几种常用生物活性测试方法简介共37页
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
细胞活性检测方法
细胞活性检测方法细胞活性检测方法主要用于评估细胞的生存和功能状态，广泛应用于生物医学研究、药物筛选、环境监测等领域。
目前，细胞活性检测方法主要可以分为细胞形态学观察方法、细胞色素检测方法、细胞代谢活性检测方法、细胞增殖检测方法和细胞毒性检测方法等。
细胞形态学观察方法是通过显微镜观察细胞的形态、结构和运动等来评估细胞的活性。
常用的方法有细胞染色、免疫细胞化学染色、电子显微镜观察等。
细胞染色常用的方法有吉姆萨染色、伊红染色、达科显色等，通过染色剂与细胞器和细胞成分的特异性反应，可以评估细胞的形态和结构是否正常。
免疫细胞化学染色则是利用抗体与特定蛋白结合，通过免疫反应染色的位置和强度来评估细胞中特定蛋白的分布以及相关的细胞活性。
电子显微镜观察可以提供更高分辨率的细胞形态和结构信息。
细胞色素检测方法主要用于评估细胞中某些特定酶或分子的活性水平。
例如，青蛙卵中的细胞色素-c还原酶活性检测是通过测定细胞中细胞色素-c的还原酶活性来评估细胞的呼吸功能。
此外，细胞色素琥珀酸酶、醛酮还原酶、过氧化物酶等也是常用的酶活性检测指标。
这些方法主要通过测定细胞中特定酶的底物转化产物的生成量或底物消耗量来间接评估细胞中该酶的活性水平。
细胞代谢活性检测方法是通过测定细胞中一些代谢产物的水平来评估细胞的代谢活性。
例如，细胞呼吸活性检测方法可以通过测定细胞中耗氧量或产生的二氧化碳量来评估细胞的呼吸代谢活性。
蛋白质、核酸和糖类代谢等也可以通过测定细胞中相关代谢产物的水平来评估细胞的代谢活性。
细胞增殖检测方法主要用于评估细胞的增殖能力。
常用的方法有细胞计数、增殖染料标记和细胞周期分析等。
细胞计数是通过手动显微镜观察或自动计数器进行的，可以定量评估细胞的增殖数目。
增殖染料标记则是利用细胞内染料的稳定性或代谢产物的积累来评估细胞的增殖活性。
细胞周期分析是通过流式细胞术来确定细胞在G0/G1、S和G2/M等不同细胞周期阶段的比例，从而评估细胞的增殖能力。
生物活性分子的分离和鉴定方法探究
生物活性分子的分离和鉴定方法探究随着科学技术的发展，人类对生物活性分子的研究日益深入。
生物活性分子是指在生物体内或生物过程中起重要调节作用的分子，如激素、酶、抗体等。
它们的分离和鉴定是生物学、医学、药学等领域研究的重点。
本文将对生物活性分子的分离和鉴定方法进行探究。
一、分离方法1、层析法层析法是一种基于化学物理性质的分离方法，可用于分离具有不同性质的生物活性分子。
它根据分子在不同介质中的亲疏性、极性、电荷等性质进行分离。
常见的层析法包括凝胶、离子交换、亲和、逆相等。
凝胶层析法是一种按照分子大小分离的方法。
它将样品加入凝胶柱中，样品中的分子将在凝胶中缓慢通过，不同尺寸的分子经过减速效应后分别通过柱床。
离子交换层析法是一种按电荷分离的方法。
它利用样品中分子带有不同电荷的特性，通过具有不同电荷的离子交换树脂分离目标分子。
亲和层析法是一种按化学特性分离的方法。
它通过利用目标分子与树脂之间亲和力的差异，使目标分子精确分离。
逆相层析法是一种按疏水性分离的方法。
它利用碳链疏水和极性官能团亲疏性的差异，分离具有不同疏水性的分子。
2、电泳法电泳法是一种基于电荷和大小的分离方法。
它利用外部电场对带电分子的作用，使具有不同电荷和大小的生物活性分子在电泳介质中以不同速度迁移。
常见的电泳法包括蛋白质电泳、核酸电泳等。
蛋白质电泳法是一种将蛋白质按大小和电荷分离的方法。
电泳介质中的一定电场下，不同带电量、电荷分布、分子形态和大小的蛋白质会在介质中形成带，从而实现蛋白质的分离。
核酸电泳法是一种按大小和电荷分离DNA和RNA的方法。
它将核酸样品与电泳缓冲液注入凝胶槽内，通过外界电场使具有不同分子大小和电荷的DNA或RNA在凝胶中快速迁移。
二、鉴定方法1、质谱法质谱法是一种通过分析物质质量、分析分子结构和杂质成分的方法。
它对生物活性分子进行分析时，既可利用生物大分子质谱学如大质量串联谱（LC-MS）、基质辅助激光解析离子飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS），也可以利用小分子质谱分析如气质联用质谱（GC-MS）和高效液相色谱质谱（HPLC-MS）等。
具有细胞伤害性的生物活性测定法
具有细胞伤害性的生物活性测定法一、生物学检测法生物学检测又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。
由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSFci激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测。
