几种常用生物活性测试方法简介
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J.Pharmaceut.Biomedical.2008,11,28.
surface plasmon resonance , SPR
SPR的优点：
可以实时、连续监测反应的动态过程， 灵敏度较高 。
可实时记录反应的结合与解离过程。 每次检测结束后，结合在金属膜芯片
上的反应物可以用洗脱液洗脱使芯片 再生，可重复使用，节约耗材。 可以得到高通量数据。
动态范围过小：对温度、样品组成、金属薄膜要求高。
分子水平活性测试方法
SPR 与 ITC 功能特性对比
特点
SPR
ITC
固定化
需要
不需要
结果
动力学
动力学和热力学
得到数据
Ka, Kd
Ka,，△H、 △Cp
运行时间
2~10min
30~60min
分子质量
>1000
无限制
样品量
约1mg
最小含量0.4ug
温度
Stokes Shift (nm)(donor excitation ⇒
acceptor emission)
Europium3+
340⇒615 Allophycocyanin（APC） 615⇒660
320
Terbium3+
340⇒545
Phycoerythrin（Phy）
545⇒575
235
When these two fluorophores are brought together by a biomolecular interaction, a portion of the energy captured by the Europium during excitation is released through fluorescence emission at 620 nm, while the remaining energy is transferred to the APC. This energy is then released by APC as specific fluorescence at 660 nm only via FRET with Europium.
7 .室温静置反应1h后，测值340/665nm。[(620/670nmCayman]
[BRD4(BD1)TR-FRET Assay Kit 购买自 BPS Bioscience 公司]
enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)
酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 基本原理是先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。 测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体 或抗原发生反应。
surface plasmon resonance , SPR
表面等离子共振原理
➢ 光在棱镜与金属膜表面上发生全反射 现象时，会形成消逝波进入到光疏介 质中与介质中存在一定的等离子波相 遇时可能会发生共振。当消逝波与表 面等离子波发生共振时，检测到的反 射光强会大幅度地减弱。
➢ SPR角：反射光完全消失的角。 ➢ SPR角随金属表面折射率变化而变化，
SPR的缺点：
待测物在金属薄膜表面的固定：由于生物大分子本身理化性质的复杂性，空间 结构的特殊性，偶联结果可能导致偶联物特异作用位点的失活。
分析物在金属薄膜表面的结合：难以区分非特异性结合，若分析物在芯片表面 是非特异性结合， 会给整个实验带来干扰，造成错误的结论。
待测物的分子大小：适用于生物大分子，小分子的质量变化对折射率变化不明 显， 因此会给小分子待测物的检测造成困难。
Βιβλιοθήκη Baidu
铕穴状化合物的激发和发射光谱
J. Phys. Chem. C, 2008. 17, 112.
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET)
Donor
Excitation⇒E mission λ (nm)
Acceptor
Excitation⇒E mission λ (nm)
15~40℃
2~80℃
溶剂
非强有机溶剂
无限制
耗材
芯片
试剂
药物筛选
适用
不适用
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) FRET原理
传统FRET技术容易受样品组分(缓冲液，蛋白， 化学物质及细胞裂解产物等)背景荧光信号的 影响。
时间分辨通过去除寿命较短的背景，分辨目的 荧光。
surface plasmon resonance , SPR 表面等离子共振（SPR）原理
消逝波：当入射光到达界面时并不是直 接产生反射光，而是先透过光疏介质约 一个波长的深度，再沿界面流动约半个 波长再返回光密介质，透过光疏介质的 波被称为消逝波。
等离子波：当金属受电磁干扰时，金属内部 的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力 的存在，电子不会在引力与斥力的平衡位置 停下而向前运动一段距离，之后电子间存在 的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开 该区域。由此会形成一种整个电子系统的集 体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡 反复进行震荡，并以波的形式表现。
J. Biomol. Screen. 2015, 7,4.
通过使用供体和受体荧光团标记，
TR-FRET 检测将时间分辨 (TR) 和 荧光共振能量转移 (FRET) 原理的 优势结合到了一起。
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET)
镧 系 元 素 （ 铕 Eu 和 铽 Tb ） 半 衰 期 长 (us-ms) ， 将 Eu 纳入立体笼中， 形成稳固复合体， 笼收集光将能量 转移到Eu上。
基本原理：
Q = △Ho x V x [H.G]
= △Ho x V x
Ka [G] 1+Ka [G]
x [H]o
△Go = -RT ln K a
△Go = △Ho - T△So
注：H 为受体（主体），G为配体（客体），Ka为结合常数 △Go为Gibbs自由能变化，△Ho 为焓变，△So 为熵变
Isothermal Titration Calorimetry (ITC) ITC仪结构示意图
J. Phys. Chem. C. 2013,112,6589.
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) General Format For FRET
PD1-PDL1 binding assay J. Biomol. Screen. 2015, 7,4.
