待干燥箱温度升至设定的温度后开始计时，250℃干烤30分钟以上。
达到规定时间后，关断电源，待干燥箱温度自然降至室温。
在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。
4.2.3供试品溶液的制备：某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
细菌内毒素检测标准操作
细菌内毒素检测标准操作细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量。
范围：适用于所有从治疗中心发放的细胞（包括CIK、DC、干细胞等）内毒素限量检测。
责任人：质量检测人员材料：一、电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能达到180℃。
二、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。
三、水银温度计，精度在1℃以下，量程不小于50℃。
四、旋涡混合器。
五、可调式移液器六、0.25EU/ml鲎试剂。
七、细菌内毒素工作品。
八、凝胶法细菌内毒素检查用水。
九、实验用具无热原吸头（1000μl、200μl）、带铝盖的凝集管（10mm×75mm）、试管架、计时器、75%酒精棉球、封口膜、剪刀、镊子、砂轮。
所用玻璃器皿使用前须经250℃干烤至少1小时或180℃干烤至少4小时。
操作方法一、取样1、细胞发放前3天，取细胞培养液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放（可存放多长时间）。
2、细胞发放当天，取细胞生理盐水混悬液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放。
（可存放多长时间）。
3、取样应以无菌操作技术取样，所用器材在使用前应无热原或已去除热原。
二、鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的是考察鲎试剂的灵敏度是否正确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。
在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。
（一）实验操作1、细菌内毒素工作品溶液的制备取细菌内毒素工作品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。
按照工作品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。
然后用倍倍稀释方式进行稀释，即0.5ml各浓度工作品溶液+0.5ml检查用水（以下稀释方式同此法），制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
细菌内毒素检查标准操作规程
细菌内毒素检查标准操作规程目的：明确检测方法，加强质量管理，确保产品质量。
范围：适用于质量管理部检验人员进行细胞产品细菌内毒素检测。
责任人：质检人员及细胞制备人员内容：1、操作前准备1.1检验人员操作前要穿戴好工作服、工作帽、戴上口罩，手要用75%的酒精消毒。
1.2 设备与用具：试验所用的玻璃器皿需经重铬酸钾洗液浸泡过夜，用自来水冲洗干净后，再用纯化水冲洗2～3遍，250℃ 30min以上。
1.3 试剂与标准品：鲎试剂、细菌内毒素检查用水、细菌内毒素工作标准品、75%酒精棉。
2、操作步骤2.1供试品的制备: 取NK细胞培养液上清2.2 供试品阳性对照：2λ浓度的内毒素标准溶液2.3按表1制备溶液A、B、C和D。
表1 凝胶限度试验溶液的制备注;A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照2.4 将上述8支管轻轻混匀后用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃内毒素凝胶测定仪中保温60min±2min，小心取出，观察结果。
3、结果判断3.1阳性：缓慢倒转鲎试剂180℃，管内物质是坚实凝胶者，记录为（+）3.2阴性：缓慢倒转鲎试剂180℃，管内物质流动或呈凝胶状但不能保持完整者，记录为（－）3.3 阳性对照管为阳性（+）及阴性对照管为阴性供试品（－），则试验有效。
3.4 供试品2管均为阳性结果（+），应判为不符合规定。
如供试品2管均为阴性结果（－）则符合本法规定。
3.5 供试品2管中如有一管为（+），一管为（－）时，需进行复试。
复试时，供试品组需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定；否则判定供试品不符合规定。
细菌内毒素检查操作规程
*******制药有限责任公司目的：建立一个规范的细菌内毒素检查操作规程。
范围：本规程适用于细菌内毒素检查。
职责：生物检测人员对本规程实施负责。
内容：1 准备工作1.1 设备用具的洗涤及除热原1.1.1 设备与用具刻度吸管(1、2、5、10ml)、10mm³75mm试管、试管架、不锈钢盒(或铝饭盒)、不锈钢筒(或铝筒)、洗耳球、电热干燥箱、恒温水浴箱、定时钟、电冰箱、旋涡混合器。
1.1.2 洗涤及除热原所用的玻璃器皿，先用自来水冲洗，再浸泡在洗液中过夜，取出后用自来水冲洗至pH中性，再用注射用水冲洗三次。
将刻度吸管放入金属筒内，试管、小瓶等放入金属盒内，于250℃干烤至少60分钟，也可采用其其它确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
1.2 试剂与标准品1.2.1 内毒素检查用水(即无热原水)，为内毒素含量不超过0.015Eu/mL的灭菌注射用水。
1.2.2 75%酒精棉。
1.2.3 细菌内毒素工作标准品，系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
由中国药品生物制品检定所标定和供应。
1.2.4 供试品溶液的制备：某些供试品需进行复溶，稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的pH值在6.0—8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家的推荐的适宜的缓冲液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定：药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中：L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg²h)表示，注射剂K=5EU/(kg²h)，放射性药品注射剂K=2.5EU/( kg²h)，鞘内用注射剂K=0.2EU/( kg²h)；M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg²h)、mg/( kg²h)或U( kg²h)表示，人均体重按60Kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。
细菌内毒素检验操作程序
细菌内毒素检验操作程序目的：规范细菌内毒素检验操作程序。
范围：适用于细菌内毒素检查操作。
责任：品质部组织制定，中心化验室负责实施。
