免疫印迹技术PPT.ppt
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western-blotting(蛋白免疫印迹)PPT课件
.
20
膜的选择
1. PVDF膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹 法中常用的一种固相支持物。
2. PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔 径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 大于20KD的蛋白选用0.45um的膜，小于20KD的 蛋白选用0.2um的膜。
1.含HRP的抗体； 2.发光试剂； 3.反应的杂质;
.
27
洗脱抗体
一抗洗脱 二抗洗脱 一抗种属来源不同时，strip二抗即可
.
28
三、显色
暗室曝光 Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统
.
29
Tanon 5200---性能特点
适用于高分辨率和高灵 敏度的图像拍摄；
可设定连续采样的次数、 起始及终止曝光时间， 进行动态连续拍摄，拍 摄得高质量的图片；
在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准
确性！ .
7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分 子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二 硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚 成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形 成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。
对
电转仪长期使用导致海绵变薄，
策
“三明治”结构不紧凑导致。
确保膜和胶块之间没有气泡
缓冲液中离子浓度太低，电流或电
压太高。转膜过程注意降温
.
34
四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 膜没有均匀浸湿 2. 膜或者缓冲液污染 3. 封闭不充分 4. 抗体与封闭剂出现交叉
艾滋病抗体检测技术(免疫印迹法)及质量控制ppt课件
艾滋病抗体检测技术(免疫印迹法)及质量控制
WB检测HIV抗体的原理
全病毒裂解液电泳得到的膜条
硝酸纤维试剂膜条上结合了天然灭活的HIV-1型病 毒蛋白的分离颗粒和特异性的HIV-2型合成多肽。 在膜条分别加入稀释的血清或血浆样本或对照， 孵育。如果样本中含有HIV-1和HIV-2型的特异性 抗体，则抗体会与试剂膜条上的HIV-1蛋白和HIV2多肽结合，通过清洗去除试剂膜条上的未结合物， 与HIV蛋白特异性结合的抗体再通过与带有碱性磷 酸酶的羊抗人IgG抗体结合，加入BCIP/NBT底物 等一系列反应即可显色。
“即刻法”只能在前 20次内使用，超出即可采 用L-J质控图方法。
艾滋病抗体检测技术(免疫印迹法)及质量控制
第二章 HIV抗体检测 质控窗口内的质控带，试剂自带内部
过程质控：实验操作全部完成且实验
所用材料处于工作状态；清洁的检测
区背景是内部阴性过程质控；如未有
外部质控品可商用或自制质控品：
7.2 快速法抗体检测质控 红色质控带：试剂盒内质控无效，该 结果无效，须重做。
计算机审核结果来决定。目前有许多质控规则，常用的是12S和13S规则。 （1）告警（12S）：当外部质控品的S/CO值超出 +2s范围时，系统处于告警
状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。若将12S做失控标准， 有较高的假失控概率，所以一般不采用。 （2）失控（13S）：当外部质控品的S/CO值超出 +3s范围时，系统处于失控 状态，本次实验结果不能被接受，可能是系统误差、随机误差或外部质控 品 稳定性下降所致。 7.1.3.3 质控图的分析及失控处理
艾滋病抗体检测技术(免疫印迹法)及质量控制
在HIV颗粒中，外膜蛋白（env）基因编码的 一个蛋白经糖基化后形成包膜蛋白前体 （gp160），其在蛋白酶作用下裂解成外膜蛋白 （gp120）和跨膜蛋白（gp41）；核心蛋白 （gag）基因编码的前体蛋白（p55）被蛋白酶 裂解为衣壳蛋白（p24）和内膜蛋白（p17）， p39为p55的碎片；逆转录酶蛋白（pol）基因编 码的逆转录酶（p66、p51）和核酸内切酶 （p31），而机体对上述HIV蛋白产生相应的抗 体，又在WB中出现相应的不同组合的带型。