(如酶活力（Kcat）、酶促反应米氏常数(Km)) 。
可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、 酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋 白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞 相互作用等方面。
ITC是一种热量连续变化的量热器。主 要由隔热夹套包裹着的样品池(反应池) 和参比池、注射器和一台计算机组成， 注射器同时具有搅拌作用，计算机控 制温度控制装置和信息反馈系统。
受体-配体复合物的形成伴随着能量的释放或吸收，导致样品池温度的变化，参比池 始终保持在实验温度，反馈系统提供热或降低热量来补偿样品池的温度变化，每注 射一次后系统恢复至平衡状态再进行下一滴滴定。结果以峰的形式表示平衡温度偏 移所需要的能量，峰的面积相当于反应释放或吸收的热量。
Methods In Cell Biology, 2008, 84,79.
Isothermal Titration Calorimetry (ITC) ITC数据图
左图： 横坐标：时间 纵坐标：热功率 峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量。 右图： 横坐标：滴定物与样品溶液的摩尔比 纵坐标：滴定产生的总热量 反应过程的结合等温曲线
而折射率的变化又与金属表面结合的 分子质量成正比。 ➢ 可通过 SPR 角的变化捕获生物反应过 程中生物分子之间相互作用的特异信 号，对待测物质进行测定直接测量反 应平衡常数 Ka，解离平衡常数 Kd 等。
surface plasmon resonance , SPR
将待测分子键合在生物传感芯片表面，使其形成分子敏感膜， 再将分析物分子溶液 注入，使其以恒定流速流过芯片表面，如果两者通过相互作用而结合，则将引起生 物传感器表面质量的增加， 导致传感器表面折射率的变化，从而引起SPR角的改变。 SPR被广泛应用于分析生物分子如蛋白质-蛋白质、药物-蛋白质、蛋白质-核酸、核 酸-核酸之间的相互作用，所涉及的研究领域包括免疫学、蛋白质组学及药物筛选等。
射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由软件分析ITC得到的数据。 ➢ 量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
ITC的用途： 获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数(Ka)、结合位点数(n)、摩 尔结合焓(△H）、摩尔结合熵（ △S）、摩尔恒压热容（ △ Cp），和动力学参数
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) BDR4相关化合物TR-FRET活性测试方法
1.根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer分别将成分Eu-labeled donor 和 dye-labeled acceptor (带straptavidin标记） 100倍稀释； 2.向384孔板中，每孔加入稀释好的Eu-labeled donor 和dye-labeled acceptor 各2.5ul； 3. 向 每 孔 中 加 入 一 定 量 的 化 合 物 ， 阳 性 对 照 组 加 入 对 应 体 积 的 DMSO ； 振 荡 反 应 1min； 4 .根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer将组分BET Bromodomain 40倍稀释。 分别向化合物检测组和阳性对照组加入稀释好的BET Bromodomain 2.5ul每孔； 5.根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer将组分acetylated Ligand1（带Biotin 标记） 40倍稀释。向阴性对照组加入稀释好的BET Bromodomain 2.5ul每孔； 6. 每孔加入一定量的BRD4 bromodomain ，保证每个反应体系中含有4.5ng含量的酶。
Journal of Molecular Recognition.2008, 21, 289.
Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
ITC独特之处： ➢ 样品用量小，方法灵敏度和精确度高。最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最
小用量0.4ug，滴定池体积1.43 ml ➢ 实验时间较短。典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间。 ➢ 操作简单。整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注
Eu永久性嵌合穴状口袋（非螯合作用） 耐受性好，对温度，光强，PH，离子 强度变化影响较小。不易受化学物质 干扰，如EDTA，二价离子（Mg2+， Mn2+）等。
Stokes shift >300nm
持续激活后没有光漂白现象,可以多次 读数，从而进行动力学实验。
镧系元素的半衰期大于1毫秒，与普 通荧光纳秒级的半衰期相差6个数量 级。当延迟50微秒读数时，普通荧光 的信号近似于零。检测的发射光中没 有来自于激发波长的干扰。
几种常用生物活性 测试方法简介
CONTENTS
1
分子水平活性测试方法
2
细胞水平活性测试方法
3
总结
Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种 研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量 量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损 伤地同时提供热力学和动力学信息。
用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显 色，进行定性或定量测定。
surface plasmon resonance , SPR
SPR的优点：
可以实时、连续监测反应的动态过程， 灵敏度较高 。
可实时记录反应的结合与解离过程。 每次检测结束后，结合在金属膜芯片
上的反应物可以用洗脱液洗脱使芯片 再生，可重复使用，节约耗材。 可以得到高通量数据。
动态范围过小：对温度、样品组成、金属薄膜要求高。
分子水平活性测试方法
SPR 与 ITC 功能特性对比
特点
SPR
ITC
固定化
需要
不需要
结果
动力学
动力学和热力学
得到数据
Ka, Kd
Ka,，△H、 △Cp
运行时间
2~10min
30~60min
分子质量
>1000
无限制
样品量
约1mg
最小含量0.4ug
温度
Stokes Shift (nm)(donor excitation ⇒
acceptor emission)
Europium3+
340⇒615 Allophycocyanin（APC） 615⇒660
320
Terbium3+
340⇒545
Phycoerythrin（Phy）
545⇒575
235
When these two fluorophores are brought together by a biomolecular interaction, a portion of the energy captured by the Europium during excitation is released through fluorescence emission at 620 nm, while the remaining energy is transferred to the APC. This energy is then released by APC as specific fluorescence at 660 nm only via FRET with Europium.
7 .室温静置反应1h后，测值340/665nm。[(620/670nmCayman]
[BRD4(BD1)TR-FRET Assay Kit 购买自 BPS Bioscience 公司]
enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)
酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 基本原理是先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。 测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体 或抗原发生反应。
surface plasmon resonance , SPR
表面等离子共振原理
➢ 光在棱镜与金属膜表面上发生全反射 现象时，会形成消逝波进入到光疏介 质中与介质中存在一定的等离子波相 遇时可能会发生共振。当消逝波与表 面等离子波发生共振时，检测到的反 射光强会大幅度地减弱。
➢ SPR角：反射光完全消失的角。 ➢ SPR角随金属表面折射率变化而变化，
SPR的缺点：
待测物在金属薄膜表面的固定：由于生物大分子本身理化性质的复杂性，空间 结构的特殊性，偶联结果可能导致偶联物特异作用位点的失活。
分析物在金属薄膜表面的结合：难以区分非特异性结合，若分析物在芯片表面 是非特异性结合， 会给整个实验带来干扰，造成错误的结论。
待测物的分子大小：适用于生物大分子，小分子的质量变化对折射率变化不明 显， 因此会给小分子待测物的检测造成困难。
Βιβλιοθήκη Baidu
铕穴状化合物的激发和发射光谱
J. Phys. Chem. C, 2008. 17, 112.
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET)
Donor
Excitation⇒E mission λ (nm)
Acceptor
Excitation⇒E mission λ (nm)
15~40℃
2~80℃
溶剂
非强有机溶剂
无限制
耗材
芯片
试剂
药物筛选
适用
不适用
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) FRET原理
传统FRET技术容易受样品组分(缓冲液，蛋白， 化学物质及细胞裂解产物等)背景荧光信号的 影响。
时间分辨通过去除寿命较短的背景，分辨目的 荧光。
surface plasmon resonance , SPR 表面等离子共振（SPR）原理
消逝波：当入射光到达界面时并不是直 接产生反射光，而是先透过光疏介质约 一个波长的深度，再沿界面流动约半个 波长再返回光密介质，透过光疏介质的 波被称为消逝波。
等离子波：当金属受电磁干扰时，金属内部 的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力 的存在，电子不会在引力与斥力的平衡位置 停下而向前运动一段距离，之后电子间存在 的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开 该区域。由此会形成一种整个电子系统的集 体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡 反复进行震荡，并以波的形式表现。
J. Biomol. Screen. 2015, 7,4.
通过使用供体和受体荧光团标记，
TR-FRET 检测将时间分辨 (TR) 和 荧光共振能量转移 (FRET) 原理的 优势结合到了一起。
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET)
镧 系 元 素 （ 铕 Eu 和 铽 Tb ） 半 衰 期 长 (us-ms) ， 将 Eu 纳入立体笼中， 形成稳固复合体， 笼收集光将能量 转移到Eu上。
基本原理：
Q = △Ho x V x [H.G]
= △Ho x V x
Ka [G] 1+Ka [G]
x [H]o
△Go = -RT ln K a
△Go = △Ho - T△So
注：H 为受体（主体），G为配体（客体），Ka为结合常数 △Go为Gibbs自由能变化，△Ho 为焓变，△So 为熵变
Isothermal Titration Calorimetry (ITC) ITC仪结构示意图
J. Phys. Chem. C. 2013,112,6589.
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) General Format For FRET
PD1-PDL1 binding assay J. Biomol. Screen. 2015, 7,4.
