糖类结构鉴定

单糖组分（连玉红）

标准样品的配制：取葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸10 mg，加5ml水配成2mg/mL的溶液。

1、多糖水解

取l0mg纯化后多糖，加入5mL 2mol/L的三氟乙酸(1.5mL 三氟乙酸+8.5mL 蒸馏水)，充氮气保护，封管，于120℃下水浴5 h 。反应物用氮气吹干，加入2mL甲醇重新溶解，再用氮气吹干，以充分带走TFA。

2、糖腈乙酰酯衍生物的制备

将降解后的多糖中加入5mg 盐酸羟胺，2mg肌醇，0.5ml吡啶，振荡混匀，放入90℃水浴中加热30min。取出后冷却至室温，加入醋酸酐0.5ml，于90℃水浴中继续反应30min进行乙酰化。将反应物用氮气吹干，加入氯仿1ml重新溶解，再用氮气吹干，反复进行3~4次。最后加入2ml氯仿复溶，供气相色谱分析使用。

3、气相色谱条件

色谱柱：OV-225-capillary column；内径：0.25mm；检测器：氢火焰离子化检测器(FID)；检测器温度：280 ℃；进样口温度：250 ℃；载气：N2 (40 mL/min)。以单糖标准品建立GC标准图谱为参照，根据多糖完全水解样品的出峰时间和峰面积比可知样品的单糖组成和摩尔比。

单糖组分（廖文镇）

1、水解：称取20 mg 的雪莲果多糖于安瓿瓶中，加入4 mL 2 mol/L 三氟乙酸（TFA），用酒精喷灯对安瓿瓶进行封口后置于105℃下反应6 小时。反应完后，冷却至室温，将多糖水解液与适量的甲醇混合后，减压旋转蒸干，再加入适量的甲醇，减压旋转蒸干，重复 5 次以完全去除残留的三氟乙酸。

2、衍生化：往干燥后的竹荪多糖水解物中加入0.5 mL 吡啶和10 mg 盐酸羟胺，置于95℃下恒温震荡反应30 分钟，反应完后冷却，加入0.5 mL 醋酸酐，于95℃下进行乙酰化反应35 分钟，最终生产糖腈乙酸酯衍生物。所有的单糖标准品也按照上述步骤进行衍生化。

3、色谱条件：色谱仪为Dionex ICS-3000 离子色谱仪，检测器为电导检测器；色谱柱为Carbopac PA20 柱（2×250 mm）；流速为0.6 mL/min，柱温为20℃，采用梯度洗脱方式：0-2 min：100% 200 mmol/L NaOH，2.1-20 min：10%

20 mmol/L NaOH + 90%超纯水，20.1-40 min：100% 200 mmol/L NaOH。

单糖组分（葛玉）

分别取多糖样品各20mg置于安瓿瓶中，加入8mL 2mol/L的H2SO4，使充分溶解后封管，于烘箱中120℃水解10 h,冷却至室温，BaCO3中和，过滤去除沉淀，上清夜减压浓缩至干，然后置于P2O5干燥器中24h。将上述20mg多糖样品水解物、标准单糖各10mg及10 mg混合标准单糖在五氧化二磷干燥器中干燥24h，以0.2mL吡啶溶解，加六甲基二硅胺烷一三甲基氯硅烷(2:1)0.2 mL,于60℃烘箱中放置10 min，离心除去沉淀，进样。气相色谱条件是：OV-17毛细柱；FID 检测器；气化温度180-220℃(6℃/min)；检测器温度300℃；进样口温度280℃；氮气为载气，流速46mL/min；进样量0.5 uL

单糖组分（殷君艺）

称取3-5 mg PLP-1于水解管中，加入2 mL 2 mol/L TFA，真空封管后于120℃下水解2h，冷却至室温，70℃水浴下N2挥干。分别往水解液和单糖标准品中加入10 mg盐酸羟胺和0.5 mL吡啶，再加入0.5 mL醋酐，置于90℃水浴中反应30min，得糖腈乙酸酯衍生物，过0.45 µm有机系滤膜。

GC 分析条件：DB-1701 石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)，FID检测器，以N2为载气；N2流速为30mL/min，空气流速为300 mL/min，H2流速为30mL/min；检测器温度250℃，进样口温度250℃，升温程序，170℃(2min) -250℃(10℃/min)，250℃下保持20 min。

多糖分子量测定（邵丽）

采用高效体积排阻色谱（HPSEC）检测多糖的纯度及其分子量分布。以不同分子量的Dextran 为标准品，重均分子量Mw分别为2,500，21,400，133,800 和2,000,000 Da。采用Waters Ultrahydrogel TM Linear（7.8×300 mm，10 µm）凝胶柱，2 柱串联；检测器：Waters 2410 示差折光检测器和紫外检测器；流动相：0.1 mol/L NaNO3；流速：0.9 mL/min；柱温：45℃；上样体积：20 µL。多糖样品配成0.2 mg/mL 溶液，过0.22 µm 的滤膜上样分析，根据保留时间T R，通过回归方程计算样品的重均分子量。

多糖分子量测定（廖文镇）

一、色谱条件：本实验采用美国Water 公司的高效凝胶渗透色谱（High-Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）法测定竹荪多糖DP1 的分子量分布，所用的色谱柱为日本Tosoh 公司的TSK-GEL G-5000 PWxL column（300 mm×7.8 mm i.d.，10 μm）和TSK-GEL G-3000 PWxL column 串联。所用流动相为0.01 mol/L 的KH2PO4；流速为0.6 mL/min；柱温为35℃；所用检测器为2414 型示差折光检测器。

二、分子量校正标准曲线建立：将不同分子量的葡聚糖标准品（5200、16800、27300、4100000、6700000 和1400000 Da）用流动相配成1.0 mg/mL 的标准液，上样量15 μL。以洗脱体积V 为横坐标，以葡聚糖标准品分子量的对数值logMW 为纵坐标，Breeze GPC 软件对曲线进行回归拟合绘制分子量校正曲线。多糖分子量测定（连玉红）

DextranT-系列标准葡聚糖：T-2000 (Mw > 2000000)、T-500 (Mw450000)、T-70(Mw68500)、T-40 (Mw44000)、T-10 (Mwl0000)；临用前用三蒸水配成5mg/mL的溶液，用0.22 μm水系针式过滤器过滤，进样量为20 μL；流动相为三蒸水(用前过膜脱气)，流速0.6 mL/min。进样次序由小分子到大分子，分别一个一个地进入，以各标样分子量的对数对样品的保留时间作图，绘制标准曲线。取纯化后的多糖样品，用三蒸水配成5mg/mL的溶液，用0.22 μm水系针式过滤器过滤后进样。色谱条件为：安捷伦-1200型高效液相色谱仪；TSK-gel G4000PWxL凝胶色谱柱(30cm×7.8mm×l0um)，柱温为30℃；示差检测器(RID)，检测温度为35℃；流动相为三蒸水，流速0.6mL/min。按上述方法进行HPLC分析，测得保留时间代入标准曲线，即可求出多糖样品的分子量，同时根据液相色谱图的峰型来判断多糖样品的纯度。

红外光谱（廖文镇）

红外光谱法是多糖初级结构鉴定中最为常用的工具，主要用于分析多糖的糖环构象和糖苷键的类型。

称取2 mg 雪莲果多糖，与适量的KBr 粉末混合，研磨均匀后进行压片。