生物活性检测法又可分为以下几类：1、细胞增殖法许多细胞因子具有细胞生zhang因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2 ci激t细胞生zhang、IL-3 ci激肥大细胞生zhang、IL-6 ci 激浆细胞生zhang等。
利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株(简称依赖株)。
这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。
例如IL-2依赖株ctll-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外zhang期培养。
在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况(如使用3h-tdr掺入法、MTT法等)鉴定IL-2的含量。
除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原ci 激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。
2、靶细胞杀伤法是根据某些细胞因子(如TNF)能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。
通常靶细胞多选择体外zhang期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。
3、细胞因子诱导的产物分析法某些细胞因子可ci激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺、IL-6诱导肝细胞合成α1-抗糜蛋白酶等。
通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性。
4、细胞病变抑制法病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。
二、免疫学检测法细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。
检测酶的活性的方法
检测酶的活性的方法
有许多方法可以检测酶的活性，以下列举了几种常见的方法：
1. 光度法（spectrophotometry）：该方法测量在酶催化下产生的化学反应的光学性质变化，例如吸光度或荧光强度的变化。
通过测量反应体系中的光学信号，可以推断酶的活性。
2. 比色法（colorimetry）：该方法通过测量在酶催化下产生的产物或底物的颜色变化来确定酶活性。
通过将反应体系加入适当的底物和试剂，酶催化的产物会导致溶液颜色的变化，可以通过光学检测方法来测量和分析产物的含量。
3. 标记底物法（labeled substrate assay）：该方法利用带有特定标记的底物，例如放射性同位素或荧光染料。
酶催化底物的反应会导致标记物的释放或改变，从而可以通过测量标记物的数量来推断酶的活性。
4. 电化学法（electrochemistry）：该方法利用酶催化电化学反应导致电流或电势的变化来检测酶的活性。
常见的技术包括循环伏安法（cyclic voltammetry）和电化学阻抗谱法（electrochemical impedance spectroscopy）等。
5. 放射性测量法（radiometric assay）：该方法利用酶催化底物与放射性同位素结合，通过测量底物的放射性衰变来确定酶的活性。
6. 质谱法（mass spectrometry）：该方法利用质谱技术分析酶催化反应产生的气相或溶液中的离子组成。
可以通过检测反应体系中特定的离子峰来推断酶的活性。
以上只是部分常见的酶活性检测方法，具体的方法选择取决于研究的酶类型、底物和实验条件等因素。
几种常用生物活性测试方法简介
ITC的用途： 获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数(Ka)、结合位点数(n)、摩 尔结合焓(△H）、摩尔结合熵（ △S）、摩尔恒压热容（ △ Cp），和动力学参数
Eu永久性嵌合穴状口袋（非螯合作用） 耐受性好，对温度，光强，PH，离子 强度变化影响较小。不易受化学物质 干扰，如EDTA，二价离子（Mg2+， Mn2+）等。
Stokes shift >300nm
持续激活后没有光漂白现象,可以多次 读数，从而进行动力学实验。
镧系元素的半衰期大于1毫秒，与普 通荧光纳秒级的半衰期相差6个数量 级。当延迟50微秒读数时，普通荧光 的信号近似于零。检测的发射光中没 有来自于激发波长的干扰。
Journal of Molecular Recognition.2008, 21, 289.
Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
ITC独特之处： ➢ 样品用量小，方法灵敏度和精确度高。最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最
小用量0.4ug，滴定池体积1.43 ml ➢ 实验时间较短。典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间。 ➢ 操作简单。整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注
7 .室温静置反应1h后，测值340/665nm。[(620/670nmCayman]
[BRD4(BD1)TR-FRET Assay Kit 购买自 BPS Bioscience 公司]
enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)
细胞活性测定方法
细胞活性测定方法细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。
其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。
但MTT法形成的Formazan 为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。
为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。
现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍：1.MTT法MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
2.XTT法XTT：化学名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲产物。
当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲产物的吸光度与活细胞的数量成正比。
优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。
生物活性测定法
生物活性测定法
重组人促红素体内生物学活性测定法 网织红细胞法) (网织红细胞法)
本法系依据人促红素(EPO)可刺激网织红 可刺激网织红 本法系依据人促红素 细胞生成的作用,给小鼠皮下注射EPO后, 细胞生成的作用,给小鼠皮下注射 后 其网织红细胞数量随 EPO注射剂量的增加 注射剂量的增加 而升高. 而升高.利用网织红细胞数对红细胞数的 比值变化,通过剂量-反应平行线法检测 比值变化,通过剂量 反应平行线法检测 EPO体内生物学活性. 体内生物学活性. 体内生物学活性
按标准品说明书, 标准品溶液的制备 按标准品说明书, 标准品复溶, 将EPO标准品复溶,用稀释液将 标准品复溶 用稀释液将EPO标准 标准 品稀释成高, 个剂量EPO标准溶 品稀释成高,中,低3个剂量 个剂量 标准溶 液. 供试品溶液的制备 用稀释液将供试 品稀释成高, 个剂量与EPO标准 品稀释成高,中,低3个剂量与 个剂量与 标准 溶液单位相近的供试品溶液. 溶液单位相近的供试品溶液.
然后弃去细胞培养板中的上清液, 然后弃去细胞培养板中的上清液,每孔 加染色液50ul 室温放置30分钟后, 50ul, 30分钟后 加染色液50ul,室温放置30分钟后,用 流水小心冲去染色液,并吸干残留水分, 流水小心冲去染色液,并吸干残留水分, 每孔加入脱色液100ul 室温放置3 100ul, 每孔加入脱色液100ul,室温放置3～5分 混匀后,用酶标仪以630nm 630nm为参比波 钟.混匀后,用酶标仪以630nm为参比波 在波长570nm处测定吸光度, 570nm处测定吸光度 长,在波长570nm处测定吸光度,记录测 定结果. 定结果. 试验数据采用计算机程序或四参数回归 计算法进行处理. 计算法进行处理.并按下式计算试验结 果:
蛋白的生物活性测定方法(结晶紫法和MTT法)
蛋白的生物活性测定方法（结晶紫法和MTT法）结晶紫法活性测定1、取对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞，用0.25%胰酶（以无钙镁离子PBS溶液配制，pH7.4）消化后，加入RPMI-1640培养基（10%新生牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，pH7.2）吹打细胞，使形成细胞悬液。