(如酶活力（Kcat）、酶促反应米氏常数(Km)) 。
可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、 酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋 白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞 相互作用等方面。
ITC是一种热量连续变化的量热器。主 要由隔热夹套包裹着的样品池(反应池) 和参比池、注射器和一台计算机组成， 注射器同时具有搅拌作用，计算机控 制温度控制装置和信息反馈系统。
受体-配体复合物的形成伴随着能量的释放或吸收，导致样品池温度的变化，参比池 始终保持在实验温度，反馈系统提供热或降低热量来补偿样品池的温度变化，每注 射一次后系统恢复至平衡状态再进行下一滴滴定。结果以峰的形式表示平衡温度偏 移所需要的能量，峰的面积相当于反应释放或吸收的热量。
Methods In Cell Biology, 2008, 84,79.
Isothermal Titration Calorimetry (ITC) ITC数据图
左图： 横坐标：时间 纵坐标：热功率 峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量。 右图： 横坐标：滴定物与样品溶液的摩尔比 纵坐标：滴定产生的总热量 反应过程的结合等温曲线
而折射率的变化又与金属表面结合的 分子质量成正比。 ➢ 可通过 SPR 角的变化捕获生物反应过 程中生物分子之间相互作用的特异信 号，对待测物质进行测定直接测量反 应平衡常数 Ka，解离平衡常数 Kd 等。
surface plasmon resonance , SPR
将待测分子键合在生物传感芯片表面，使其形成分子敏感膜， 再将分析物分子溶液 注入，使其以恒定流速流过芯片表面，如果两者通过相互作用而结合，则将引起生 物传感器表面质量的增加， 导致传感器表面折射率的变化，从而引起SPR角的改变。 SPR被广泛应用于分析生物分子如蛋白质-蛋白质、药物-蛋白质、蛋白质-核酸、核 酸-核酸之间的相互作用，所涉及的研究领域包括免疫学、蛋白质组学及药物筛选等。
射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由软件分析ITC得到的数据。 ➢ 量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
ITC的用途： 获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数(Ka)、结合位点数(n)、摩 尔结合焓(△H）、摩尔结合熵（ △S）、摩尔恒压热容（ △ Cp），和动力学参数
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) BDR4相关化合物TR-FRET活性测试方法
1.根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer分别将成分Eu-labeled donor 和 dye-labeled acceptor (带straptavidin标记） 100倍稀释； 2.向384孔板中，每孔加入稀释好的Eu-labeled donor 和dye-labeled acceptor 各2.5ul； 3. 向 每 孔 中 加 入 一 定 量 的 化 合 物 ， 阳 性 对 照 组 加 入 对 应 体 积 的 DMSO ； 振 荡 反 应 1min； 4 .根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer将组分BET Bromodomain 40倍稀释。 分别向化合物检测组和阳性对照组加入稀释好的BET Bromodomain 2.5ul每孔； 5.根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer将组分acetylated Ligand1（带Biotin 标记） 40倍稀释。向阴性对照组加入稀释好的BET Bromodomain 2.5ul每孔； 6. 每孔加入一定量的BRD4 bromodomain ，保证每个反应体系中含有4.5ng含量的酶。
Journal of Molecular Recognition.2008, 21, 289.
Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
ITC独特之处： ➢ 样品用量小，方法灵敏度和精确度高。最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最
小用量0.4ug，滴定池体积1.43 ml ➢ 实验时间较短。典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间。 ➢ 操作简单。整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注
Eu永久性嵌合穴状口袋（非螯合作用） 耐受性好，对温度，光强，PH，离子 强度变化影响较小。不易受化学物质 干扰，如EDTA，二价离子（Mg2+， Mn2+）等。
Stokes shift >300nm
持续激活后没有光漂白现象,可以多次 读数，从而进行动力学实验。
镧系元素的半衰期大于1毫秒，与普 通荧光纳秒级的半衰期相差6个数量 级。当延迟50微秒读数时，普通荧光 的信号近似于零。检测的发射光中没 有来自于激发波长的干扰。
几种常用生物活性 测试方法简介
CONTENTS
1
分子水平活性测试方法
2
细胞水平活性测试方法
3
总结
Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种 研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量 量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损 伤地同时提供热力学和动力学信息。
用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显 色，进行定性或定量测定。