几种常用生物活性测试方法简介
细胞活力检测方法
细胞活力检测方法细胞活力是指细胞的生存状态和生理功能的活跃程度，是评价细胞健康状况的重要指标。
细胞活力的检测方法多种多样，包括形态学观察、生化指标检测、细胞增殖和凋亡检测等。
下面将介绍几种常见的细胞活力检测方法。
首先，形态学观察是最直观的细胞活力检测方法之一。
通过显微镜观察细胞的形态、大小、颜色等特征，可以初步判断细胞的活力状态。
健康的细胞通常具有完整的形态结构、清晰的细胞核和丰富的细胞质，而受损或死亡的细胞则可能出现细胞浑浊、变形、脱落等现象。
其次，生化指标检测是常用的细胞活力评估方法之一。
通过检测细胞内的生化指标如ATP含量、蛋白质合成率、酶活性等，可以客观地评价细胞的代谢活力和功能状态。
例如，ATP是细胞内能量的主要来源，其含量的变化可以反映细胞的能量代谢情况，从而间接反映细胞的活力水平。
另外，细胞增殖和凋亡检测也是常用的细胞活力检测方法。
细胞增殖能力是细胞活力的重要指标之一，可以通过细胞计数、增殖标记物检测等方法来评估。
而细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，通过检测细胞凋亡标记物如DNA片段化、凋亡蛋白表达等，可以评估细胞的凋亡程度，从而间接反映细胞的活力状态。
除了上述方法外，还有一些新兴的细胞活力检测技术，如细胞荧光染色、细胞电生理检测、细胞代谢组学分析等，这些方法在评价细胞活力方面具有一定的优势和应用前景。
综上所述，细胞活力的检测方法多种多样，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，可以根据具体的研究目的和条件选择合适的方法进行细胞活力检测，从而更准确地评价细胞的生理状态和功能状态，为细胞生物学研究和临床诊断提供有力支持。
生物医学材料的制备与性能测试技术综述
生物医学材料的制备与性能测试技术综述引言：生物医学材料是应用在医疗领域的一类特殊材料，它能与生物系综合地相互作用，以实现医疗应用的目标。
这些材料在组织修复、药物传递、生物传感和医疗器械等方面发挥着重要的作用。
本文将综述生物医学材料的制备与性能测试技术，以便深入了解这些关键步骤对于材料的性能和应用的影响。
一、生物医学材料的制备技术：1. 材料选择和设计：生物医学材料的制备首先需要选择合适的原料。
常见的生物医学材料包括金属、陶瓷、聚合物和复合材料等。
根据应用需求，需要提前确定材料所需的物理、化学和生物学性能。
同时，根据材料的特性和应用要求，进行合适的设计和构造，以满足预期的功能需求。
2. 制备方法：生物医学材料的制备方法多种多样，常见的方法包括溶胶-凝胶、电化学沉积、热处理、机械加工和3D打印等。
其中，溶胶-凝胶技术是一种常用的制备方法，通过溶胶的凝胶化过程，可以形成具有均匀结构和孔隙的材料。
电化学沉积则是一种能够在电极上沉积金属或陶瓷的方法，通过控制电流密度和电位，可以获得特定性能的材料。
热处理是指通过加热和冷却等处理方式，对材料的结构和性能进行调控。
机械加工和3D 打印技术能够实现对材料的精确加工和构建。
3. 表面修饰与功能化：为了提高生物医学材料的生物相容性、降低免疫反应和改善生物活性，常常需要对材料表面进行修饰和功能化处理。
常见的表面修饰方法包括离子注入、等离子体处理、离子束照射和化学修饰等。
功能化处理则是将特定的生物活性物质引入材料表面，如药物、细胞因子和生物胶等，以实现特定的功能需求。
二、生物医学材料的性能测试技术：1. 生物相容性测试：生物医学材料的生物相容性是指材料与生物体相互作用时不引起明显的毒性、炎症和免疫反应。
生物相容性测试是衡量材料是否适合用于医疗应用的重要指标。
常见的生物相容性测试方法包括细胞毒性测试、小动物体内实验和组织切片观察等。
通过这些测试，可以评估材料对细胞和组织的影响，从而确定材料的生物相容性。
具有细胞伤害性的生物活性测定法
具有细胞伤害性的生物活性测定法一、生物学检测法生物学检测又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。
由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSFci激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测。
生物活性检测法又可分为以下几类：1、细胞增殖法许多细胞因子具有细胞生zhang因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2 ci激t细胞生zhang、IL-3 ci激肥大细胞生zhang、IL-6 ci 激浆细胞生zhang等。
利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株(简称依赖株)。
这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。
例如IL-2依赖株ctll-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外zhang期培养。
在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况(如使用3h-tdr掺入法、MTT法等)鉴定IL-2的含量。
除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原ci 激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。