内容1准备工作1.1实验设备及用具1.1.1刻度吸管、称量瓶、镊子、安瓿瓶（2ml、5ml）、药匙、250℃烘烤1小时。
1.1.2干燥箱、恒温水浴锅、漩涡混合器、精密天平。
1.1.3剪刀、砂轮片、医用胶布、洗耳球、试管架、脱脂棉球、水银温度计、试管1.2内毒素标准品与实验试剂1.2.1鲎试剂：在使用前应进行灵敏度测定，原则上购进一个批号测定一次。
1.2.2细菌内毒素检查用水（内毒素含量＜0.015Eu/mL灭菌注射用水）。
1.2.3细菌内毒素国家标准品和工作标准品。
1.2.4 75%乙醇、铬酸洗液。
1.3实验用具的消毒处理：凡是参与实验样品或试剂接触的器具，在实验前必须经除细菌内毒素处理，将洗净的器具经纯化水冲洗后，在250℃干热灭菌至少60分钟。
1.4恒温水浴箱内水浴温度调节到37±1℃。
2鲎试剂灵敏度复核2.1根据鲎试剂灵敏度的标示值（如：λ=0.25 EU/ml），细菌内毒素工作标准品加入1ml 细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟。
2.2将工作标准品制备成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度（0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.06 EU/ml）的内毒素标准溶液，备用。
例：工作标准品为160 EU/ml 时30秒。
2.3取18支0.25 EU/ml 鲎试剂，每支中加入0.1mlBET 水，然后分别加入0.1ml2.2中制备好的4个浓度的标准液,按浓度从高到低依次加入，每个浓度加4支，；最后2支加入0.1mlBET 水作阴性对照。
2.4将上述试管用医用胶布封口，垂直放入37℃±1℃水浴锅中，保温60±2分钟。
放入水浴前把水搅动几下，以使水温均匀。
再次检查温度是否在所要求的范围，注意保温和取放过程应避免受到振动造成的假阴性结果。
细菌内毒素检查法
一、基本概念
细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于 0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用 于光度测定法）且对内毒素试验无干扰的灭菌 注射用水。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的 外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤30 分钟以上，也可以采用其他确证不干扰细菌内 毒素检查的适宜方法。 试验操作过程应防止微生物的污染。
一、基本概念
细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测 或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素， 以判断供试品中的细菌内毒素的限量是 否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方式，即凝胶 法和光度测定法，后者包括浊度法和显 色基质法。供试品检测时，可使用其中 任何一种方法进行试验。当测定结果有 争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。
C
2λ /供试品溶液
供试品溶液
1 2 4 8
-----
2λ 1λ 0.5λ 0.25λ
-----
4 4 4 4
2①
D
无/供试品溶液
-----
注：A为阴性对照；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为供试品溶液 ① USP、EP规定为4支平行管
九、供试品的干扰试验
加样反应
NC B溶液(PC系列) 2λ ○ ○ ○ ○ λ ○ ○ ○ ○ 0.5λ 0.25λ 2λ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ C溶液(PPC系列) λ ○ ○ ○ ○ 0.5λ 0.25λ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 供试 品管 ----
十、干扰试验结果分析
反应结果5：增强 E0.5 E0. 25 E0.125
E0.06
NC
细菌内毒素检查操作规程
细菌内毒素检查操作规程细菌内毒素检查操作规程一、实验目的细菌内毒素检查是为了检测样本中是否存在细菌产生的内毒素，可以作为细菌感染的诊断依据和治疗效果评估的指标。
二、实验材料和设备1. 细菌培养基和培养物2. 内毒素检测试剂盒3. 显微镜和载玻片4. 离心机5. 温箱和恒温水浴6. 试管、培养皿、移液器等常规实验用品三、实验步骤1. 培养细菌：将待检测的细菌接种到适当的培养基上，放入温箱中以适当的温度和时间进行培养，使细菌生长至对应的生长期。
2. 收集细菌：将培养好的细菌转移到离心管中，使用离心机将细菌离心沉淀。
3. 细菌裂解：将细菌沉淀加入合适的裂解缓冲液中，使用适当的方法将细菌完全裂解。
4. 澄清液分离：使用离心机将细菌裂解液离心，将上清液转移到新的试管中。
5. 内毒素检测：按照内毒素检测试剂盒说明书的要求，将所得上清液加入试剂盒中，进行内毒素的检测。
6. 结果解读：根据试剂盒的指示，观察试剂盒中的颜色变化或读取光密度等指标，判断样品中是否存在细菌内毒素。
7. 结果验证：使用正负对照样品验证结果的准确性和可靠性。
四、实验注意事项1. 实验过程需要遵守无菌操作的要求，避免细菌污染。
2. 实验中使用的试剂和培养基要在有效期内，并按照要求保存。
3. 实验过程中应注意个人防护，避免接触到有害物质。
4. 操作前要充分了解试剂盒的使用方法和读取结果的标准。
5. 结果解读时要考虑到阳性和阴性对照的结果，以免误判。
6. 使用的设备要事先进行验证和校准，以保证实验结果的准确性和可靠性。
五、实验结果记录和分析1. 记录实验所使用的试剂批号和有效期。
2. 记录实验过程中的注意事项和操作细节。
3. 记录实验结果，包括阳性和阴性对照的结果。
4. 对实验结果进行分析和解释，判断样品中是否存在细菌内毒素。
六、实验结果的报告和存档1. 编写实验报告，包括实验目的、材料和方法、结果分析、结论等内容。
2. 报告中要附带实验记录、数据分析和结果验证等材料。
细菌内毒素检查法
Et
++++ ++++ ++++ - - - - - - 0.125Eu／ml
0.5λ≤ Es ≤ 2λ且 Et =0.5Es,干扰成立
第二十六页，共44页
十、干扰试验结果分析
反应结果4：增强
E0.5
E0. 25
E0.125
E0.06
NC
Es
++++ ++++ - - - - - - - - - - 0.25Eu／ml
SDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06
NPC
Et
++++ ++++ ++++ +- - - - - 0.104Eu／ml ➢ 按中国药典判断：试验有效，但内毒素供试品溶液系列不符合
0干.5扰Es作≤用Et≤。2Es ，则认为干扰试验不成立，即供试品在试验浓度下有
➢ 按阳品在U性S试P,、不验E浓符P判度合断下0.:有5内λ干毒≤扰素E作t供≤用试。2λ品的溶要液求系,列则0认.2为5λ干管扰（试SD验E0.不5）成中立有，一即管供呈试
第二十四页，共44页
十、干扰试验结果分析
反应结果2：
E0.5