进行细胞计数，使细胞数为2~2.5×105个/ml。
接种于96孔细胞培养板，100µl/孔。
接种细胞时须不断摇动细胞悬液，以保证各孔细胞数的均匀一致。
96孔板放置于37℃、5%CO2培养箱中培养22h，观察到孔中细胞长满70~80%。
2、在上述RPMI-1640完全培养基中加入放线菌素D，使终浓度为1.5µg/ ml，配成样品稀释液。
取此稀释液900µl至Eppendorf管中，另在9个5m l管中加入700µl稀释液。
3、用完全培养基将基因工程人肿瘤凋亡素样品（上海恰尔生物技术有限公司研制，批号：0304，冻干粉剂，蛋白浓度：2mg/支）复溶至100 0µl（液体样品测定蛋白浓度后，直接进行下一步操作），取出100µl 至已装有900µl稀释液的Eppendorf管中，充分混匀，尽量不起泡沫。
再从此管中吸出100µl至下一管中，如此反复 n次（即测定前10倍稀释若干次，直到与估计活性相接近时）。
4、从最后稀释的Eppendorf管中吸出700µl样品至已装有700µl稀释液的5ml管中，充分混匀。
再从此管中吸出700µl至下一管同样装有700µl 稀释液的5ml管中，如此反复9次（即测定时倍比稀释样品）。
5、弃去96孔板中旧的培养基，从第一个5ml管中吸取已稀释的样品100µl至第2排细胞孔中，每个稀释度作6复孔(n=6)；从第二个5ml管中吸取的样品加入第3排细胞中，依此类推，直至第10排孔结束。
生物活性测定法
按标准品说明书, 标准品溶液的制备 按标准品说明书, 标准品复溶, 将EPO标准品复溶,用稀释液将 标准品复溶 用稀释液将EPO标准 标准 品稀释成高, 个剂量EPO标准溶 品稀释成高,中,低3个剂量 个剂量 标准溶 液. 供试品溶液的制备 用稀释液将供试 品稀释成高, 个剂量与EPO标准 品稀释成高,中,低3个剂量与 个剂量与 标准 溶液单位相近的供试品溶液. 溶液单位相近的供试品溶液.
将配制完成的标准品溶液和供试品溶液 移入接种WISH细胞的培养板中,每孔加 移入接种WISH细胞的培养板中, WISH细胞的培养板中 100ul. 37℃, 入100ul.于37℃,5%二氧化碳条件下 培养18 24小时 18～ 小时. 培养18～24小时.弃去细胞培养板中的 上清液.将保存的水泡性口炎病毒(VSV (VSV, 上清液.将保存的水泡性口炎病毒(VSV, 70℃保存 用攻毒培养液稀释至100 保存) -70℃保存)用攻毒培养液稀释至100 每孔100ul 100ul. 37℃, CCID50,每孔100ul.于37℃,5%二氧 化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50 24小时 化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50 病变点在lIU/m1) lIU/m1). %病变点在lIU/m1).
重组人白介素重组人白介素-2生物学活性测定法 (CTLL- 细胞/MTT比色法) /MTT比色法 (CTLL-2细胞/MTT比色法)
本法系根据在不同白介素-2 (IL-2)的 本法系根据在不同白介素- (IL-2)的 浓度下,其细胞依赖株CTLL CTLL浓度下,其细胞依赖株CTLL-2细胞存活 率不同,以此检测IL 的生物学活性. IL率不同,以此检测IL-2的生物学活性.
试剂 RPMI1640培养液 1640培养 (1) RPMI1640培养液 取RPMI 1640培养 基粉末1 规格为1L) 1L), 基粉末1袋(规格为1L),加水溶解并稀释至 1000ml,加青霉素10 IU和链霉素 和链霉素10 IU, 1000ml,加青霉素105IU和链霉素105 IU, 再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌 再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀, 2.1g 过滤,4℃保存 保存. 过滤,4℃保存. 取新生牛血清(FBS) (2) 基础培养液 取新生牛血清(FBS) 10ml, 1640培养液90ml.4℃保存 培养液90ml 保存. 10ml,加 RPMl 1640培养液90ml.4℃保存. (3)完全培养液 取基础培养液100ml 100ml, (3)完全培养液 取基础培养液100ml, 加重组人自介素- 至终浓度400 800IU. 400～ 加重组人自介素-2至终浓度400～800IU. 4℃保存 保存. 4℃保存.