2、靶细胞杀伤法是根据某些细胞因子(如TNF)能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。
通常靶细胞多选择体外zhang期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。
3、细胞因子诱导的产物分析法某些细胞因子可ci激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺、IL-6诱导肝细胞合成α1-抗糜蛋白酶等。
通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性。
4、细胞病变抑制法病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。
二、免疫学检测法细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。
检测酶的活性的方法
检测酶的活性的方法
有许多方法可以检测酶的活性，以下列举了几种常见的方法：
1. 光度法（spectrophotometry）：该方法测量在酶催化下产生的化学反应的光学性质变化，例如吸光度或荧光强度的变化。
通过测量反应体系中的光学信号，可以推断酶的活性。
2. 比色法（colorimetry）：该方法通过测量在酶催化下产生的产物或底物的颜色变化来确定酶活性。
通过将反应体系加入适当的底物和试剂，酶催化的产物会导致溶液颜色的变化，可以通过光学检测方法来测量和分析产物的含量。
3. 标记底物法（labeled substrate assay）：该方法利用带有特定标记的底物，例如放射性同位素或荧光染料。
酶催化底物的反应会导致标记物的释放或改变，从而可以通过测量标记物的数量来推断酶的活性。
4. 电化学法（electrochemistry）：该方法利用酶催化电化学反应导致电流或电势的变化来检测酶的活性。
常见的技术包括循环伏安法（cyclic voltammetry）和电化学阻抗谱法（electrochemical impedance spectroscopy）等。
5. 放射性测量法（radiometric assay）：该方法利用酶催化底物与放射性同位素结合，通过测量底物的放射性衰变来确定酶的活性。
6. 质谱法（mass spectrometry）：该方法利用质谱技术分析酶催化反应产生的气相或溶液中的离子组成。
可以通过检测反应体系中特定的离子峰来推断酶的活性。
以上只是部分常见的酶活性检测方法，具体的方法选择取决于研究的酶类型、底物和实验条件等因素。
生物活性检测
Part 2 生物活性检测
02
生物传感器定义为 : 生物传感器是一种精密的分析器件 , 它结合一种生物或 生物衍生敏感元件与一只理化换能器 , 能够产生间断或连续的数字电信号 , 信号强度与被分析物成正比。生物传感器一般由两部分组成 : 一是分子识别 元件 , 即具有分子识别能力的生物活性物质 ( 如组织、微生物细胞、细胞器、 细胞受体、酶、抗体、核酸等 ) ；二是信号转换元件 , 主要为电化学电极、 光学检测元件、气敏电极、热敏电阻、场效应晶体管、压电晶体及表面等 离子共振器件等。当待测物与分子识别元件特异性结合后 , 所产生的复合物 ( 或光、热等 ) 通过信号转换器转变为可以输出的电信号、光信号等 , 从而 达到分析检测的目的。
Part 2 生物活性检测
03 在合时膜片上用戊二醛交联冻干酵母粉 破碎液和酶混合液制备了用于检测蔗糖 含量的酶传感器，采用生物传感器检测 方式测定梨和海棠两种作物不同时期不 同部位的蔗糖含量，结果显示，作物的 蔗糖含量与总光合源呈正相关，光照天 数越多，时间越长其含量就要越高，此 外果实积累贮存蔗糖还与茎的运输能力， 果实的卸糖能力密不可分。
Part 2 生物活性检测
03 利用生物传感器检测植物组织中的蔗糖含量的变化 在高等植物中,蔗糖具有至关重要的作用。蔗糖是 光合作用的主要产物,蔗糖形成于细胞质内，从叶 片通过韧皮部向库器官输送,是糖运输的主要形式, 植物中同化产物主要是以蔗糖的形式从源向库输送 的,供应植物的生长，参与调控植物花的诱导维管 组织的分化种子发育以及贮藏物质的积累等生长发 育过程。因此在分子水平上研究植物碳水同化产物 在源器官的分配对于提高作物植株的产量很有帮助。 酶电极是迄今最为快速准确的测糖方法之一。
Part 3 生物活性检测的扩展
生物活性测定法
生物活性测定法
重组人促红素体内生物学活性测定法 网织红细胞法) (网织红细胞法)
本法系依据人促红素(EPO)可刺激网织红 可刺激网织红 本法系依据人促红素 细胞生成的作用,给小鼠皮下注射EPO后, 细胞生成的作用,给小鼠皮下注射 后 其网织红细胞数量随 EPO注射剂量的增加 注射剂量的增加 而升高. 而升高.利用网织红细胞数对红细胞数的 比值变化,通过剂量-反应平行线法检测 比值变化,通过剂量 反应平行线法检测 EPO体内生物学活性. 体内生物学活性. 体内生物学活性
按标准品说明书, 标准品溶液的制备 按标准品说明书, 标准品复溶, 将EPO标准品复溶,用稀释液将 标准品复溶 用稀释液将EPO标准 标准 品稀释成高, 个剂量EPO标准溶 品稀释成高,中,低3个剂量 个剂量 标准溶 液. 供试品溶液的制备 用稀释液将供试 品稀释成高, 个剂量与EPO标准 品稀释成高,中,低3个剂量与 个剂量与 标准 溶液单位相近的供试品溶液. 溶液单位相近的供试品溶液.