E0. 25
E0.125
E0.06
NC Es
++++ ++++ ++++ - - - - - - 0.125Eu／ml
SDE0.5 SDE0. 25 SDE0.125 SDE0.06
细菌内毒素检查法
十、干扰试验结果分析
反应结果1(SD表示供试品溶液) E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 NC
++++ ++++ --------
Es
0.25Eu／ml
SDE0.5
SDE0. 25
SDE0.125
----
SDE0.06 NPC
----
Et
++++ ++++
- - 0.25Eu／ml
七、供试品溶液的制备
某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中 浸提制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的PH值在6.0～ 8.0的范 围内。(USP、EP一般要求供试品溶液与鲎试 剂的混合液的PH值在6.0～ 8.0的范围内。） 对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品， 需要调节被测溶溶液
1 2 4 8
-----
2λ 1λ 0.5λ 0.25λ
-----
4 4 4 4
2①
D
无/供试品溶液
-----
注：A为阴性对照；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为供试品溶液 ① USP、EP规定为4支平行管
九、供试品的干扰试验
加样反应
NC B溶液(PC系列) 2λ ○ ○ ○ ○ λ ○ ○ ○ ○ 0.5λ 0.25λ 2λ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ C溶液(PPC系列) λ ○ ○ ○ ○ 0.5λ 0.25λ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 供试 品管 ----
NC
Es
- - 0.25Eu／ml NPC Et
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09T-I660-01细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程——————————文件类别：技术标准 1/101.目的：建立细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程，并按规程进行检验，保证检验操作规范化。
2.依据：2.1.《中华人民共和国药典》2010年版一部。
3.范围：适用于所有用细菌内毒素检查法(一部)测定的供试品。
4.责任：检验员、质量控制科主任、质量管理部经理对本规程负责。
5.正文：5.1. 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
5.1.1. 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。
5.1.2. 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
5.1.3. 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成。
用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
5.1.4. 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
5.1.5. 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
5.1.6. 试验所用器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
5.2. 供试品溶液的制备：某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节PH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
5.3. 内毒素限值的确定：药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M。
5.3.1. 式中：L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg 或EU/U（活性单位）表示；5.3.2. K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg.h)表示，注射剂K=5EU/(kg.h)，放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg.h)，鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg.h)；5.3.3. M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg.h)、mg/(kg.h)或U/(kg.h)表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计算。
注射时间若不足1小时，按1小时计算。
供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。
5.3.4. 按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。
5.4. 确定最大有效稀释倍数（MVD）：最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数（1→MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。
用以下公式来确定MVD：MVD=CL/λ。
5.4.1. 式中：L为供试品的细菌内毒素限值；5.4.2. C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml，当L 以EU/mg或EU/U 表示时，C的单位需为mg/ml或U/ml。
如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C =λ/L；5.4.3. λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
5.5. 方法1：凝胶法。
5.5.1. 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
5.5.2. 鲎试剂灵敏度复核试验：在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
5.5.3. 根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ),将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制成2.0λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。