WB检测HIV抗体的原理
全病毒裂解液电泳得到的膜条
硝酸纤维试剂膜条上结合了天然灭活的HIV-1型病 毒蛋白的分离颗粒和特异性的HIV-2型合成多肽。 在膜条分别加入稀释的血清或血浆样本或对照， 孵育。如果样本中含有HIV-1和HIV-2型的特异性 抗体，则抗体会与试剂膜条上的HIV-1蛋白和HIV2多肽结合，通过清洗去除试剂膜条上的未结合物， 与HIV蛋白特异性结合的抗体再通过与带有碱性磷 酸酶的羊抗人IgG抗体结合，加入BCIP/NBT底物 等一系列反应即可显色。
“即刻法”只能在前 20次内使用，超出即可采 用L-J质控图方法。
艾滋病抗体检测技术(免疫印迹法)及质量控制
第二章 HIV抗体检测 质控窗口内的质控带，试剂自带内部
过程质控：实验操作全部完成且实验
所用材料处于工作状态；清洁的检测
区背景是内部阴性过程质控；如未有
外部质控品可商用或自制质控品：
7.2 快速法抗体检测质控 红色质控带：试剂盒内质控无效，该 结果无效，须重做。
计算机审核结果来决定。目前有许多质控规则，常用的是12S和13S规则。 （1）告警（12S）：当外部质控品的S/CO值超出 +2s范围时，系统处于告警
状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。若将12S做失控标准， 有较高的假失控概率，所以一般不采用。 （2）失控（13S）：当外部质控品的S/CO值超出 +3s范围时，系统处于失控 状态，本次实验结果不能被接受，可能是系统误差、随机误差或外部质控 品 稳定性下降所致。 7.1.3.3 质控图的分析及失控处理
艾滋病抗体检测技术(免疫印迹法)及质量控制
在HIV颗粒中，外膜蛋白（env）基因编码的 一个蛋白经糖基化后形成包膜蛋白前体 （gp160），其在蛋白酶作用下裂解成外膜蛋白 （gp120）和跨膜蛋白（gp41）；核心蛋白 （gag）基因编码的前体蛋白（p55）被蛋白酶 裂解为衣壳蛋白（p24）和内膜蛋白（p17）， p39为p55的碎片；逆转录酶蛋白（pol）基因编 码的逆转录酶（p66、p51）和核酸内切酶 （p31），而机体对上述HIV蛋白产生相应的抗 体，又在WB中出现相应的不同组合的带型。
免疫血清的应用之免疫印迹PPT精品课程课件讲义
方法已被广为采用，其中三种分别称为Southern、
Northern、Western印迹法，分别用于检测DNA、RNA和蛋 白质。 其中Western印记又称为免疫印迹。
• 免疫印迹是根据抗原抗体的特异性结合，检测复杂样品中
某种蛋白的方法。可以分为斑点印迹和电泳转移印记。
• 电转移印记操作可分为三个过程：
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免疫血清的应用之免疫印迹
主讲：XX XX
凡大医治病，必当安神
定志，无欲无求，先发大慈恻 隐之心，誓愿普救含灵之苦。
- - 孙思邈
PPT内容可自行编辑
开始上课！
一、实验原理
• 印迹法：将生物大分子物质（如核酸或蛋白质）通过不同
的途径转移到固相载体上，转移后的固相载体经淬灭试剂 处理后，用适当的溶液漂洗，置于含底物或探针的溶液中 孵育，可与对于的探针反应，显出特异条带。 • 自从1975年建立印迹法以来，目前比较成熟的有四种印记
• 不足之处：
• 操作要求高
• 成本高
• 结果判断主要依据条带的有无以及条带的亮度
二、实验材料
• • • • • • • • • • • • •
待检抗原：红细胞裂解液；2×SDS凝胶加样缓冲液； SDS-PAGE凝胶制备相关材料； 电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸电泳缓冲液； 预染蛋白质Marker； 染色液，脱色液； 转膜缓冲液； 硝酸纤维素滤膜（NC膜）和定性滤纸； 洗涤液：TBST； 封闭液：以TBST稀释的3％脱脂牛奶； 免疫血清：兔/小鼠抗鸡红血球免疫血清，使用时以TBST稀释100倍； 二级抗体：HRP标记的羊抗兔IgG，使用前以TBST稀释1500倍； 显色液：3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine, DAB）显色试剂； 终止液：灭菌蒸馏水。
抗核抗体谱免疫印迹法课件
操作简便