然后弃去细胞培养板中的上清液, 然后弃去细胞培养板中的上清液,每孔 加染色液50ul 室温放置30分钟后, 50ul, 30分钟后 加染色液50ul,室温放置30分钟后,用 流水小心冲去染色液,并吸干残留水分, 流水小心冲去染色液,并吸干残留水分, 每孔加入脱色液100ul 室温放置3 100ul, 每孔加入脱色液100ul,室温放置3～5分 混匀后,用酶标仪以630nm 630nm为参比波 钟.混匀后,用酶标仪以630nm为参比波 在波长570nm处测定吸光度, 570nm处测定吸光度 长,在波长570nm处测定吸光度,记录测 定结果. 定结果. 试验数据采用计算机程序或四参数回归 计算法进行处理. 计算法进行处理.并按下式计算试验结 果:
蛋白的生物活性测定方法(结晶紫法和MTT法)
蛋白的生物活性测定方法（结晶紫法和MTT法）结晶紫法活性测定1、取对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞，用0.25%胰酶（以无钙镁离子PBS溶液配制，pH7.4）消化后，加入RPMI-1640培养基（10%新生牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，pH7.2）吹打细胞，使形成细胞悬液。
进行细胞计数，使细胞数为2~2.5×105个/ml。
接种于96孔细胞培养板，100µl/孔。
接种细胞时须不断摇动细胞悬液，以保证各孔细胞数的均匀一致。
96孔板放置于37℃、5%CO2培养箱中培养22h，观察到孔中细胞长满70~80%。
2、在上述RPMI-1640完全培养基中加入放线菌素D，使终浓度为1.5µg/ ml，配成样品稀释液。
取此稀释液900µl至Eppendorf管中，另在9个5m l管中加入700µl稀释液。
3、用完全培养基将基因工程人肿瘤凋亡素样品（上海恰尔生物技术有限公司研制，批号：0304，冻干粉剂，蛋白浓度：2mg/支）复溶至100 0µl（液体样品测定蛋白浓度后，直接进行下一步操作），取出100µl 至已装有900µl稀释液的Eppendorf管中，充分混匀，尽量不起泡沫。
再从此管中吸出100µl至下一管中，如此反复 n次（即测定前10倍稀释若干次，直到与估计活性相接近时）。
4、从最后稀释的Eppendorf管中吸出700µl样品至已装有700µl稀释液的5ml管中，充分混匀。
再从此管中吸出700µl至下一管同样装有700µl 稀释液的5ml管中，如此反复9次（即测定时倍比稀释样品）。
5、弃去96孔板中旧的培养基，从第一个5ml管中吸取已稀释的样品100µl至第2排细胞孔中，每个稀释度作6复孔(n=6)；从第二个5ml管中吸取的样品加入第3排细胞中，依此类推，直至第10排孔结束。
生物活性测定法
按标准品说明书, 标准品溶液的制备 按标准品说明书, 标准品复溶, 将EPO标准品复溶,用稀释液将 标准品复溶 用稀释液将EPO标准 标准 品稀释成高, 个剂量EPO标准溶 品稀释成高,中,低3个剂量 个剂量 标准溶 液. 供试品溶液的制备 用稀释液将供试 品稀释成高, 个剂量与EPO标准 品稀释成高,中,低3个剂量与 个剂量与 标准 溶液单位相近的供试品溶液. 溶液单位相近的供试品溶液.
将配制完成的标准品溶液和供试品溶液 移入接种WISH细胞的培养板中,每孔加 移入接种WISH细胞的培养板中, WISH细胞的培养板中 100ul. 37℃, 入100ul.于37℃,5%二氧化碳条件下 培养18 24小时 18～ 小时. 培养18～24小时.弃去细胞培养板中的 上清液.将保存的水泡性口炎病毒(VSV (VSV, 上清液.将保存的水泡性口炎病毒(VSV, 70℃保存 用攻毒培养液稀释至100 保存) -70℃保存)用攻毒培养液稀释至100 每孔100ul 100ul. 37℃, CCID50,每孔100ul.于37℃,5%二氧 化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50 24小时 化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50 病变点在lIU/m1) lIU/m1). %病变点在lIU/m1).