取分装有0.1ml 鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.l ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1 ml 细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。
5.5.4. 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阴性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
文件名称：细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程文件编号：09T-I660-01 分发部门：质量控制科5.5.5. 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。
按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。
5.5.5.1. 式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。
反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
5.5.5.2. 当λc在0.5λ～2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
5.5.6. 干扰试验。
按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表1：凝胶法干扰试验溶液的制备编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A 无/供试品溶液—————— 2B 2λ/供试品溶液供试品溶液 12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C 2λ/检查用水检查用水 12482λ1λ0.5λ0.25λ4444注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。
5.5.7. 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。
按下列计算系列溶液C 和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。
Es=antilg（ΣXs/4)Et= antilg（ΣXt/4)式中：Es、Et分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值(lg)。
5.5.8. 当Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。
若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
5.5.9. 可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如滤过、中和、透析或加热处理等）排除干扰。
为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰实验。
5.5.10. 当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
5.5.11. 当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
5.5.12. 检查法。
5.5.12.1. 凝胶限量试验：按表2制备溶液A、B、C和D。
使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。
按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表2：凝胶限量试验溶液的制备注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。
5.5.12.1.1. 结果判断：保温60分钟±2分钟后观察结果。
若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。
5.5.12.1.2. 若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定；若溶液A的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。
若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。
复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定；否则判定供试品不符合规定。
5.5.12.2. 凝胶半定量试验：本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。
按表3制备溶液A、B、C、和D。
按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表3：凝胶半定量试验溶液的制备注：A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。
从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。
B为2 λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）。
C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。
D为阴性对照。
5.5.12.2.1. 结果判断：若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ～2λ之间，试验有效。
5.5.12.2.2. 系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度【按公式CE=antilg(ΣX/2)】。
如果检验时采用的是供试品的稀释数，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。
5.5.13.2.3. 如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数）。
如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
5.5.13.2.4. 若内毒素浓度小于规定的限度，判定供试品符合规定。
若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判定供试品不符合规定。
5.6. 方法2，光度测定法：光度测定法分为浊度法和显色基质法。
5.6.1. 浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。
根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。