免疫印迹法自动化程度高， 操作简便，减少了人为误 差。
与其他免疫检测方法的比较
与酶联免疫吸附试验（ELISA）比较
免疫印迹法可以同时检测多个抗原，而ELISA只能检测单个抗原。
与胶体金试纸法比较
免疫印迹法具有更高的灵敏度和特异性，检测结果更可靠。
优缺点分析
优点
高灵敏度、高特异性、操作简便 、可同时检测多个抗原。
原理
该方法基于抗原抗体反应的原理，将ANA与固相载体上的核抗原进行反应，再 通过显色反应或放射自显影等方法检测ANA的存在和滴度。
发展历程与现状
发展历程
自20世纪50年代发现ANA以来，抗核抗体谱免疫印迹法经历了放射免疫分析法、酶 联免疫吸附法（ELISA）等不同发展阶段，目前已经形成了较为成熟的检测技术。
实验操作应严格按照操作流程 进行，避免出现误差。
实验结束后应及时清洗实验器 具，整理实验台面，保持实验
室整洁。
03
抗核抗体谱免疫印迹法结果解读
结果判读标准
阴性质控
阴性结果，表示未检测 到抗核抗体谱。
弱阳性
弱阳性结果，表示抗核 抗体谱水平较低，可能
存在轻度异常。
阳性
阳性结果，表示抗核抗 体谱水平较高，可能存
缺点
成本较高、需要专业设备和技术 人员。
05
抗核抗体谱免疫印迹法的未来发展与
展望
新技术与新方法的应用
人工智能与机器学习
利用人工智能技术对免疫印迹图像进行自动识别和分析，提高检 测的准确性和效率。
纳米技术与生物传感器
应用纳米技术提高免疫印迹法的灵敏度和特异性，同时开发新型生 物传感器用于快速检测。
在免疫系统疾病。
强阳性
蛋白质免疫印迹实验(Western-BlotPPT课件
硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
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1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
免疫印迹法的实验技术PPT课件
根据实验结果和反馈，不断优化和改 进实验条件和方法，提高实验质量。
改进实验方法
积极探索和尝试新的实验方法和技术， 提高实验效率案例一：病毒抗原的检测
总结词
高效、准确
详细描述
免疫印迹法在病毒抗原检测中具有高效、准确的优点，能够快速识别病毒抗原， 为临床诊断和治疗提供有力支持。
疾病诊断
药物研发
通过检测患者血清或其他体液中的蛋白质 表达水平，辅助医生对疾病进行早期诊断 、分型和监测病情进展。
在药物筛选和药效评估过程中，利用免疫 印迹法检测药物对特定蛋白质表达的影响 ，从而评估药物的疗效和安全性。
生物标志物研究
蛋白质相互作用研究
通过免疫印迹法检测生物样本中特定蛋白 质的表达水平，有助于揭示生物标志物与 疾病发生、发展之间的关系。
存。
03
实验操作流程
样品处理与分离
样品选择
选择适当的组织或细胞样品，确保其具有代 表性。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和蛋白提取试剂，确保蛋 白质的完整性和活性。
细胞分离
根据细胞类型和实验需求，采用不同的分离 方法，如组织匀浆、离心等。
蛋白定量
采用BCA法、Bradford法等方法对提取的蛋 白进行定量，以便后续操作。
转印与封闭
01
02
03
转印膜选择
根据实验需求选择适当的 转印膜，如NC膜、PVDF 膜等。
转印条件
设置适当的电流、电压和 转印时间，确保蛋白质成 功转移至膜上。
封闭操作
采用合适的封闭液对转印 膜进行封闭，以减少非特 异性结合。
免疫反应与显色
一抗选择
根据实验目的选择特异性的一抗，确 保与目标蛋白的结合。
案例二：肿瘤标志物的检测
蛋白质免疫印迹技术及PPT课件
实验案例二：蛋白质相互作用分析
总结词
蛋白质相互作用分析有助于了解蛋白质之间的相互作用关系，进一步揭示生物学过程的分子机制。
详细描述
在实验中，首先将蛋白质样品进行分离和提纯，然后通过电泳分离蛋白质，再将其转移到膜上。接下 来，利用抗体技术检测两种蛋白质是否相互作用。这种方法可以用于研究蛋白质之间的相互作用关系 ，为生物学过程的研究提供重要信息。
归一化处理
将目标蛋白的密度与内参蛋白的密 度进行归一化，消除实验误差。
统计学分析
对实验组和对照组的数据进行统计 分析，比较组间差异。
数据分析的注意事项
数据可靠性
确保数据来源可靠，避免数据污染和误差。
数据可比性
确保实验条件一致，使数据具有可比性。
数据解读
结合生物学背景和实验目的，对数据进行合理解 读。
凝胶电泳
01
02
03
确定电泳条件
根据蛋白大小和分离需求， 选择合适的凝胶浓度和电 泳电压。