重组人白介素重组人白介素-2生物学活性测定法 (CTLL- 细胞/MTT比色法) /MTT比色法 (CTLL-2细胞/MTT比色法)
本法系根据在不同白介素-2 (IL-2)的 本法系根据在不同白介素- (IL-2)的 浓度下,其细胞依赖株CTLL CTLL浓度下,其细胞依赖株CTLL-2细胞存活 率不同,以此检测IL 的生物学活性. IL率不同,以此检测IL-2的生物学活性.
试剂 RPMI1640培养液 1640培养 (1) RPMI1640培养液 取RPMI 1640培养 基粉末1 规格为1L) 1L), 基粉末1袋(规格为1L),加水溶解并稀释至 1000ml,加青霉素10 IU和链霉素 和链霉素10 IU, 1000ml,加青霉素105IU和链霉素105 IU, 再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌 再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀, 2.1g 过滤,4℃保存 保存. 过滤,4℃保存. 取新生牛血清(FBS) (2) 基础培养液 取新生牛血清(FBS) 10ml, 1640培养液90ml.4℃保存 培养液90ml 保存. 10ml,加 RPMl 1640培养液90ml.4℃保存. (3)完全培养液 取基础培养液100ml 100ml, (3)完全培养液 取基础培养液100ml, 加重组人自介素- 至终浓度400 800IU. 400～ 加重组人自介素-2至终浓度400～800IU. 4℃保存 保存. 4℃保存.
检测酶的活性的方法
检测酶的活性的方法酶活性是指酶分子在特定条件下催化底物转化的速率。
酶活性的研究对于深入理解生化过程、疾病发生机制以及药物开发具有重要意义。
本文将介绍酶活性检测的一些常用方法。
1. p-Nitrophenyl Phosphate（pNPP）法：pNPP法是一种常用的颜色反应法，适用于检测酸性和碱性磷酸酶以及碱性酮糖酸酶的活性。
该方法的原理是将酶催化底物pNPP水解为p-nitrophenol（黄色）和磷酸，利用p-nitrophenol的比色特性（pH 10时吸光度λ=405 nm），通过检测吸光度的变化来间接测定酶活性。
2. 毛细管电泳法：毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis, CE）是利用酶对底物的催化作用导致电泳迁移率发生变化的原理来检测酶活性。
该方法具有高灵敏度、高分辨率、快速分析等优点。
一般通过分离、富集和检测等步骤来实现。
3. 酶标记法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）：ELISA是一种常用的酶标记技术，适用于定量检测酶活性。
该方法的原理是利用酶标记的抗体与底物结合后，通过酶对底物的催化作用产生信号。
常用的酶标记有辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶等。
4. 荧光检测法：荧光检测法是利用酶对底物的催化作用改变溶液中荧光分子的性质来实现酶活性的检测。
其中，常用的荧光标记物有荧光素（Fluorescein）、羧酮荧光素（Tetramethylrhodamine, TAMRA）等。
通过测量荧光的强度和寿命来反映酶活性。
5. 放射性同位素法：放射性同位素法是一种高灵敏度的检测方法，利用酶对标记同位素底物的催化作用来测定酶活性。
常用的标记同位素有^14C、^32P、^3H等。
通过测定样品中放射性荧光的强度来反映酶活性。
以上仅介绍了一小部分常用的酶活性检测方法，每种方法都有其特点和适用范围。
生物碱的活性应用实验原理
生物碱的活性应用实验原理1. 简介生物碱是一类具有特定生物活性的有机化合物，广泛存在于植物、昆虫、动物等生物体中。
它们具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、镇痛等多种活性，因此在药物研究和应用中具有重要价值。
本文将介绍生物碱活性应用的实验原理。
