酯的氨解

亲核试剂：在反应过程中供给电子进攻反应物中带部分正电荷原子的试剂称为亲核试剂。

常见的亲电试剂与亲核试剂如下：

酯与胺反应生成酰胺

双分子亲核取代反应

S N2反应（双分子亲核取代反应）是亲核取代反应的一类，其中S代

表取代（Substitution），N代表亲核（Nucleophilic），2代表反应的决速步涉及两种分子。与S N1反应相对应，S N2反应中，亲核试剂带着一对孤对电子进攻具亲电性的缺电子中心原子，形成过渡态的同时，离去基团离去。反应中不生成碳正离子，速率控制步骤是上述的协同步骤，反应速率与两种物质的浓度成正比，因此称为双分子亲核取代反应。

反应机理

S N2反应最常发生在脂肪族sp3杂化的碳原子上，碳原子与一个电负性强、稳定的离去基团（X）相连。亲核试剂（Nu）从离去基团的正后方进攻碳原子，Nu-C-X角度为180°，以使其孤对电子与C-X键的σ*反键轨道可以达到最大重叠。然后形成一个五配位的反应过渡态，碳约为sp2杂化，用两个垂直于平面的p轨道分别与离去基团和亲核试剂成键。C-X的断裂与新的C-Nu键的形成是同时的，X很快离去，形成含C-Nu键的新化合物。

由于亲核试剂是从离去基团的背面进攻，故如果受进攻的原子具有手性，则反应后手性原子的立体化学发生构型翻转，也称“瓦尔登翻转”。这也是S N2反应在立体化学上的重要特征。反应过程类似于大风将雨伞由里向外翻转。

例如溴乙烷与氢氧根离子发生S N2生成乙醇和溴离子。

上例中，OH−（亲核试剂）进攻C2H5Br（底物）发生S N2反应，经过不稳定的过渡态，最终Br−离去，得到乙醇。

S N2反应一般发生在伯碳原子上，很难成为有位阻分子的反应机理，并且取代基越多，按S N2机理反应的可能性越小。基团在空间上比较拥挤的分子一般采用S N1机理，可以缓解一部分的位阻，也可生成较稳定的碳正离子（通常为三级碳正离子）。

影响因素

离去基团的碱性：离去基团的碱性越强，其离去能力越弱，反之亦然。氨是碱性物质，但当氨分子中的氢原子被酰基取代后则碱性减弱，它不能使石蕊变色，一般认为是中性化合物。这是由于酰胺中氮原子上未共用电子对与碳氧双键形成p，π-共轭，从而使氮原子上电子云密度降低，因此减弱了它接近质子的能力，故碱性大大降低。与此同时，氮氢键的极性又有所增强，从而又表现了微弱的酸性。所

以，是一个很好的离去基团，有利于反应的进行。

亲核试剂的亲核性：亲核性需要与上面的碱性相区别。碱性是试剂对质子的亲和能力，而亲核性是试剂形成过渡态时，对碳原子的亲和能力。一般来讲，试剂的负电性、碱性和可极化性越强，其亲核性也越强。实际上通常需要综合考虑这几个因素以及溶剂的影响。而亲核性：I-

溶剂：S N2反应在质子溶剂中进行时，一方面，溶剂化作用有利于

离去基团的离去；另一方面，溶剂也会与亲核试剂发生作用，使亲核试剂与底物的接触变得困难。最后的影响是这两种因素的综合结果。相对而言，极性非质子性分子很少包围负离子，因此对S N2反应是有利的。而DMF，DMSO都是极性疏质子性溶剂，也有利于实验的进行。

空间效应：立体阻碍性（含体积大的取代基）会使亲核试剂的亲核性下降。空间效应基本上与链长短无关，主要与碳原子上的取代基多少有关，如果取代基越多，那各取代基的空间位置基本固定，键就无法自由旋转，所以我们说空间效应比较大。而与链长无关。

NHS ester reaction scheme for chemical conjugation to a primary amine. (R) represents a labeling reagent or one end of a crosslinker having the NHS ester reactive group; (P) represents a protein or other molecule that contains the target functional group (i.e., primary amine).

综上反应条件

1、Calculate required amount of NHS ester:

NHS_ester_weight [mg] = 8 ×amino_compound_weight [mg] ×NHS_ester_molar_weight [Da] / amino_compound_molar_weight [Da].

2、Dissolve NHS ester in 1/10 reaction volume of DMF or DMSO. Amine-free DMF is preferred solvent.

3、Dissolve biomolecule in 9/10 reaction volume of buffer with pH

8.3-8.5. The reaction of NHS esters with amines is strongly pH-dependent: at low pH, the amino group is protonated, and no modification takes place. At

higher-than-optimal pH, hydrolysis of NHS ester is quick, and modification yield diminishes. Optimal pH value for modification is 8.3-8.5.

配制100ml pH8．34的磷酸缓冲液(PBS)配制方法可以这样配制：

1/15 mol/L Na2HPO4溶液的配制：准确称取Na2HPO4•12H2O 2.3876 g，用水溶解，定容至100 mL；

1/15 mol/L KH2PO4溶液的配制：准确称取KH2PO4 0.4540 g，用水溶解，定容至100 mL；再取上述1/15 mol/L Na2HPO4溶液97.5ml＋l/15 mol/L KH2PO4溶液2.5ml即得

0.1 M Sodium bicarbonate solution has appropriate pH. Other alternatives are 0.1 M Tris buffer(although Tris has amino group, it is hindered and does not react with NHS esters), or 0.1 M phosphate buffer. Note pH is the most important thing. While Tris is primary amine is not compatible, because it competes for reaction; however, in some procedures, it is useful to add Tris or glycine buffer at the end of a conjugation procedure to quench (stop) the reaction.

4、Add NHS ester solution to the solution of biomolecule, and vortex well. Keep on ice overnight, or at room temperature during at least 4 hours.

5、Purify the conjugate using appropriate method: gel-filtration for macromolecules is most universal. Precipitation and chromatography is another alternative. Organic impurities (such as N-hydroxysuccinimide, NHS ester, acid produced by hydrolysis) are almost always easily separated. For proteins and nucleic acids, ethanol or acetone precipitation can be used.