加样与电泳
将稀释后的蛋白样品加入 凝胶的加样孔中，开始电 泳分离蛋白质。
染色与脱色
电泳结束后，对凝胶进行 染色，使蛋白质条带显现 出来，然后进行脱色处理。
转膜
选择合适的转移膜
根据需要，选择NC膜、 PVDF膜等适合的转移膜。
实验操作流程
1. 样品制备
将细胞或组织提取蛋白，进行浓 度测定。
2. 阻断
将膜置于脱脂奶粉或BSA中，封 闭非特异性结合位点。
3. 抗体孵育
将抗体与膜在适当条件下孵育， 使抗体与目标蛋白结合。
6. 结果观察
通过荧光显微镜或其他成像设备 观察蛋白条带。
5. 显影
将荧光染料或其他标记物与抗体 结合，使蛋白在膜上显像。
Wesern-bloing蛋白免疫印迹实验ppt课件
子时要使梳子保持水平。）
④ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
27
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
①测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋 白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白 变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2.结果分析
3.注意事项
四
实验室常见问题解答
20
蛋白样品制 备 蛋白含量测
定
21
在六孔板中，按照一 个孔添加150μL的比 例添加适量RIPA裂解 液，用枪吹打均匀以 充分接触细胞。
样品放置冰上 30min（中间混 匀5-6次）直至 裂解完全。
充分裂解后，1000014000g离心3-5分钟， 取上清，即可进行后续 的PAGE、Western和免 疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃 板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气
泡也可能使样品溢出。）
28
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟，可多跑几分钟； 分离胶180V电压跑 至底端。
疾病早期诊断
例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
5
检测样品中特异性蛋白质是否
④ 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，
槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
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清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
①测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋 白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白 变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
2.结果分析
3.注意事项
四
实验室常见问题解答
20
蛋白样品制 备 蛋白含量测
定
21
在六孔板中，按照一 个孔添加150μL的比 例添加适量RIPA裂解 液，用枪吹打均匀以 充分接触细胞。
样品放置冰上 30min（中间混 匀5-6次）直至 裂解完全。
充分裂解后，1000014000g离心3-5分钟， 取上清，即可进行后续 的PAGE、Western和免 疫沉淀等操作
②加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃 板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样 器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气
泡也可能使样品溢出。）
28
清洗玻 璃板
配 胶
上样
电泳
停止电 泳
浓缩胶80V电压跑20 分钟，可多跑几分钟； 分离胶180V电压跑 至底端。
疾病早期诊断
例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.