2. 实验原理生物碱活性的实验原理主要包括以下几个方面：2.1 活性测试方法评估生物碱的活性是生物碱研究的核心内容之一。
常用的生物碱活性测试方法包括抑菌实验、MTT法、细胞周期分析、凋亡检测、细胞迁移与侵袭实验等。
这些方法可以全面评估生物碱对生物体的影响，有助于研究生物碱的药理学特性。
2.2 活性机制研究了解生物碱的活性机制对于药物研究和应用具有重要意义。
常用的生物碱活性机制研究方法包括酶抑制实验、RNA干扰、Western blot等。
通过这些方法，可以深入了解生物碱与目标分子的相互作用方式，揭示生物碱活性的作用机制。
2.3 可视化检测方法为了更直观地观察生物碱的活性，研究者通常会采用可视化检测方法。
例如，荧光显微镜观察细胞内荧光信号的变化，荧光染料标记细胞膜，形成荧光影像，或者利用蛋白质表达系统在细胞表面表达荧光蛋白，通过观察荧光变化来评估生物碱的活性。
2.4 结构-活性关系研究生物碱的结构与活性之间存在较为密切的关系。
研究生物碱结构-活性关系可以为寻找更有效的生物碱提供指导。
常见的结构-活性关系研究方法包括结构修饰合成与活性评价、分子对接模拟等。
通过这些方法，可以预测生物碱的活性，并设计出更具活性的衍生物。
3. 结论生物碱的活性应用实验原理涉及活性测试方法、活性机制研究、可视化检测方法以及结构-活性关系研究。
深入研究这些原理有助于揭示生物碱的药理学特性、活性机制以及寻找更有效的生物碱药物。
通过实验原理的应用，我们可以更好地理解和利用生物碱的活性。
生物碱类化合物的分离与活性成分鉴定
生物碱类化合物的分离与活性成分鉴定生物碱类化合物是一类含有氮杂环化合物的天然产物，常见于植物、动物和微生物中。
这种化合物具有多种生物活性，如抗癌、镇痛、抗炎、神经调节、抗菌等。
因此，生物碱类化合物的分离和活性成分的鉴定是极其重要的。
本文将介绍分离和鉴定生物碱类化合物的方法和技术。
一、生物碱类化合物的分离生物碱类化合物的分离通常需要采用复杂的技术，包括取样、提取、分离、纯化等步骤。
1. 取样取样是生物碱类化合物分离的第一步。
在进行取样前，需要对样品进行分类、筛选，以确保获得优质的样品。
对于不同来源的样品，需要使用不同的取样方法。
2. 提取提取是从样品中提取化合物的过程。
提取一般采用一种或多种提取剂，如水、有机溶剂、超临界流体等。
提取剂的选择应根据样品的物理化学特性和所需化合物的特点进行优化。
3. 分离分离是将提取得到的混合液按照性质分离得到目标化合物的过程。
常见的分离方法包括薄层色谱、柱层色谱、高效液相色谱、气相色谱等。
在分离过程中，需要对分离条件进行优化，以提高纯化效果。
4. 纯化纯化是将目标化合物从含有其他化合物的混合物中分离出来的过程。
纯化方法包括结晶、再结晶、凝胶过滤、透析和高速离心等。
对于高要求的纯化，还需要采用反相和离子交换色谱等技术。
二、活性成分的鉴定活性成分的鉴定是分离出生物碱类化合物后的重要步骤。
鉴定需要先对化合物进行初步的生物活性测试，然后采用多种技术进行鉴定。
1. 生物活性测试生物活性测试是对生物碱类化合物活性的初步评价。
这种测试可以通过标准的体外和体内技术进行。
常见的生物活性测试有MTT法、溶血试验、小鼠模型试验、细胞毒性实验等。
2. 光谱法光谱法是通过化合物吸收或发射光辐射的特性来判断化合物结构的方法。
常用的光谱包括红外光谱、质谱、紫外光谱等。
这些光谱可以提供化合物的分子式、分子量、官能团等信息，从而辅助鉴定化合物的结构。
3. 色谱法色谱法包括气相色谱和液相色谱。
它们可以分离不同类别化合物，并根据它们的保留时间来确定化合物的相对分子质量和结构。
几种常用生物活性测试方法简介
铕穴状化合物的激发和发射光谱
J. Phys. Chem. C, 2008. 17, 112.
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET)
Donor
Excitation⇒E mission λ (nm)
Acceptor
Excitation⇒E mission λ (nm)
Journal of Molecular Recognition.2008, 21, 289.
Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
ITC独特之处： ➢ 样品用量小，方法灵敏度和精确度高。最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最
小用量0.4ug，滴定池体积1.43 ml ➢ 实验时间较短。典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间。 ➢ 操作简单。整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注
(如酶活力（Kcat）、酶促反应米氏常数(Km)) 。
可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、 酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋 白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞 相互作用等方面。
用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显 色，进行定性或定量测定。
15~40℃
2~80℃
溶剂
非强有机溶剂
无限制
耗材
芯片
试剂
药物筛选
适用
不适用
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) FRET原理
活性氧的检测方法
活性氧的检测方法活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），是指一类高度活泼的氧化剂，包括超氧阴离子自由基（O2·-）,过氧自由基（·O2-）,氢过氧化物（H2O2）和羟基自由基（·OH）等。
活性氧在生物体内产生具有重要的生物学功能，但过量的活性氧会导致细胞氧化应激和氧化损伤，甚至引发多种疾病。
因此，准确、灵敏地检测活性氧的水平对于生物医学研究和临床诊断具有重要意义。
本文旨在介绍一些常用的活性氧检测方法，包括化学发光法、流式细胞术、蛋白质标记法以及分子探针法。
1. 化学发光法化学发光法是一种常用的检测活性氧的方法，其原理是通过检测化学反应所产生的荧光信号来间接测定活性氧的含量。
其中，氧化荧光素（DHE）和二苯基五氮唑（DPI）是两种常用的探针物质。
通过与细胞或组织中的活性氧反应，这些探针物质会发生化学变化，产生荧光信号，从而可以间接测量活性氧的水平。
2. 流式细胞术流式细胞术是一种高通量、高灵敏度的活性氧检测方法。
通过将细胞与特定的探针（如二苯基五氮唑、二氧化碳和二溴苯蓝）共孵育，然后使用流式细胞仪对细胞进行检测和分析。
这种方法可以实时监测细胞中活性氧的动态变化，并且可以定量分析不同细胞群体中活性氧的水平。
3. 蛋白质标记法蛋白质标记法是一种利用免疫学原理检测活性氧的方法。
通过特异性抗体与活性氧产生的蛋白质分子进行结合，然后通过荧光或酶标记的二抗对抗原-抗体复合物进行检测。
这种方法可以定量检测活性氧在细胞或组织中的定位和分布，从而进一步研究活性氧的生物学效应。
4. 分子探针法分子探针法是一种基于分子探针的活性氧检测方法。
探针分子与活性氧存在特定的反应，通过测量探针与活性氧反应后的荧光强度或吸收光谱变化来定量分析活性氧的含量。
比如，二苯基氨基腙（DPA）和二羟基芳香乙酰胺（DMA）等探针物质被广泛应用于活性氧的检测研究中。
以上介绍了常用的活性氧检测方法，包括化学发光法、流式细胞术、蛋白质标记法以及分子探针法。
生物制药技术实验中的质量控制检测方法
生物制药技术实验中的质量控制检测方法生物制药技术是指利用活细胞、细胞器或其产物进行药物生产的技术。
在生物制药技术实验中，质量控制检测方法是确保生产的药物质量合格的重要环节。
本文将介绍生物制药技术实验中常用的质量控制检测方法。
首先，生物制药技术实验中的质量控制检测方法之一是微生物检测。
微生物检测主要是针对药物生产过程中可能存在的细菌、真菌和酵母等微生物的污染。
常用的微生物检测方法包括菌落计数法、膜过滤法和涂布法等。
菌落计数法通过培养培养基上的微生物，然后计数形成的菌落来定量和定性检测样品中微生物的数量。
膜过滤法通过将样品过滤过滤膜上，然后将膜转移到富营养培养基上培养微生物，最后通过菌落计数法定量和定性检测微生物。
涂布法主要是将适量的样品涂布在富营养培养基上，然后通过菌落计数法进行定量和定性检测。
这些方法可以及时有效地检测出样品中的微生物污染，确保产品的安全性。
其次，生物制药技术实验中的质量控制检测方法之二是生物活性检测。
生物活性检测是评估生物制药产品是否具有所期望的药理活性的重要手段。
常用的生物活性检测方法包括细胞毒性检测、酶活性检测和生物学特性等。
细胞毒性检测主要通过暴露受测物质与细胞相互作用后，观察细胞的存活率、增殖能力以及细胞器和DNA的损伤情况来评估其毒性。
酶活性检测通过测定生物制药产品中酶的催化活性来评估其质量。
生物学特性检测则通过研究生物制药产品的免疫原性、稳定性、溶解度和释放等特性来评估其质量。
这些生物活性检测方法可以客观地评估生物制药产品的质量和药理学特性，提供重要参考信息。
此外，生物制药技术实验中的质量控制检测方法之三是化学成分检测。
化学成分检测主要是通过分析样品中化学物质的成分和含量来评估其质量。
常用的化学成分检测方法包括高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）、核磁共振波谱法（NMR）和红外光谱法（IR）等。
HPLC是常用的制药产品中药物成分含量的检测方法，可以快速准确地分离和定量分析复杂的药物成分。
细胞活性检测方法有哪些？
细胞活性检测方法有哪些？细胞活性是判断体外培养细胞在某些条件下是否能正常生长的重要指标,如药物处理、放射性或紫外线照射、培养条件变化等。
目前常用的方法有很多,如有台盼蓝染色法、克隆(集落)形成法、H放射性同位素掺入法、MTT法等。
本文总结了一些常用的细胞活性检测方法的原理、特点，并对比了各自的优缺点。
一、染色计数法1. 化学染色法染色计数法是细胞培养中检查细胞死活最常用的方法，直接利用死细胞和活细胞对染料的不同亲和力，检查细胞活性，能在光学显微镜下观察到染色结果。
可分为两类：死细胞着色法和活细胞着色法。
使死细胞着色的常用染料有台盼蓝、苯胺黑、伊红Y。
能使活细胞着色的常用染料有结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝等。
其中最常用的是台盼蓝染色法。
细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以鉴别死细胞与活细胞。
通过细胞计数可得出细胞的存活率。
本染色法方便实用，价格低廉，操作简单。
但是台盼蓝染色时，时间不宜过长，否则部分活细胞也会着色，会干扰计数。
而且，细胞没有经过固定，形态不清晰。
2. 荧光染色法一些荧光染料对死细胞和活细胞也有不同的作用效果，利用荧光显微镜检测细胞活性。
如碘化丙啶（PI），被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡细胞的细胞膜，因此活细胞不被染料上色，只有死细胞或凋亡细胞才能被染上红色。
吖啶橙（AO）能透过质膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。
