免疫印迹技术PPT.ppt

四种亚细胞组分分离提取的结果
5、其它蛋白抽提产品
高丰度蛋白去除试剂盒 信号蛋白提取试剂盒 糖蛋白提取试剂盒 细菌蛋白提取试剂盒 酵母蛋白提取试剂盒 植物蛋白提取试剂盒
四 蛋白定量产品选择指南
1、BCA法蛋白定量
➢ BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白质定量方法。该方法因快 速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备 受专业人士的青睐。
2.8 细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点
三 蛋白样本制备产品选择
1、核蛋白样本制备
抽提原理
➢低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白与 胞核; ➢离心分离出胞核; ➢高渗破裂胞核,释放出可溶性核蛋白; ➢加核酸酶降解DNA,释放出DNA结 合蛋白(组蛋白和转录因子)
实验注意事项
➢试剂和器皿冰上预冷 ➢裂解液的用量 ➢细胞总量 ➢抑制蛋白酶：蛋白酶抑制剂
2、膜蛋白样本制备
3、亚细胞分级抽提
❖ 用超离心技术分离出细胞 器、质膜和细胞核等成分， 再用适当的蛋白质溶解液 进行溶解。其优点是不仅 大大减少样品的复杂性， 而且可对分离的蛋白质进 行亚细胞定位。但该法需 要专业仪器，有时会出现 假阳性。
❖ 根椐胞浆/胞膜/胞核/骨架 蛋白的亚细胞策略用不同 提取液逐级溶解
上的蛋白成分进行
免疫学检测。
2、蛋白质的性质、分类与分布
➢种类：细胞、组织、微生物、酵母 ➢亚细胞定位：胞浆、胞膜、胞核、细胞器 ➢性质：水溶、脂溶 ➢其他：含量多少、分子量大小、磷酸化等
3、方法的选择
➢自行配制抽提试剂, 根据文献方 法或经验提取 ➢购买商品化试剂盒, 按其说明书 的方法提取
Western Blot基本原理
一种将凝胶电泳与固相免疫结合起来的分子生物学技术。 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相 支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
其基本过程主要有 2
1
来自百度文库
三个工序：
1、将蛋白质经凝胶
电泳按分子量大小
不同依次分离；
2、将分离的组分转 3
印到印迹膜上；
3、对转印到印迹膜
表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆 酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子 型（Triton X-100 、Tirton X-114、吐温60及吐温80）等。
2、细胞裂解液
缓冲液
表面活性剂
其它：H2O、NaCl、等
RIPA Buffer
蛋白酶抑制剂
还原剂
磷酸酶抑制剂
2.1 缓冲液
二 细胞中总蛋白的制备
裂解样品
离心收集
定量检测
细胞加入裂解 液冰上放置 10-15分钟
高速离心收集 上清即得全蛋 白样本
蛋白定量和
SDS-PAGE 检测
1、组织或细胞破碎
机械匀浆 组织分散机、玻璃 超声破碎 反复冻融
干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解， 反复操作 低渗溶液 去污裂解液
➢ 实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用 Bradford法测定蛋白浓度。
2、Bradford法蛋白定量
➢ 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大 吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕 黑色变为兰色。
➢ 原理：染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香 族氨基酸残基相结合。
免疫印迹技术
基本概念
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后 利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 （NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片 段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析， 对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后 的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电 泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法
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2.3 蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒
抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临时加入
2.4 磷酸酶抑制剂选择
抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化， 使用前临时加入
➢ 磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷 酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（例如：PP1, PP2A, PP2B） 、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。
稳定pH环境，使蛋白保持自然构象，增加溶解性。 有 Tris-HCl，HEPES (H+)，MOPS等体系（pH7.5)
2.2 表面活性剂
溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 分为
1 阴离子型: SDS，脱氧胆酸盐 2 阳离子型: CPB和CTAB 3 双性离子型: CHAPS和Zwittergent系列 4 非离子型: Brij系列、Triton-100 、Nonidet P40、Tween 系列等
2.7 全蛋白抽提时注意事项
抑制蛋白酶及磷 酸酶
可以适量加入甘 油,稳定蛋白
注意事项
使用的 Detergent的种 类 纯度 浓度 干 扰 去除等因素
可以适量加入
Benzonase /DNase I等核酸 酶,去除DNA,充 分提取蛋白,降 低提取的粘度.
➢裂解液的用量
细胞或组织的样 本量
Temperature 试剂和器皿冰上 预冷,低温4℃操 作
➢ 原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形 成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比， 即可计算待测蛋白的浓度。
➢ BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织 细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影 响检测结果，但螯合剂（EDTA，EGTA）、还原剂（DTT，巯基乙醇） 和脂类会对检测结果有一定影响。
➢ 常规的抑制剂主要包括：
试剂名称 氟化钠 正钒酸钠 焦磷酸钠
抑制作用 酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶 丝氨酸-苏氨酸磷酸
2.5 还原剂
防止蛋白. 质发生氧化，保护二硫键。DTT、β－巯基 乙醇等。
2.6 其它
水；溶剂; NaCl。
超纯水的电阻率就是单位厘米内的水 的电阻值。 即18.25MΩ*CM.