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检测样品中特异性蛋白质是否
免疫印迹技术 ppt课件
试剂名称 氟化钠 正钒酸钠 焦磷酸钠 抑制作用 酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶 丝氨酸-苏氨酸磷酸
ppt课件
13
2.5 还原剂
. 防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。 DTT、β－巯基
乙醇等。
2.6 其它
水；溶剂; NaCl。
超纯水的电阻率就是单位厘米内的水 的电阻值。 即18.25MΩ*CM.
ppt课件 14
2.7 全蛋白抽提时注意事项
抑制蛋白酶及磷 酸酶
裂解液的用量
可以适量加入甘 油,稳定蛋白
注意事项
细胞或组织的样 本量
使 用 的 Detergent 的 种 类 纯度 浓度 干 扰 去除等因素
可以适量加入 Benzonase /DNase I等核酸 酶 , 去 除 DNA, 充 分提取蛋白,降 低提取的粘度.
一个稳定而不断向阳极移动的界面。
由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集 聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数
2、细胞裂解液
缓冲液 表面活性剂
其它：H2O、NaCl、等
RIPA Buffer
蛋白酶抑制剂
还原剂
磷酸酶抑制剂
ppt课件
10
2.2 表面活性剂
溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 分为
1 阴离子型: SDS，脱氧胆酸盐 2 阳离子型: CPB和CTAB 3 双性离子型: CHAPS和Zwittergent系列 4 非离子型: Brij系列、Triton-100 、Nonidet P40、Tween 系列等
即可计算待测蛋白的浓度。
BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织 细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影
ppt课件
13
2.5 还原剂
. 防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。 DTT、β－巯基
乙醇等。
2.6 其它
水；溶剂; NaCl。
超纯水的电阻率就是单位厘米内的水 的电阻值。 即18.25MΩ*CM.
ppt课件 14
2.7 全蛋白抽提时注意事项
抑制蛋白酶及磷 酸酶
裂解液的用量
可以适量加入甘 油,稳定蛋白
注意事项
细胞或组织的样 本量
使 用 的 Detergent 的 种 类 纯度 浓度 干 扰 去除等因素
可以适量加入 Benzonase /DNase I等核酸 酶 , 去 除 DNA, 充 分提取蛋白,降 低提取的粘度.
一个稳定而不断向阳极移动的界面。
由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集 聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数
2、细胞裂解液
缓冲液 表面活性剂
其它：H2O、NaCl、等
RIPA Buffer
蛋白酶抑制剂
还原剂
磷酸酶抑制剂
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10
2.2 表面活性剂
溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 分为
1 阴离子型: SDS，脱氧胆酸盐 2 阳离子型: CPB和CTAB 3 双性离子型: CHAPS和Zwittergent系列 4 非离子型: Brij系列、Triton-100 、Nonidet P40、Tween 系列等
即可计算待测蛋白的浓度。
BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织 细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影
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Western Blot基本原理
一种将凝胶电泳与固相免疫结合起来的分子生物学技术。 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相 支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
其基本过程主要有 2
1
三个工序：
1、将蛋白质经凝胶
电泳按分子量大小
不同依次分离；
2、将分离的组分转 3
印到印迹膜上；
3、对转印到印迹膜
2、膜蛋白样本制备
3、亚细胞分级抽提
❖ 用超离心技术分离出细胞 器、质膜和细胞核等成分， 再用适当的蛋白质溶解液 进行溶解。其优点是不仅 大大减少样品的复杂性， 而且可对分离的蛋白质进 行亚细胞定位。但该法需 要专业仪器，有时会出现 假阳性。
❖ 根椐胞浆/胞膜/胞核/骨架 蛋白的亚细胞策略用不同 提取液逐级溶解
表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆 酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子 型（Triton X-100 、Tirton X-114、吐温60及吐温80）等。
2、细胞裂解液
缓冲液
表面活性剂
其它：H2O、NaCl、等
RIPA Buffer
蛋白酶抑制剂
还原剂
磷酸酶抑制剂
2.1 缓冲液
上的蛋白成分进行
免疫学检测。
2、蛋白质的性质、分类与分布
➢种类：细胞、组织、微生物、酵母 ➢亚细胞定位：胞浆、胞膜、胞核、细胞器 ➢性质：水溶、脂溶 ➢其他：含量多少、分子量大小、磷酸化等
3、方法的选择
➢自行配制抽提试剂, 根据文献方 法或经验提取 ➢购买商品化试剂盒, 按其说明书 的方法提取