溴乙锭（EB）仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。
也可应用AO-EB 双染法鉴定细胞死活。
这种检测方法相比传统的染料，具有灵敏度高，操作简便，结果容易分辨等特点，而且利用双染法还可以分辨活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、死亡细胞。
在细胞凋亡的检测上有很广泛的应用。
缺点在于，要求特殊的仪器进行检测，如荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜或流式细胞仪。
而且通过荧光染料具有毒性，操作时需要带手套。
几种常用生物活性测试方法简介共37页PPT
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29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
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30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
几种常用生物活性测试方法简介
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26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
பைடு நூலகம்
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27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
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28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
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ITC的用途： 获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数(Ka)、结合位点数(n)、摩 尔结合焓(△H）、摩尔结合熵（ △S）、摩尔恒压热容（ △ Cp），和动力学参数
Eu永久性嵌合穴状口袋（非螯合作用） 耐受性好，对温度，光强，PH，离子 强度变化影响较小。不易受化学物质 干扰，如EDTA，二价离子（Mg2+， Mn2+）等。
Stokes shift >300nm
持续激活后没有光漂白现象,可以多次 读数，从而进行动力学实验。
镧系元素的半衰期大于1毫秒，与普 通荧光纳秒级的半衰期相差6个数量 级。当延迟50微秒读数时，普通荧光 的信号近似于零。检测的发射光中没 有来自于激发波长的干扰。
Journal of Molecular Recognition.2008, 21, 289.
Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
ITC独特之处： ➢ 样品用量小，方法灵敏度和精确度高。最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最
小用量0.4ug，滴定池体积1.43 ml ➢ 实验时间较短。典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间。 ➢ 操作简单。整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注
7 .室温静置反应1h后，测值340/665nm。[(620/670nmCayman]
[BRD4(BD1)TR-FRET Assay Kit 购买自 BPS Bioscience 公司]
enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)
酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 基本原理是先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。 测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体 或抗原发生反应。
用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显 色，进行定性或定量测定。
J. Biomol. Screen. 2015, 7,4.
通过使用供体和受体荧光团标记，
TR-FRET 检测将时间分辨 (TR) 和 荧光共振能量转移 (FRET) 原理的 优势结合到了一起。
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET)
镧 系 元 素 （ 铕 Eu 和 铽 Tb ） 半 衰 期 长 (us-ms) ， 将 Eu 纳入立体笼中， 形成稳固复合体， 笼收集光将能量 转移到Eu上。
Methods In Cell Biology, 2008, 84,79.
Isothermal Titration Calorimetry (ITC) ITC数据图
左图： 横坐标：时间 纵坐标：热功率 峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量。 右图： 横坐标：滴定物与样品溶液的摩尔比 纵坐标：滴定产生的总热量 反应过程的结合等温曲线
surface plasmon resonance , SPR 表面等离子共振（SPR）原理
消逝波：当入射光到达界面时并不是直 接产生反射光，而是先透过光疏介质约 一个波长的深度，再沿界面流动约半
等离子波：当金属受电磁干扰时，金属内部 的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力 的存在，电子不会在引力与斥力的平衡位置 停下而向前运动一段距离，之后电子间存在 的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开 该区域。由此会形成一种整个电子系统的集 体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡 反复进行震荡，并以波的形式表现。
铕穴状化合物的激发和发射光谱
J. Phys. Chem. C, 2008. 17, 112.
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET)
Donor
Excitation⇒E mission λ (nm)
Acceptor
Excitation⇒E mission λ (nm)
J. Phys. Chem. C. 2013,112,6589.
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) General Format For FRET
PD1-PDL1 binding assay J. Biomol. Screen. 2015, 7,4.