生物活性测定法
EA K3
X
A+ E
有R'
RO
E + PX
有机磷类
K d PX .E K2
PX K3
P+ E
X
PX代表有机磷杀虫剂，X代表侧链部分例如对氧磷中的-O- NO2。E代表 AChE，Kd是解离常数(或者称亲和力常数)，K2是磷酰化反应速率常数有时写作 Kp，K3是脱磷酰基水解速率常数或者称酶致活常数。反应开始时有机磷酸酯先与 酶形成复合体(PX·E)，X分离后形成磷酰化酶(PE)，再经过脱磷酰基使AChE恢复。
淡水发光菌青海弧菌的发现解决了这一问题。
2 用家蝇检测蔬菜中的残留农药
60年代后期，台湾农业试验所采用生物测定方法进行农药残留 检验，其原理是释放高敏感性的家蝇于菜汁中，4～5ｈ后家蝇死亡 率在10%以下即为合格，该方法优点是过程简单无须复杂仪器检测， 缺点是检测时间较长，仅适用于田间未采收的蔬菜，另外该方法只 对部分杀虫剂有反应，无法分辨残留农药的种类，准确性较低。
明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)
最小检出浓度为3ｍｇ·Ｌ-1 已用于检测甲胺磷、敌敌畏等常用有机磷农 药。 特点：快速、简便、灵敏、价廉，适合于现 场分析 缺点：农药浓度与发光强度的线性关系不够 准确，只能用于半定量测定。
长期以来使用的发光细菌是海洋发光细菌，但该方法有严重不 足，即必须在检测的样品中加入3%的ＮａＣｌ的细菌才能正常发 光。
AchE及其功能 Ach是一种神经传递介质 , AchE是一个水解酶，底物
是Ach。水解作用的反应式如下：
CH3COOCH2CH2N+(CH3)3 + H2O CH3COOH+HOCH2CH2N+(CH3)3
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
生物活性物质筛选与活性评价方法
生物活性物质筛选与活性评价方法生物活性物质是指具有一定的生物活性和药理效应的物质，包括药物、天然产物和化学合成产物等。
筛选和评价生物活性物质是药物研发和天然产物利用的重要环节。
本文将探讨生物活性物质的筛选与活性评价方法。
一、生物活性物质筛选方法1. 高通量筛选技术高通量筛选技术是一种同时测试大量样品的方法，通过高通量筛选平台，可以对数千个化合物进行快速筛选。
其中，常用的方法包括酶抑制剂筛选、细胞增殖抑制筛选、酶底物筛选等。
这些方法通过检测样品对生物体系的作用来判断其生物活性。
2. 超高效液相色谱质谱联用技术超高效液相色谱质谱联用技术（UHPLC-MS）是一种结合了高效液相色谱和质谱技术的分析方法。
它可以用于分离和鉴定复杂样品中的化合物。
在筛选生物活性物质方面，UHPLC-MS可以用于快速鉴定样品中的目标成分并评估其生物活性。
3. 表型筛选表型筛选是通过观察生物体系的表现来评估化合物的生物活性。
例如，可以通过观察细胞形态、细胞增殖、细胞凋亡等现象来评价化合物的活性。
表型筛选可以非常直观地评估化合物对生物体系的影响，是药物研发中常用的方法之一。
二、生物活性物质活性评价方法1. 生物测定法生物测定法是一种通过观察生物体系的生物学反应来评价化合物的活性的方法。
常用的生物测定法包括细胞毒性测定、酶活性测定、细胞增殖测定等。
通过这些方法，可以评估化合物对生物体系的毒性、抑制作用、促进作用等。
2. 动物模型法动物模型法是一种通过在动物体内测试化合物的活性来评价其药理效应的方法。
常用的动物模型包括小鼠模型、大鼠模型、猪模型等。
通过观察化合物对动物体内疾病的影响，可以评估其治疗作用和毒性。
3. 结构活性关系分析结构活性关系分析是一种通过分析化合物结构与其生物活性之间的关系来预测和优化化合物的活性的方法。
通过对一系列结构类似但活性不同的化合物进行分析，可以找出结构与活性之间的规律。
这种方法可以为化合物的设计和优化提供方向。
自然科学实验中酶的活性测量技巧与方法
自然科学实验中酶的活性测量技巧与方法酶是一类生物催化剂，能够加速化学反应的速率。
在自然科学研究中，测量酶的活性对于了解生物体内的化学过程以及开发新药物具有重要意义。
本文将介绍一些常用的酶活性测量技巧与方法。
一、酶活性的测量原理酶活性通常通过测量酶催化反应产生的产物的生成速率来间接反映。
酶活性的测量原理可以分为两类：连续测量法和间断测量法。
连续测量法是指在酶催化反应过程中，通过连续监测反应物浓度的变化来计算酶活性。
这种方法常用于反应物浓度较高的情况下，如酶催化的酶促反应。
其中，常用的连续测量法包括比色法、荧光法和发光法等。
比色法是通过测量反应物或产物的吸光度来间接测量酶活性。
例如，过氧化氢酶催化过氧化氢分解反应产生的水可以与碘化钾反应生成碘，通过测量碘的吸光度来计算酶活性。