免疫印迹技术
基本概念
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后 利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 （NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片 段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析， 对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后 的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电 泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法
稳定pH环境，使蛋白保持自然构象，增加溶解性。 有 Tris-HCl，HEPES (H+)，MOPS等体系（pH7.5)
2.2 表面活性剂
溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 分为
1 阴离子型: SDS，脱氧胆酸盐 2 阳离子型: CPB和CTAB 3 双性离子型: CHAPS和Zwittergent系列 4 非离子型: Brij系列、Triton-100 、Nonidet P40、Tween 系列等
➢ 常规的抑制剂主要包括：
试剂名称 氟化钠 正钒酸钠 焦磷酸钠
抑制作用 酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶 丝氨酸-苏氨酸磷酸
2.5 还原剂
防止蛋白. 质发生氧化，保护二硫键。DTT、β－巯基 乙醇等。
2.6 其它
水；溶剂; NaCl。
超纯水的电阻率就是单位厘米内的水 的电阻值。 即18.25MΩ*CM.
四种亚细胞组分分离提取的结果
5、其它蛋白抽提产品
高丰度蛋白去除试剂盒 信号蛋白提取试剂盒 糖蛋白提取试剂盒 细菌蛋白提取试剂盒 酵母蛋白提取试剂盒 植物蛋白提取试剂盒
四 蛋白定量产品选择指南
1、BCA法蛋白定量
➢ BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白质定量方法。该方法因快 速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备 受专业人士的青睐。
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2.3 蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒
抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化， 使用前临时加入
➢ 磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷 酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（例如：PP1, PP2A, PP2B） 、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。
➢ 原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形 成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比， 即可计算待测蛋白的浓度。
➢ BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织 细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影 响检测结果，但螯合剂（EDTA，EGTA）、还原剂（DTT，巯基乙醇） 和脂类会对检测结果有一定影响。
2.7 全蛋白抽提时注意事项
抑制蛋白酶及磷 酸酶
可以适量加入甘 油,稳定蛋白
注意事项
使用的 Detergent的种 类 纯度 浓度 干 扰 去除等因素
可以适量加入
Benzonase /DNase I等核酸 酶,去除DNA,充 分提取蛋白,降 低提取的粘度.
➢裂解液的用量
细胞或组织的样 本量
Temperature 试剂和器皿冰上 预冷,低温4℃操 作
2.8 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点
三 蛋白样本制备产品选择
1、核蛋白样本制备
抽提原理
➢低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白与 胞核; ➢离心分离出胞核; ➢高渗破裂胞核,释放出可溶性核蛋白; ➢加核酸酶降解DNA,释放出DNA结 合蛋白(组蛋白和转录因子)
实验注意事项
➢试剂和器皿冰上预冷 ➢裂解液的用量 ➢细胞总量 ➢抑制蛋白酶：蛋白酶抑制剂
二 细胞中总蛋白的制备
裂解样品
离心收集
定量检测
细胞加入裂解 液冰上放置 10-15分钟
高速离心收集 上清即得全蛋 白样本
蛋白定量和
SDS-PAGE 检测
1、组织或细胞破碎
机械匀浆 组织分散机、玻璃 超声破碎 反复冻融
干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解， 反复操作 低渗溶液 去污裂解液
➢ 实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用 Bradford法测定蛋白浓度。
2、Bradford法蛋白定量
➢ 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大 吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕 黑色变为兰色。
➢ 原理：染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香 族氨基酸残基相结合。