动态范围过小：对温度、样品组成、金属薄膜要求高。
分子水平活性测试方法
SPR 与 ITC 功能特性对比
特点
SPR
ITC
固定化
需要
不需要
结果
动力学
动力学和热力学
得到数据
Ka, Kd
Ka,，△H、 △Cp
运行时间
2~10min
30~60min
分子质量
>1000
无限制
样品量
约1mg
最小含量0.4ug
温度
而折射率的变化又与金属表面结合的 分子质量成正比。 ➢ 可通过 SPR 角的变化捕获生物反应过 程中生物分子之间相互作用的特异信 号，对待测物质进行测定直接测量反 应平衡常数 Ka，解离平衡常数 Kd 等。
surface plasmon resonance , SPR
将待测分子键合在生物传感芯片表面，使其形成分子敏感膜， 再将分析物分子溶液 注入，使其以恒定流速流过芯片表面，如果两者通过相互作用而结合，则将引起生 物传感器表面质量的增加， 导致传感器表面折射率的变化，从而引起SPR角的改变。 SPR被广泛应用于分析生物分子如蛋白质-蛋白质、药物-蛋白质、蛋白质-核酸、核 酸-核酸之间的相互作用，所涉及的研究领域包括免疫学、蛋白质组学及药物筛选等。
surface plasmon resonance , SPR
表面等离子共振原理
➢ 光在棱镜与金属膜表面上发生全反射 现象时，会形成消逝波进入到光疏介 质中与介质中存在一定的等离子波相 遇时可能会发生共振。当消逝波与表 面等离子波发生共振时，检测到的反 射光强会大幅度地减弱。
➢ SPR角：反射光完全消失的角。 ➢ SPR角随金属表面折射率变化而变化，
(如酶活力（Kcat）、酶促反应米氏常数(Km)) 。
可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、 酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋 白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞 相互作用等方面。
SPR的缺点：
待测物在金属薄膜表面的固定：由于生物大分子本身理化性质的复杂性，空间 结构的特殊性，偶联结果可能导致偶联物特异作用位点的失活。
分析物在金属薄膜表面的结合：难以区分非特异性结合，若分析物在芯片表面 是非特异性结合， 会给整个实验带来干扰，造成错误的结论。
待测物的分子大小：适用于生物大分子，小分子的质量变化对折射率变化不明 显， 因此会给小分子待测物的检测造成困难。
几种常用生物活性 测试方法简介
CONTENTS
1
分子水平活性测试方法
2
细胞水平活性测试方法
3
总结
Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种 研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量 量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损 伤地同时提供热力学和动力学信息。
基本原理：
Q = △Ho x V x [H.G]
= △Ho x V x
Ka [G] 1+Ka [G]
x [H]o
△Go = -RT ln K a
△Go = △Ho - T△So
注：H 为受体（主体），G为配体（客体），Ka为结合常数 △Go为Gibbs自由能变化，△Ho 为焓变，△So 为熵变
Isothermal Titration Calorimetry (ITC) ITC仪结构示意图
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) BDR4相关化合物TR-FRET活性测试方法
1.根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer分别将成分Eu-labeled donor 和 dye-labeled acceptor (带straptavidin标记） 100倍稀释； 2.向384孔板中，每孔加入稀释好的Eu-labeled donor 和dye-labeled acceptor 各2.5ul； 3. 向 每 孔 中 加 入 一 定 量 的 化 合 物 ， 阳 性 对 照 组 加 入 对 应 体 积 的 DMSO ； 振 荡 反 应 1min； 4 .根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer将组分BET Bromodomain 40倍稀释。 分别向化合物检测组和阳性对照组加入稀释好的BET Bromodomain 2.5ul每孔； 5.根据需要，使用1X BRD TR-FRET Assay Buffer将组分acetylated Ligand1（带Biotin 标记） 40倍稀释。向阴性对照组加入稀释好的BET Bromodomain 2.5ul每孔； 6. 每孔加入一定量的BRD4 bromodomain ，保证每个反应体系中含有4.5ng含量的酶。
ITC是一种热量连续变化的量热器。主 要由隔热夹套包裹着的样品池(反应池) 和参比池、注射器和一台计算机组成， 注射器同时具有搅拌作用，计算机控 制温度控制装置和信息反馈系统。