荧光法是通过测量反应物或产物的荧光强度来间接测量酶活性。
例如，琼脂糖酶催化琼脂糖水解反应产生的葡萄糖可以与荧光探针结合，通过测量荧光强度的变化来计算酶活性。
发光法是通过测量反应物或产物的发光强度来间接测量酶活性。
例如，ATP酶催化ATP水解反应产生的ADP可以与荧光素结合，通过测量发光强度的变化来计算酶活性。
间断测量法是指在酶催化反应过程中，通过在一定时间间隔内取样，然后测量样品中反应物或产物的浓度来计算酶活性。
这种方法常用于反应物浓度较低的情况下，如酶催化的酶抑制反应。
其中，常用的间断测量法包括比色法、滴定法和高效液相色谱法等。
二、酶活性测量技巧与方法1. 比色法比色法是一种简单且常用的酶活性测量方法。
它通过测量反应物或产物在特定波长下的吸光度来计算酶活性。
这种方法适用于颜色变化明显的反应体系。
例如，过氧化氢酶催化过氧化氢分解反应产生的水可以与碘化钾反应生成碘，通过测量碘的吸光度来计算酶活性。
2. 荧光法荧光法是一种高灵敏度的酶活性测量方法。
它通过测量反应物或产物在特定波长下的荧光强度来计算酶活性。
这种方法适用于荧光探针与反应物或产物结合的反应体系。
常用生物素测定方法的简介
第31卷第2期现代化工Feb.20112011年2月M odern Che m i c al I ndustry分析测试常用生物素测定方法的简介王 欣,王 燕,高晓娟,杨平平(山东轻工业学院食品与生物工程学院,山东济南250353)摘要:生物素作为B 族类维生素,在机体代谢、医药、化学等工业已经广泛应用,生物素测定方法的研究也取得了迅速发展,总结了6种生物素的测定方法。
随着检测技术的提高以及对检测结果精细度要求的提高,这些较为传统的方法也在适应现代检测技术的发展中有了新的提高与改进。
对这几种方法的应用实例、适用范围、优缺点等做了简单介绍,提出了适用条件的选择,使得人们能够根据其实验要求,更好地选择理想的检测方法。
对生物素检测新方法进行了展望。
关键词:生物素;研究;测定方法中图分类号:O657 文献标识码:A 文章编号:0253-4320(2011)02-0089-06Introduction of biotin deter m ination m ethodsWANG X in,WANG Yan,GAO X iao juan,YANG P ing p ing(Schoo l of F ood and B io l ogy Eng i nee ri ng ,Shandong Institute of L ight Industry ,Ji nan 250353,Ch i na)Abstrac t :A s a ki nd of B co m plex v ita m i ns ,b i o ti n has been w i de l y used i n i ndustries as me tabo lis m ,phar m aceuti ca,l chem istry ,and so on .T he research on bioti n de ter m i na ti on m ethods has also m ade rap i d progress .In t h is paper ,si x me t hods of b i o ti n deter m ina ti on are su mm ar ized .W ith t he deve l op m ent o f ex a m i nati on techno l ogy and t he de m and on mo re accurate testi ng resu lt ,the s i x traditi ona l approaches have been i m proved .T he app licati on examp l es ,app licati on scope ,advantages and d isadvantages o f the six m ethods are present i n t he pape r .Fo r resea rche rs fi nd i ng so m e appropriate ,easy and idea lm ethods is presen ted .F i na lly ,t he deve l op m ent direc ti on o f b i o ti n determ i nation is sugg ested .K ey word s :b i oti n ;research ;determ i nation m ethod收稿日期:2010-12-15作者简介:王欣(1985-),女,硕士生,e mm axi n1@;杨平平(1961-),男,博士,教授,研究方向为生物制药,通讯联系人,jiangnanypp @ 。
细胞活性检测方法有哪些？
细胞活性检测方法有哪些？细胞活性是判断体外培养细胞在某些条件下是否能正常生长的重要指标,如药物处理、放射性或紫外线照射、培养条件变化等。
目前常用的方法有很多,如有台盼蓝染色法、克隆(集落)形成法、H放射性同位素掺入法、MTT法等。
本文总结了一些常用的细胞活性检测方法的原理、特点，并对比了各自的优缺点。
一、染色计数法1. 化学染色法染色计数法是细胞培养中检查细胞死活最常用的方法，直接利用死细胞和活细胞对染料的不同亲和力，检查细胞活性，能在光学显微镜下观察到染色结果。
可分为两类：死细胞着色法和活细胞着色法。
使死细胞着色的常用染料有台盼蓝、苯胺黑、伊红Y。
能使活细胞着色的常用染料有结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝等。
其中最常用的是台盼蓝染色法。
细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以鉴别死细胞与活细胞。
通过细胞计数可得出细胞的存活率。
本染色法方便实用，价格低廉，操作简单。
但是台盼蓝染色时，时间不宜过长，否则部分活细胞也会着色，会干扰计数。
而且，细胞没有经过固定，形态不清晰。
2. 荧光染色法一些荧光染料对死细胞和活细胞也有不同的作用效果，利用荧光显微镜检测细胞活性。
如碘化丙啶（PI），被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡细胞的细胞膜，因此活细胞不被染料上色，只有死细胞或凋亡细胞才能被染上红色。
吖啶橙（AO）能透过质膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。
溴乙锭（EB）仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。
也可应用AO-EB 双染法鉴定细胞死活。
这种检测方法相比传统的染料，具有灵敏度高，操作简便，结果容易分辨等特点，而且利用双染法还可以分辨活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、死亡细胞。
在细胞凋亡的检测上有很广泛的应用。
缺点在于，要求特殊的仪器进行检测，如荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜或流式细胞仪。
而且通过荧光染料具有毒性，操作时需要带手套。
细胞活性测定方式
细胞活性测定方式细胞活性测定方式有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、 MTT 法等。
其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大量量检测的特点而取得普遍的应用。
但MTT法形成的Formazan 为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部份的Formazan，故有时重复性略差。
为了解决那个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。
现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍：法MTT：化学名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲，用酶联免疫检测仪在490nm波优势测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在必然细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方式已普遍用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物挑选、细胞毒性实验和肿瘤放射灵敏性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
法XTT：化学名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲产物。
当XTT与电子偶合剂（例如 PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲产物的吸光度与活细胞的数量成正比。
优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。